Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Топология взаимодействия рецептора DAF с вирусами ЕСНО и Коксаки 10
1.2. Топология взаимодействия энтеровирусов с каньон-связывающими рецепторами и модели депротеинизации энтеровирусов 14
1.3. Молекулы, обеспечивающие адсорбцию вирусов ЕСНО на поверхности чувствительных клеток 17
1.4. Механизмы эндоцитоза вирусов ЕСНО 22
1.5. Исследование топологии вирус-рецепторных взаимодействий с помощью анализа генетических полиморфизмов вирусов ЕСНО 25
Глава 2. Материалы и методы 28
2.1. Перевиваемые клеточные культуры 28
2.2. Вирусы 28
2.3. Моноклональные антитела 29
2.4. Постановка реакции бляшкообразования и клонирование вируса 30
2.5. Оценка инфекционной активности вируссодержащих жидкостей 31
2.6. Оценка гемагглютинирующей активности вируса 32
2.7. Адсорбция вируса на эритроцитах человека 32
2.8. Ингибирование репродукции вирусов моноклональными антителами 33
2.9. Секвенирование структурной части генома клонированных вариантов EV11 34
2.10. Непрямая иммунофлуоресцентная микроскопия 36
Глава 3. Миссенс-мутации в структурной части генома EV11, возникающие при адаптации к различным перевиваемым клеточным культурам 38
Глава 4. Получение близкородственных daf+ и daf– клонов EV11
в культуре клеток RD 45
Глава 5. Протективный эффект моноклональных антител к клеточным рецепторам при инфицировании клеток RD близкородственными daf+ и daf– клонами EV11 53
Глава 6. Роль фенотипического смешивания в формировании структуры популяции клонированного EV11 в отношении аффинитета к рецептору DAF 60
Глава 7. Обсуждение 67
Выводы и рекомендации 77
Литература 80
- Топология взаимодействия энтеровирусов с каньон-связывающими рецепторами и модели депротеинизации энтеровирусов
- Механизмы эндоцитоза вирусов ЕСНО
- Оценка инфекционной активности вируссодержащих жидкостей
- Ингибирование репродукции вирусов моноклональными антителами
Введение к работе
Актуальность проблемы
Специфичность взаимодействия вирусов с рецепторами чувствительных
клеток является ключевой детерминантой тканевого тропизма, выполняющей
триггерную функцию в отношении всех последующих этапов вирусного
инфекционного цикла. [Baranowski Е. et al, 2001; Evans D.J. et al, 1998; Lentz T.L.
et al, 1988; Rossmann M.G. et al., 2002]. Следовательно, идентификация таких
рецепторов и изучение особенностей их взаимодействия с вирусами является
одной из важнейших задач фундаментальной вирусологии, от решения которой, в
частности, зависят перспективы целенаправленного создания
высокоэффективных противовирусных средств.
Клинические проявления инфекции, вызванной неполиомиелитными энтеровирусами, характеризуются широким спектром, включающим лихорадочное заболевание, конъюнктивит, инфекции верхних и нижних дыхательных путей, гастроэнтерит, менингит, энцефалит, энцефаломиелит и др. [Pallansch М.А. et al, 2001; Rotbart Н.А. et al., 2000; Ворошилова М.К. 1979;].. Это подразумевает способность энтеровирусов к репродукции в различных тканях и органах за счт использования различных клеточных рецепторов для инфицирования клеток.
Изучению топологии молекулярных взаимодействий неполиомиелитных энтеровирусов с клеточными рецепторами методом структурно-функционального анализа однонуклеотидных генетических полиморфизмов посвящено относительно небольшое количество работ, однако, это направление интенсивно развивается [Carson S.D. et al, 2011; Gullberg M. et al, 2010; Pan J. et al, 2011].
В результате ранее проведнных исследований с использованием первичной культуры фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ) было показано, что способность вируса ЕСНО11 (EV11) к связыванию с рецептором DAF (CD55) является вариабельным генетическим признаком, а в популяциях гемагглютинирующих штаммов и клонов, имеющих Daf+ фенотип, частота негемагглютинирующих (daf-) мутантов составляет 3хЮ"5 [Sergeev A.G. et al,
1994]. Математическая модель накопления daf– мутантов в популяции daf+ клона
EV11 при репродукции в культуре клеток ФЭЧ [Novoselov A.V. et al., 2004], с
помощью численных экспериментов позволила обосновать предположение о том,
что утрата вирусом сродства к рецептору DAF может быть обусловлена
единичной миссенс-мутацией. Данное предположение было экспериментально
подтверждено методом секвенирования структурной части генома
близкородственных daf+ и daf– клонов EV11, полученных в первичной культуре ФЭЧ [Резайкин А.В. и др., 2009; Rezaikin A.V. et al., 2009]. У четырех клонированных daf– вариантов, выделенных из популяции гемагглютинирующих штаммов EV11 (прототипного штамма Gregory и клинического изолята 7611), было выявлено по одной миссенс-мутации, приводившей к аминокислотной замене в белке VP2 (S135G, S145N, G162E или T165M).
