Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1.1 Краткая историческая справка 9
1.2 Классификационное положение ВБИ 11
1.3 Особенности строения и жизненного цикла ретровируса 12
1.4 Морфология и физико-химические свойства ВБИ 24
1.5 Организация генома и репликация ВБИ 26
1.6 Структурные белки ВБИ 28
1.7 Культивирование ВБИ 29
1.8 Выявление ВБИ полимеразной цепной реакцией 30
1.9 Эпизоотология ВБИ 32
1.10 Клинические симптомы и патогенез ВБИ - инфекции 34
1.11 Пути передачи ВБИ 36
1.12 Антигенная активность ВБИ 36
Заключение 37
Собственные исследования 39
2 Материалы и методы 39
2.1 Образцы цельной крови КРС 39
2.2 Образцы мышечной ткани КРС 40
2.3 Плазмида 40
2.4 Получение первичной культуры клеток (FBL) 41
2.5 Забор цельной крови КРС и выделение ДНК 42
2.6 Подбор праймеров к геному провируса ВБИ 47
2.7 Постановка ПЦР 49
2.8 Регистрация результатов ПЦР 51
2.9 Секвенирование продуктов ПЦР 52
Результаты исследований 53
1 Подбор ДНК-мишени и конструирование праймеров для идентификации ДНК ВБИ методом ПЦР 53
2 Сравнительный анализ методов выделения ДНК из цельной крови КРС 55
3 Оптимизация процесса амплификации 56
4 Получение инфекционного вируса иммунодефицита КРС 59
5 Апробация чувствительности и специфичности сконструированной тест-системы ПЦР 61
6 Выявление распространенности ВБИ КРС в стадах Московского региона 63
7 Выявление распространенности ВБИ КРС в стадах Ставропольского края 65
8 Результаты секвенирования продуктов ПЦР 67
9 Результаты исследования мясного сырья КРС с помощью праймеров gagl/gag2 68 Обсуждение результатов исследования 70
Выводы 78
Практические предложения 79
Список литературы 80
Приложение 1 (Методические рекомендации по диагностике инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита КРС с помощью ПЦР) 100
- Особенности строения и жизненного цикла ретровируса
- Забор цельной крови КРС и выделение ДНК
- Подбор ДНК-мишени и конструирование праймеров для идентификации ДНК ВБИ методом ПЦР
Введение к работе
Вирус иммунодефицита КРС относится к семейству Retroviridae и роду Lentivirus, который включает также вирусы иммунодефицита человека, кошек, обезьян, вирус инфекционной анемии лошадей, вирусы артрита -энцефалита коз и мэди-висна овец (Van Regenmortel et al 2000). Особое внимание к вирусу бычьего иммунодефицита вызвано его филогенетической близостью к вирусу иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), что позволяет использовать ВБИ в качестве удобной модели для изучения иммунодефицитных состояний животных и человека (Gonda et al 1987).
Впервые ВБИ был выделен из крови коровы с повышенным лимфоцитозом, прогрессирующей слабостью и истощением (Van der Maaten et al 1972). При экспериментальном заражении телят у них появлялись противовирусные антитела и развивалась гиперплазия лимфатических узлов. Вирус бычьего иммунодефицита, встречается во многих странах мира и часто сопутствует другой ретровирусной инфекцией, вызываемой вирусом бычьего лейкоза (ВБЛ) (Carpenter et al 1992, Meas et al 2003, Usui et al 2003, Snider et al 2003).
Эпизоотологическая обстановка по ВБЛ-инфекции в нашей стране хорошо изучена, разработаны методы диагностики и внедрены эффективные системы противолейкозных мероприятий (Гулюкин и др. 2005, Бурба, Шишков и др. 1985, 1992.). Однако вирус бычьего иммунодефицита никогда не служил объектом исследования, а отсутствие диагностических систем не позволяло оценить степень распространения ВБИ среди крупного рогатого скота на территории Российской Федерации (Федоров, Верховский 1996).
Целью наших исследований была разработка диагностической тест-системы ПЦР и изучение распространения ВБИ в некоторых хозяйствах крупного рогатого скота на территории РФ.
Задачи исследования:
- получить инфекционный вирус бычьего иммунодефицита;
создать видоспецифичные праймеры для выявления ДНК провируса ВБИ методом ПЦР;
оптимизировать процесс амплификации по температурному и временному профилю реакции;
- изучить специфичность и чувствительность разработанной тест- системы;
исследовать пробы крови крупного рогатого скота из различных хозяйств РФ на содержание провирусной ДНК ВБИ;
исследовать пробы мяса на содержание провирусной ДНК ВБИ.
