Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследование особенностей взаимодействия энтеровирусов с клеточными рецепторами имеет фундаментальное значение для понимания молекулярных основ тропизма этих вирусов к определённым видам клеток, а также для объяснения особенностей патогенеза и клинического течения энтеровирусных инфекций.
Многие представители рода Enterovirus (большинство вирусов ECHO и некоторые вирусы Коксаки А) в качестве основного клеточного рецептора используют белок DAF (CD55) [Newcombe N.G. et al., 2004, Powell R.M. et al, 1998, 1999]. Взаимодействие энтеровирусов с эрнтроцитарным рецептором DAF in vitro вызывает феномен гемагглютинации. В то же время, известно, что некоторые штаммы этих вирусов могут использовать независимый от DAF путь проникновения в клетки с помощью альтернативных рецепторов. [Goodfellow I. et al, 2000; Johnson K.M. et al., 1962; Pasch A. et al., 1999; Selinka H.-C. et al, 2002; Stuart A.D. et al., 2002].
Ранее было установлено, что в популяциях
гемагглютинирующих клонов вируса ECHO 11 (признак daf +),
полученных на культуре ФЭЧ, обнаруживаются
негемагглютннирующие мутанты, утратившие сродство к рецептору DAF (признак daf"). Средняя частота daf мутантов в составе daf + клона (3x10~5) соответствовала вероятности возникновения нуклеотидной замены в определенной позиции у РНК-геномных вирусов (10"" - 10~5), что позволяло высказать предположение о точковом характере мутации, приводящей к изменению рецепторной специфичности вируса ECHOl 1 [Sergeev A.G. et al., 1994]. Было показано, что на перевиваемой клеточной культуре Л-41 наблюдалось резкое ограничение инфекционной активности daf + клонов вируса ЕСНОП, полученных на культуре ФЭЧ. В пассажах на клетках Л-41 происходило постепенное снижение ГА активности вируса, сопровождавшееся выравниванием его инфекционной активности на обеих клеточных культурах (ФЭЧ и Л-41) [Новоселов А.В., 1994]. В то же время, оставались неизвестными локализация мутации, обусловливающей изменение рецепторной специфичности вирусов ECHO, а также причины утраты вирусом ГА активности при адаптации к клеткам Л-41
Цель исследования
На модели вируса ЕСНОП выяснить механизм селекции энтеровирусов по признаку рецепторной специфичности при
репродукции в' клеточных культурах и установить молекулярно-генетические основы феномена изменчивости данного признака. Задачи работы:
Картировать мутации, обусловливающие утрату вирусом ЕСН011 аффинности к рецептору DAF.
Оценить характер изменения рецепторной специфичности вируса ECHO 11 при адаптации с перевиваемой культуры RD к культурам Л-41 и НЕр-2.
Выяснить механизм селекции мутантов с измененной рецепторной специфичностью при репродукции вируса ЕСН011 на клеточных культурах Л-41 и НЕр-2.
Сравнить репродуктивную активность daf+ вариантов и daf мутантов в бластных клетках, выделенных из крови больного ОМЛ.
Изучить особенности репродукции вируса ECHO 11 на перевиваемой культуре клеток почки африканской зеленой мартышки BGM.
Научная новизна работы
Обнаружены ранее не описанные мутации, приводящие к утрате аффинности вируса ECHOl 1к рецептору DAF.
Впервые установлено, что позитивная селекция daf ~ мутантов при адаптации daf* клонов вируса ЕСН011 к клеточным культурам Л-41 и НЕр-2 обусловлена низкой скоростью интернализации частиц с daf + фенотипом.
Показано, что рестрикция репродуктивной активности daf варианта вируса ECHO 11 на клетках обезьяны BGM не связана с этапом адсорбции.
Впервые описаны селективные свойства бластных клеток, выделенных из крови больного ОМЛ, в отношении daf + и daf вариантов вируса ECHOl 1.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты исследования дополняют современные
представления об изменчивости рецепторной специфичности энтеровирусов как адаптационном механизме, расширяющем диапазон чувствительных клеток, а также о возможной роли этого феномена в патогенезе энтеровирусных инфекций Данные о чувствительности клеточных культур к вирусу ECHO 11 могут быть использованы для оптимизации методики выделения аффинных к DAF энтеровирусов из клинического материала
Положения, выносимые на защиту:
1) Рецепторная специфичность вируса ECHO 11 является вариабельным признаком: существуют мутантные неаффинные к DAF
варианты данного вируса, использующие для адсорбции на клеточной мембране альтернативные рецепторы.
2) Утрата вирусом ECHO 11 сродства к рецептору DAF
обусловлена единичными аминокислотными заменами в участке белка
VP2, образующем антирецептор.
Адаптация вируса ECHO 11 к клеточным культурам Л-41 и НЕр-2 сопровождается селекцией по признаку реценторной специфичности и накоплением в популяции мутантов, не имеющих сродства к DAF.
Селекция daf~ мутантов на клетках Л-41 и НЕр-2 обусловлена меньшей продолжительностью периода их интернализации по сравнению с исходным daf1 вирусом.
Внедрение результатов исследования и апробация работы
Материалы исследований внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Росздрава.
Основные результаты работы представлены и обсуждены на I конференции иммунологов Урала (г. Екатеринбург, 2001); 57-й, 58-й, 59-й, 60-й, 61-й, 62-й и 63-й межвузовских научно-практических конференциях молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (г. Екатеринбург, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008 гг.); IV межрегиональной научно-практической конференции с международным участием ОГМА (г. Омск, 2003 г.); Межрегиональной научной конференции (г. Томск, 2003 г.); конференции УрО РАН «Вирусы и иммунитет» (г. Екатеринбург, 2003 г.); III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва, 2004 г.), региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы вирусных инфекций в современный период» (г. Екатеринбург, 2007 г.).
По теме исследования опубликованы 18 научных работ, из них 3 в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, главы литературного обзора, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 13 отечественных и 154 зарубежных источника, и приложений. Диссертация имеет объем 132 страницы, иллюстрирована 17 таблицами и 14 рисунками.