В настоящей работе продолжен анализ генетических полиморфизмов близкородственных клонов EV11 с целью выяснения топологии вирусного антирецептора, обеспечивающего взаимодействие EV11 с альтернативными по отношению к DAF неидентифицированными клеточными рецепторами, присутствующими в различных культурах клеток, а также использованы моноклональные антитела, позволяющие исследовать функциональную роль отдельных молекул на поверхности клеток при взаимодействии со структурно измененными белками капсида EV11 на ранних этапах инфекционного цикла.
Цель исследования
Установление взаимосвязей генетических полиморфизмов в структурной части генома с изменением рецепторной специфичности EV11.
Задачи работы:
1. Картировать миссенс-мутации в структурной части генома EV11, выявляемые при адаптации к различным перевиваемым клеточным культурам, и провести анализ взаимосвязи структурных и функциональных изменений.
-
Разработать экспериментальную модель для изучения рецепторной специфичности EV11 в культуре клеток рабдомиосаркомы человека (RD) с использованием близкородственных daf+ и daf– клонов вируса, капсидные белки которых отличаются единственной аминокислотной заменой, и моноклональных антител (мАТ), блокирующих клеточные рецепторы.
-
Изучить протективный эффект мАТ, взаимодействующих с клеточными рецепторами DAF, HLA класса I (HLA-I) и 2-микроглобулином (2m) при инфицировании клеток RD модельными клонами EV11.
-
Исследовать влияние эффекта фенотипического смешивания на формирование структуры популяции клонированного EV11 в отношении аффинности к рецептору DAF.
Научная новизна работы
Впервые показано наличие двух пространственно разграниченных кластеров аминокислотных замен в капсидных белках клонированных вариантов ЕV11, ассоциированных с адаптацией к различным клеточным культурам. Первый кластер локализован вблизи оси симметрии 2-го порядка и ассоциирован с вариабельностью аффинности вируса к клеточному рецептору DAF. Второй кластер расположен в области северной стены каньона вблизи оси симметрии 5-го порядка и связан с адаптацией вируса к неидентифицированному клеточному рецептору, используемому независимо от DAF.
Доказано, что в культуре клеток RD экспрессия DAF-зависимого фенотипа ЕV11 контролируется одиночным нуклеотидным полиморфизмом: миссенс-мутацией в позиции 493 участка генома, кодирующего белок VP2.
Показано, что различие первичных рецепторов, используемых
близкородственными daf+ и daf– клонами EV11, не влияет на выраженность протективного эффекта мАТ к 2m в культуре клеток RD.
Впервые доказано, что при репродукции DAF-зависимого клона ЕV11 на культуре клеток RD, в популяции вирусного потомства присутствует минорная фракция инфекционных вирионов (приблизительно 0,1%), несущих daf+ геном,
но имеющих Daf– фенотип. Таким образом, было показано присутствие химерных вирионов, являющихся результатом фенотипического смешивания.
Теоретическая и практическая значимость работы
Проведенные исследования имеют фундаментальный характер. Полученные
результаты дополняют представления о молекулярной топологии вирусных
антирецепторов (сайтов связывания с клеточными рецепторами) на поверхности
DAF-зависимых вариантов EV11 и вариантов, не взаимодействующих с
рецептором DAF. Обнаружение биологически значимого кластера
аминокислотных замен в области оси симметрии 5-го порядка указывает на важную для интернализации и (или) депротеинизации функциональную роль неидентифицированного клеточного рецептора, взаимодействующего с вирионом EV11 в области каньона.
В структуре популяций клонированных daf+ вариантов EV11 выявляется минорная субпопуляция химерных вирионов, имеющих Daf– фенотип и несущих daf+ геном, которая приводит к своеобразной маскировке рецепторной специфичности. Ненаследуемое изменение рецепторной специфичности в отношении рецептора DAF может вносить определенный вклад в преодоление тканевых барьеров в патогенезе энтеровирусной инфекции.
В связи с интенсивным развитием методов полногеномного
секвенирования, практическое значение может иметь использованная в
диссертации концепция установления взаимосвязи между одиночными
нуклеотидными полиморфизмами (миссенс-мутациями) и изменением
контролируемого в эксперименте биологического признака. В сочетании с
картированием аминокислотных замен в трехмерной структурной модели
вириона, данная концепция позволяет однозначно интерпретировать
биологическую роль однонуклеотидных полиморфизмов, формирующих
пространственно разграниченные кластеры аминокислотных замен в наборах спонтанных мутантов.
Положения, выносимые на защиту:
-
Аминокислотные замены в капсидных белках клонированных вариантов ЕV11, ассоциированные с адаптацией к различным клеточным культурам, группируются в два пространственно разграниченных кластера. Первый кластер локализован вблизи оси симметрии 2-го порядка и ассоциирован с вариабельностью аффинности вируса к клеточному рецептору DAF. Второй кластер расположен в области северной стены каньона вблизи оси симметрии 5-го порядка и связан с адаптацией вируса к неидентифицированному клеточному рецептору, используемому независимо от DAF.
-
Экспрессия DAF-зависимого фенотипа ЕV11, использующего DAF в качестве первичного клеточного рецептора, при репродукции в культуре клеток RD контролируется одиночным нуклеотидным полиморфизмом в позиции 493 гена VP2, приводящим к аминокислотной замене в позиции 165 капсидного белка VP2.
-
Различие первичных рецепторов, используемых близкородственными daf+ и daf– клонами EV11, не влияет на выраженность протективного эффекта мАТ к 2m в культуре клеток RD.
-
В популяции вирусного потомства DAF-зависимого клона ЕV11 на культуре клеток RD, выявляется минорная фракция инфекционных вирионов (приблизительно 0,1%), несущих daf+ геном, но имеющих Daf– фенотип, то есть наблюдается феномен фенотипического смешивания.
Внедрение результатов исследования и апробация работы
Полученные в результате выполнения работы нуклеотидные
последовательности структурной части генома 10-ти клонов EV11 депонированы в международном банке генетической информации GenBank NCBI под номерами EU518467, EU518468, EU518469, EU518470, JF925112, JF925113, JF925114, JF925115, JF925116, JF925117.
Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения РФ.
Основные результаты работы представлены и обсуждены на 60-й, 61-й, 62-й
и 63-й межвузовских научно-практических конференциях молодых ученых и
студентов с международным участием "Актуальные вопросы современной
медицинской науки и здравоохранения" (г. Екатеринбург, 2005, 2006, 2007, 2008
гг.); второй и третьей окружных научно-практических конференциях
"Актуальные аспекты вирусных инфекций в современный период
(эпидемиология, клиника, диагностика, профилактика и лечение)" (Екатеринбург, 2008, 2009 гг.); четвертой окружной научно-практической конференции "Актуальные вопросы вирусных инфекций" (Екатеринбург, 2010 г.); научной конференции с международным участием "Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней" (Иркутск, 2010 г.); X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации" (Москва, 2012).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки России и 2 публикации в ведущих рецензируемых зарубежных изданиях.
Структура и объем диссертации
Топология взаимодействия энтеровирусов с каньон-связывающими рецепторами и модели депротеинизации энтеровирусов
DAF (Decay Accelerating Factor, CD55) является первичным клеточным рецептором для гемагглютинирующих (ГА) вариантов EV11 [29, 31, 140, 141], хорошо изученным на молекулярном уровне [76, 86, 94].
По химической структуре DAF представляет собой гликозилфосфатидилинозитол-заякоренный (GPI-заякоренный) гликопротеин с молекулярной массой 70 кД. Показано, что вирусы ЕСНО 3, 6, 6 , 7, 11, 12, 13, 19, 21, 24, 25, 29, 30 и 33 серотипов специфически взаимодействуют с рецептором DAF на эритроцитах человека in vitro, вызывая феномен гемагглютинации [61, 110, 120, 122].
Первая попытка картирования сайта связывания с DAF на поверхности вириона EV11 была предпринята в работе Stuart et al. [141]. Сравнив ряд близкородственных ГА и негемагглютинирующих вариантов EV11, отличавшихся в общей сложности по 8 аминокислотным позициям в структурной части генома, авторы предположили, что DAF взаимодействует с поверхностью вириона вблизи осей симметрии 5-го порядка. Однако, анализ комплексов вируса ECHO 12 с рецептором DAF, полученных методом криоэлектронной микроскопии с трёхмерной реконструкцией изображений, позволил установить, что SCR3 домен DAF связывается с гипервариабельным поверхностным участком вируса ECHO 12 в области оси симметрии 2-го порядка [34, 118].
Ранее были селекционированы и секвенированы близкородственные клоны EV11, отличавшиеся по способности взаимодействовать с рецептором DAF в результате единичных аминокислотных замен в капсидном белке VP2 [15, 16, 21, 126]. Выявленные единичные аминокислотные замены в каждой паре сравниваемых клонов обеспечили однозначность интерпретации структурно-функциональной связи замен аминокислот с изменением сродства EV11 к рецептору DAF при репродукции в культуре клеток ФЭЧ. В совокупности выявленные аминокислотные замены, изменявшие аффинитет EV11 к DAF, образовывали кластер в одном поверхностном домене капсидного белка VP2 (в петле EF), что позволило впервые картировать сайт связывания c рецептором DAF на поверхности вирионов EV11 в области оси симметрии 2-го порядка [15, 16, 21, 126]. He et al. [70] методом криоэлектронной микроскопии с разрешением 16 ангстрем были получены трехмерные реконструкции изображений комплекса EV7 с рецептором DAF, на основе которых сначала был сделан вывод о том, что DAF расположен на поверхности вириона поперек оси симметрии 2-го порядка. В этой работе компьютерное моделирование проводилось с использованием данных рентгеноструктурного анализа для гомологичных участков вируса Коксаки В3 по причине отсутствия соответствующих данных для EV7. В дальнейшем той же группой исследователей [119] была выполнена криоэлектронная микроскопия комплекса «вирус-рецептор» с улучшенным разрешением 7,2 ангстрем, а компьютерное моделирование проведено на основе данных рентгеноструктурного анализа EV7 с разрешением 3,1 ангстрем. В итоге, было показано, что молекулы DAF располагаются на поверхности вириона EV7 вблизи осей симметрии 2-го порядка, но не пересекают их, что противоречило ранее опубликованным данным [70], но согласовывалось с экспериментально полученными Pettigrew et al. [118] результатами для комплекса DAF с EV12 и с теоретически предсказанными результатами для взаимодействия EV7 с DAF. Таким образом, экспериментальные данные, полученные методом криоэлектронной микроскопии с реконструкцией трехмерного комплекса DAF как с EV7, так и с EV12, продемонстрировали высокую степень структурного сходства, несмотря на неидентичность вирусов.
Вместе с тем, данные, полученные методами сайт-направленного мутагенеза двухдоменного фрагмента SCR3-SCR4 растворимой формы DAF (sDAF) [153], сравнения выравненных аминокислотных последовательностей человеческого DAF с последовательностями DAF обезьян, изучения адсорбции и инфекционной активности некоторых ГА вирусов ЕСНО на культурах клеток обезьян, экспрессирующих DAF [151], позволили сделать вывод о различной локализации сайтов взаимодействия с эховирусами на поверхности DAF. В частности, аминокислотные остатки домена SCR3, взаимодействующие с EV7 и EV12, расположены с противоположных сторон стержнеобразной молекулы DAF [153]. Таким образом, несмотря на внешнее сходство комплексов вируса EV7 и EV12 с рецептором DAF, выявленное методом криоэлектронной микроскопии, взаимодействие рецептора с этими вирусами предусматривает поворот стержнеобразной молекулы DAF вокруг продольной оси.
Результаты сайт-направленного мутагенеза DAF позволили установить, что локализация сайта связывания с EV11 на поверхности DAF отличается от локализации сайтов связывания с EV7 и EV12 [153]. Аминокислотные полиморфизмы (K125A/K126A/K127A) в домене SCR3, картированные на стыке доменов SCR2 и SCR3, избирательно снижали аффинность EV11 к мутантному рецептору DAF, не влияя на аффинность мутантного DAF к EV7 и EV12. Lukacik et al. [94] было выполнено компьютерное моделирование комплекса полноразмерной молекулы DAF с ключевым компонентом альтернативного пути активации комплемента – прототипным доменом типа А фактора фон Виллебранда (vWF-A) в составе фактора B системы комплемента человека. В этой работе было показано, что DAF взаимодействует с vWF-A на стыке доменов SCR2 и SCR3, то есть в том же месте, где были картированы аминокислоты, участвующие в связывании DAF с EV11.
Топология взаимодействия DAF с вирусом Коксаки B3 существенно отличается от рассмотренной выше для вирусов ЕСНО. Hafenstein et al. [65] была выполнена криоэлектронная микроскопия и реконструкция комплекса sDAF и ГА варианта вируса Коксаки В3 (CVB3-RD), адаптированного к культуре клеток RD, с разрешением 14 ангстрем. Было показано, что на поверхности вириона CVB3-RD домены sDAF располагаются следующим образом: домен SCR4 начинается в области оси симметрии 3-го порядка, далее молекула sDAF проходит вдоль южного края каньона и перекрывает каньон доменами SCR3 и SCR2, переходя на соседний протомер, где заканчивается доменом SCR1 вблизи оси симметрии 5-го порядка. Согласно уточненной модели, выполненной Yoder et al. [160] с более высоким разрешением (2,74 ангстрем для вириона и 9 ангстрем для комплекса вируса с sDAF), вирион CVB3-RD имеет два сайта связывания с DAF – в области доменов SCR2 и SCR3, причем площадь контакта вириона с SCR2 доменом DAF составляет 75%, а с SCR3 доменом – менее 25%. Поскольку DAF перекрывает область каньона, постольку избыточные концентрации растворимого рецептора DAF (sDAF) способны блокировать адсорбцию CVB3-RD на химерных клетках хомяка CHO, экспрессирующих DAF человека [160].
Механизмы эндоцитоза вирусов ЕСНО
Механизмы проникновения энтеровирусов в цитоплазму восприимчивых клеток могут существенно различаться в зависимости от наличия или отсутствия соответствующего рецептора на поверхности клетки и сайта связывания с рецептором (антирецептора) на поверхности вириона. Поскольку вирионы энтеровирусов не имеют суперкапсида, постольку они не могут использовать слияние суперкапсида с плазматической мембраной для проникновения в цитоплазму восприимчивых клеток. Следовательно, энтеровирусы могут использовать рецептор-опосредованные механизмы конститутивного и индуцированного эндоцитоза, обеспечивающие интернализацию вирус рецепторного комплекса в составе эндосом [96, 104, 132]. Следующим этапом вирусного инфекционного цикла является депротеинизация, результатом которой, в случае нахождения энтеровируса в эндосоме, должен быть выход РНК позитивной полярности из вириона в цитозоль (для первичной трансляции) через мембрану эндосомы.
Среди конститутивных механизмов эндоцитоза, используемых вирусами ECHO, наиболее изучены клатрин-зависимый эндоцитоз и клатрин-независимый Arf6-опосредованный эндоцитоз. Так, Leveque et al. [91] с помощью экспрессии доминантно-негативного мутантного белка Eps15 в культурах клеток Dev и A549 было установлено, что эндоцитоз Daf– варианта ЕV6 являлся клатрин-зависимым, а эндоцитоз Daf+ варианта EV6 являлся клатрин-независимым.
Stuart et al. [140] с помощью нистатина и других фармакологических ингибиторов было показано, что Daf+ штамм EV11-207 использовал клатрин-независимый эндоцитоз для проникновения в клетки RD, в отличие от daf– клона EV11-207R, использовавшего другой путь эндоцитоза. В культуре клеток RD хлорпромазин ингибировал репродукцию Daf+ штамма EV11-207 только на 50% при множественности заражения (MOI) равной 10, а также ингибировал репродукцию daf– клона EV11-207R при MOI 0,1; 1,0 и 10 на 50%. При такой же концентрации хлорпромазина (14 мМ) полностью блокировалось инфицирование клеток RD и НТ29 вирусом гриппа А (штамм PR8), использующим клатрин зависимый эндоцитоз. Поэтому в отношении daf– клона EV11-207R высказана лишь гипотеза о том, что он использует клатрин-опосредованный путь эндоцитоза, однако низкая эффективность ингибирования хлорпромазином предполагает доступность и других путей эндоцитоза для данного вируса. Stuart et al. [140] было показано, что обработка клеток RD нокодазолом не препятствовала интернализации Daf+ штамма EV11-207, но, вследствие нарушения внутриклеточного транспорта эндосом, вирус оказывался заблокирован в везикулах, рассеянных вокруг клеточного ядра. В то же время, репродукция daf– клона EV11-207R была нечувствительна к нокодазолу, что позволило авторам предположить необходимость последовательного перемещения вирионов Daf+ штамма EV11-207 в другой внутриклеточный компартмент для депротеинизации.
В результате исследований клатрин-независимого эндоцитоза в клетках HeLa [55, 107, 108] было установлено, что молекулы HLA-I, DAF и CD59 сразу после интернализации обнаруживались в Arf6-ассоциированных эндосомах, несущих маркер ADP-ribosylation factor 6 (Arf6). На следующем этапе происходило слияние Arf6-эндосом с классическими ранними эндосомами, которые образуются в результате клатрин-зависимого эндоцитоза и несут маркеры EEA1 и Rab5.
Если в культуре клеток RD конвергенция клатрин-независимого и клатрин-зависимого путей эндоцитоза происходит аналогичным образом, то можно предположить, что нокодазол блокировал слияние Arf6-эндосом и ранних эндосом, поэтому Daf+ штамм EV11-207 оказывался заблокирован в аналоге Arf6-эндосом в клетках RD, а депротеинизация как Daf+, так и Daf– вариантов EV11 могла бы происходить в классических ранних эндосомах, несущих маркеры EEA1 и Rab5.
Marchant et al. [95] было установлено, что вирус Коксаки В3, после взаимодействия с рецептором DAF в культуре клеток HeLa, направлялся в непродуктивные компартменты в результате Агґб-зависимой интернализации. Следовательно, селекцию Daf- вариантов в культуре клеток HeLa можно связать с неэффективной интернализацией и (или) замедленной депротеинизацией Daf+ вариантов. Данное предположение согласуется с ранее наблюдавшейся более низкой скоростью интернализации фотосенсибилизированных Daf+ вариантов EV11 при адаптации с культуры клеток RD к культуре клеток Л-41 КД/84, по сравнению с более высокой скоростью интернализации уже адаптированных к культуре клеток Л-41 КД/84 Daf- вариантов EV11 [21].
В отличие от рассмотренных выше экспериментальных моделей, в которых Daf+ варианты вирусов ЕСНО использовали клатрин-независимый (Arf6-опосредованный) эндоцитоз, а Daf- варианты - клатрин-зависимый эндоцитоз, DAF-зависимый прототипный штамм Wallace вируса ЕСН07 использовал клатрин-зависимый эндоцитоз для проникновения в клетки Сасо-2 [83]. С помощью фармакологических ингибиторов клатрин-зависимого эндоцитоза, коротких интерферирующих РНК и доминантно-негативных мутантных белков, кодируемых плазмидами, было показано, что интернализация EV7 происходит с участием клатрина и динамина. После интернализации, EV7 сначала был локализован в ранних эндосомах, несущих маркер ЕЕА1 и Rab5, а затем - в поздних эндосомах, несущих маркер LAMP-2. Также было обнаружено, что для депротеинизации EV7 не нуждался ни в низких значениях рН, ни в катепсинах [83].
Кроме эндоцитоза, обусловленного конститутивными механизмами рециркуляции цитоплазматических белков, также известен специфический вирус-индуцированный механизм интернализации комплекса EV1 с интегрином ОС2Р1 [82]. В частности, было показано, что кластеризация интегрина (Х2Р1 запускает специфический механизм интернализации, не зависящий от клатрина и кавеолина, а в некоторых типах клеток - и от динамина, но зависящий от транзиторной деполимеризации актина, блокирующийся ингибиторами PI-PLC, PI3K и РКС, а также регулируемый Pak1 и Rac1, который напоминал механизм макропиноцитоза. GPI-заякоренные белки, субъединица В холерного токсина и флотиллин 1 не были ассоциированы с интернализацией EV1 в комплексе с интегрином (Х2Р1. Тем не менее, связывание EV1 с интегрином ОС2Р1 не приводит к депротеинизации и даже способно стабилизировать капсид [105].
Оценка инфекционной активности вируссодержащих жидкостей
DAF является наиболее изученным клеточным рецептором для EV11 и выполняет роль первичного рецептора, обеспечивающего адсорбцию DAF-зависимых вариантов вируса на чувствительных клетках. Известно, что поликлональная анти-DAF сыворотка подавляла адсорбцию Daf+ штамма EV11-207 на культурах клеток HT29 и RD [140, 141]. Тем не менее, в работе Powell et al. [121] было показано, что взаимодействие DAF-зависимого вируса ECHO 7 с растворимым рецептором DAF (sDAF) являлось полностью обратимым и не приводило к образованию 135S А-частиц. Тот факт, что само по себе взаимодействие с рецептором DAF не является достаточным условием для инфицирования клеток, позволил авторам предположить участие не идентифицированного корецептора или вторичного фактора в интернализации и (или) депротеинизации DAF -зависимых эховирусов после взаимодействия с первичным рецептором DAF.
Chevaliez et al, [40], проводившие исследования с прототипным штаммом EV11 (Gregory) и клиническим изолятом (HU-1108/89) показали, что таким корецептором может быть молекула HLA-I. В экспериментах по блокированию репродукции EV11 в клетках RD авторы использовали мАТ В9.12.1, обладающие специфичностью к общему конформационному эпитопу молекул HLA-А, -В и -С; мАТ MCA1115 к человеческому 2т и мАТ BRIC216 к рецептору DAF. Было показано, что репродукция EV11 эффективно подавлялась предварительной инкубацией клеток с мАТ к HLA-I и к р2т. Эти результаты свидетельствовали в пользу участия молекул HLA-I и Ргш в ранних стадиях взаимодействия вируса и клетки. Далее было показано, что антитела к HLA-I, но не к (Згт, препятствуют адсорбции EV11 на клетках RD, в то время как вирус эффективно адсорбировался на клетках Raj і, экспрессирующих HLA-I и дефектных по рецептору DAF. Вопреки ожиданиям авторов исследования, моноклональные антитела к рецептору DAF не блокировали адсорбцию и репродукцию вируса на клетках RD, в то время как вирус эффективно адсорбировался на химерных клетках хомяка, экспрессирующих человеческий DAF (CHO-DAF/А9) и не имеющих HLA-I, причем, обработка этих клеток антителами к DAF эффективно блокировала адсорбцию.
Таким образом, штамм EV11, полученный Chevaliez et al. [40], демонстрировал DAF-независимый Daf+ фенотип и мог в качестве первичного рецептора на клетках RD, наряду с DAF, использовать и молекулы HLA-I.
Учитывая вышеизложенное, вопрос об участии молекул HLA-I в качестве первичного (альтернативного по отношению к DAF) рецептора или в качестве корецептора в репродукции Daf+ и Daf- вариантов EV11 нуждался в дополнительном изучении с использованием клонированных гено- и фенотипически однородных вирусных популяций.
Целью фрагмента работы, изложенного в настоящей главе, было выяснение роли HLA-I, DAF и р2т в репродукции близкородственных DAF-зависимых и не взаимодействующих с DAF (Daf-) вариантов EV11, отличающихся по одной аминокислотной замене в белке VP2.
Оценку ингибирующего эффекта мАТ к DAF (BRIC216), к HLA-I (В9.12.1) и к Ргш (ВВМ.1) в разных концентрациях проводили с последовательными 10-кратными разведениями близкородственных клонов 431-1 (daf+) и 431-6 {daf-) на культуре клеток RD. Состояние клеточного монослоя оценивали с помощью инвертированного микроскопа ежедневно, начиная со 2-го дня после заражения, окончательный учет результатов проводили на 5-е сутки (рисунок 5.1). Для каждого разведения было выполнено не менее 4 реплик. Окончательный, рассчитанный с учетом суммарной аналитической погрешности, инфекционный титр представлен в таблице 5.1. Контроль без мАТ
Отличие инфекционного титра по сравнению с контролем без мАТ является статистически достоверным (р 0,05).
Из представленных в таблице данных видно, что мАТ В9.12.1, взаимодействующие с мономорфной детерминантой молекул HLA-I (HLA-A, -В, -C), не проявили протективного эффекта ни с daf+, ни с daf- клоном EV11 в обеих использованных концентрациях.
Моноклональные антитела BRIC216, взаимодействующие с SCR3 доменом DAF, в использованной концентрации снижали инфекционный титр daf+ клона приблизительно в 100 раз, но не влияли на инфекционный титр daf- клона EV11. Следовательно, daf+ клон 431-1 имел DAF-зависимый фенотип, а репродукция daf- клона 431-6 не зависела от наличия свободного DAF на поверхности клеток.
Использование смеси мАТ BRIC216, блокирующих DAF, и мАТ В9.12.1 не выявило аддитивный эффект антител к рецептору HLA-I.
Анти-р2т мАТ ВВМ.1 с одинаковой эффективностью ингибировали репродукцию как daf+ клона 431-1, так и daf- клона 431-6, снижая инфекционные титры обоих клонов приблизительно в 10 и в 100 раз при использованной концентрации мАТ 10 и 20 мкг/мл, соответственно. Результаты экспериментов по блокированию репродукции близкородственных daf+ и daf клонов EV11 моноклональными антителами
позволили сделать следующие выводы:
1. Моноклональные антитела BRIC216, взаимодействующие с SCR3 доменом DAF, подавляют репродукцию daf+ клона 431-1 и не влияют на инфекционную активность daf- клона 431-6 EV11, что подтвердило DAF-зависимый фенотип клона 431-1 и использование клоном 431-6 альтернативного по отношению к DAF первичного рецептора;
2. Моноклональные антитела ВВМ.1 к человеческому р2т с одинаковой эффективностью ингибируют репродукцию как daf+ клона 431-1, так и daf- клона 431-6;
3. Предварительная обработка клеток RD мАТ В9.12.1, взаимодействующими с мономорфной детерминантой молекул HLA-I (HLA-A, -В, -C), не влияет на инфекционную активность как daf+, так и daf- клонов EV11.
Последний вывод не согласовывался с данными, опубликованными в работе Chevaliez et al. [40], согласно которым мАТ B9.12.1 эффективно блокируют адсорбцию и репродукцию EV11 на клетках RD, что указывало на участие молекулы HLA-I в раннем этапе репродукции использованных авторами штаммов. Одной из причин данного расхождения могла быть низкая функциональная активность использованной в экпериментах серии мАТ B9.12.1. В связи с этим возникла необходимость проверки активности моноклональных антител к HLA I.
Проверку активности мАТ B9.12.1 проводили путем постановки реакции непрямой иммунофлуоресценции для детекции антигенного эпитопа HLA-I на мембране клеток RD по методике, описанной в главе "Материалы и методы". После обработки клеточного монослоя мАТ В9.12.1 в концентрациях 100 и 50 мкг/мл и последующего окрашивания FITC-меченным анти-мышиным иммуноглобулином, наблюдалась специфическая флуоресценция клеток RD, интенсивность которой оценивалась на 3+ и 2+, соответственно (рисунок 5.2 А).
Ингибирование репродукции вирусов моноклональными антителами
К настоящему времени получены данные, позволяющие предположить существование универсального механизма депротеинизации у большинства вирусов ЕСНО и Коксаки А9 с участием молекул HLA-I. Молекулярная масса лиганда (gp44) для моноклональных антител мАТ 143, описанных в работах Mbida et al. [99, 100, 101], соответствует молекулярной массе тяжелой цепи молекул HLA-I. Лиганд для мАТ 143 был выявлен в культурах клеток человека и обезьяны, но не в культурах клеток быка, собаки и кролика. Сопоставимый с мАТ 143 широкий спектр протективной активности в отношении эховирусов был продемонстрирован в культуре клеток RD при использовании анти-2т [150]. Установлено участие молекул HLA-I и собственно 2т в интернализации EV11 и вируса Коксаки А9 [40, 72, 146].
Известно, что панспецифичные моноклональные антитела W6/32 не защищают клетки RD от инфицирования EV11 [40] и EV7 [150]. Антитела W6/32 распознают составной эпитоп, в который входят как аминокислоты 2 домена тяжелой цепи молекул HLA-I, так и N-концевые аминокислоты р2т [81, 87]. Следовательно, отсутствие протективного эффекта мАТ W6/32 может быть обусловлено диссоциацией составного эпитопа в процессе рециркуляции молекул HLA-I. В отличие от панспецифичных мАТ W6/32, анти-р2m одинаково эффективно связываются как со свободным р2m, так и с р2m в составе молекул HLA-I. В настоящей работе не обнаружен протективный эффект панспецифичных мАТ B9.12.1 при инфицировании культуры клеток RD daf+ и daf- клонами EV11. Этот результат не согласуется с данными Chevaliez et al. [40], что, возможно, обусловлено различием вирусных штаммов и пассажной истории использованной линии клеток RD.
У трёх daf- клонов (121, 211, 311), выделенных в культуре клеток Л-41 КД/84, в области С-терминала VP1 по сравнению с исходным клоном 111/RD была обнаружена общая аминокислотная замена K286R. Другая аминокислотная замена N265 S в области С-терминала VP1 наблюдалась при адаптации клона 111/RD к культуре клеток HEp-2. По данным Stuart et al. [141], аминокислотная замена K259E в области С-терминала VP1 наблюдалась после адаптации штамма EV11-207, полученного в культуре клеток НТ29, к культуре клеток Vero. По данным Heikkila et al. [71, 72], мутации RGDdel и RGE в области С-терминала VP1 у родственного эховирусам вируса Коксаки А9 приводили к смене первичного рецептора. Исходная последовательность RGD обеспечивала взаимодействие вируса Коксаки А9 с осурб-интегрином в качестве первичного рецептора на клетках A549, в то время как мутации RGDdel и RGE обеспечивали взаимодействие вируса Коксаки А9 с интегрином осурз в качестве первичного рецептора на клетках RD. Следовательно, мутации, выявленные в С-терминале VP1 EV11, возможно, имеют отношение к взаимодействию с интегринами, экспрессируемыми на поверхности восприимчивых клеток.
Наряду с рецепторами DAF и v интегринами, вирусы ECHO, в частности EV5 [79], так же как вирусы Коксаки А9 [102] и Коксаки В3 [161], могут использовать гепарансульфат в качестве первичного клеточного рецептора. В отношении потенциального многообразия первичных рецепторов, вирусы ЕСНО аналогичны вирусу Коксаки В3, который также способен использовать DAF или гепарансульфат в качестве первичных клеточных рецепторов в условиях ограниченной доступности основного каньон-связывающего рецептора CAR: в частности, на апикальной поверхности поляризованных клеток Caco-2 [42, 43] и на поверхности клеток RD [39].
Несмотря на то, что каньон-связывающий рецептор для эховирусов в настоящее время неизвестен, гипотеза разнообразия первичных рецепторов и универсального механизма депротеинизации с участием молекул HLA-I класса (в частности - 2m) и предполагаемого общего каньон-связывающего рецептора (например, действующего внутриклеточного), может быть применима к энтеровирусам группы В.
Высокая степень изменчивости таких фенотипических признаков энтеровирусов как тканевой / клеточный тропизм и вирулентность, обычно объясняется с позиции высокого потенциала генетической изменчивости РНК-содержащих вирусов [51, 52, 57]. Вместе с тем, у вирусов без оболочки довольно широко распространено явление смешивания геномов и структурных белков внутри клетки при репродукции, приводящее к образованию "химерных" вирионов, фенотипические свойства которых не соответствуют потенциалу упакованного в них генома, т.е. феномен фенотипического смешивания [18].
Для энтеровирусов фенотипическое смешивание было описано между близкородственными вирусами полиомиелита I и II типов [89], и между относительно отдаленными EV7 и вирусом Коксаки А9 [80]. Однако, в доступной литературе не обнаружено данных о возможной роли "химерных" вирионов энтеровирусов, представленных сочетанием РНК, имеющей консенсусную нуклеотидную последовательность мажорной субпопуляции, и капсида, являющегося продуктом трансляции мутантного генома, содержащего значимую для проявления конкретного фенотипа мутацию. При обычных для вирусологических методов исследования размерах популяций, клонированные daf+ варианты ЕV11 как в культуре клеток ФЭЧ [134], так и в культуре клеток RD [21], содержат минорную субпопуляцию, не взаимодействующую с эритроцитами, но проявляющую инфекционную активность. Меньшая часть минорной субпопуляции представлена daf– мутантами, дающими Daf– потомство, однако, преобладающая часть минорной субпопуляции представлена вирионами, у которых Daf– признак не наследуется (фенотипические Daf– варианты).
Одним из возможных объяснений наблюдавшегося явления может быть модификационная (ненаследуемая) изменчивость за счёт внутритиповой транскапсидации. Проведенные ранее расчеты скорости накопления мутантов в клонированной популяции EV11 [10, 112] и имеющиеся данные литературы о скорости накопления внутриклеточного пула РНК у энтеровирусов [13] позволяют с достаточным основанием утверждать, что образование «химерных» вирионов в инфицированной клетке является результатом одновременной трансляции консенсусного и мутантного генома с последующей инкапсидацией daf+ РНК в Daf– капсид в результате дизъюнктивной репродукции. Таким образом, полученные данные могут свидетельствовать в пользу участия в патогенезе энтеровирусной инфекции особой субпопуляции энтеровирусов, образующейся в результате эффекта транскапсидации или "фенотипического смешивания" за счет своеобразной маскировки рецепторной специфичности, позволяющей вирусной субпопуляции с консенсусным геномом преодолевать тканевые барьеры за счет мутантного капсида.