Научная новизна
Разработана ПЦР-тест-система для идентификации провирусной ДНК вируса бычьего иммунодефицита в крови крупного рогатого скота. Подобраны видоспецифичные праймеры для идентификации ДНК провируса вируса бычьего иммунодефицита. Получена клеточная линия легкого эмбриона быка (FBL), пригодная для размножения инфекционного ВБИ. Получен инфекционный ВБИ, соответствующий референтному штамму R-29. Проведена оценка чувствительности и специфичности тест-системы. Проведено исследование крови крупного рогатого скота из нескольких животноводческих хозяйств на содержание провирусной ДНК. Впервые на территории Российской Федерации выявлены животные, инфицированные ВБИ. Проведена сравнительная оценка распространенности вирусов бычьего иммунодефицита и бычьего лейкоза в стадах Московской области и Ставропольского края. Показано, что варианты вируса иммунодефицита, циркулирующего в хозяйствах нашей страны, отличаются от стандартного штамма вируса R-29 по гену рої. Проведено исследование партий импортного говяжьего тримминга, полученных из стран Восточной Европы, Евросоюза, Южной Америки и показана возможность выявления ДНК-провируса ВБИ в образцах мяса КРС.
Практическая значимость
Результаты научных исследований были использованы при разработке методических рекомендаций по диагностике инфекции, вызванной ВБИ с помощью полимеразной цепной реакции (Утверждены академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины РАСХН А.М.Смирновым 07.12.2006 г.). Разработан диагностический набор для выявления провирусной ДНК ВБИ методом полимеразной цепной реакции.
Публикации по диссертационной работе и апробация результатов исследования
По материалам диссертации опубликовано 6 работ. Результаты работы доложены: на молодежной международной школе-конференции молодых ученых "Биотехнология будущего" Симпозиума "ЕС-Россия: Перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе" (Санкт-Петербург, 2006); на международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006); на международной конференции "Живые системы и биологическая безопасность населения" (Москва, 2005 г.). Результаты работы доложены и обсуждены на заседании секции инфекционной патологии животных отделения ветеринарной медицины РАСХН 1 ноября 2006 года.
Особенности строения и жизненного цикла ретровируса
При копировании содержащейся в вирионе 70S РНК затравкой для синтеза ДНК служат клеточные тРНК, прочно связанные с вирусной РНК (Van Regenmortel 2000). Затравка (тРНК) присоединена к геномной 35S-PHK на расстоянии примерно 135 нуклеотидов от ее 5 -конца в регионе PBS. тРНК-затравка связывается специфично и с большой степенью сродства не только с 35S-PHK, но и с обратной транскриптазой. Поэтому обратная транскриптаза — это в высшей степени специализированная ДНК-полимераза, назначение которой состоит в инициации синтеза ДНК при ее связывании со специфической затравкой, которая в свою очередь связана со специфическим участком РНК-матрицы (Wooley, Bircher, Smith 1998). Конечным продуктом реакции, катализируемой обратной транскриптазой in vitro, является полная ДНК-копия вирионной 35S-PHK, дополненной по концам длинными прямыми повторами (LTR), отсутствующими в вирионной РНК.
Процесс обратной транскрипции начинается с З -конца 35S-PHK, к которому в области pbs присоединена тРНК, служащая затравкой для начала работы реверсной траскриптазы (Nagy, Bujarski 2000).
Конечная ДНК выделенная из вирусного генома содержит длинные терминальные повторы, составленные из последовательностей с 3 и 5 концов вирусной РНК - фланкирующих R-LTR-последовательности (Van Regenmortel et al, 2000) По информационному содержанию ДНК-вариант генома ретровируса отличается от РНК-варианта только тем, что ДНК содержит не короткие концевые повторы, а длинные концевые повторы LTR (Pallansch, Lackman-Smith, Gonda 1992). LTR-последовательности (long terminal repeats) включают в себя последовательности STR, являющиеся одним из вариантов минисателлитных последовательностей. Это тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы в геноме животных, которые стабильно наследуются и обладают высоким уровнем полиморфизма. Подобно другим повторам, STR обычно встречаются в не кодирующих частях генов. Обнаружена группа структурных генов, несущих тримерные повторы в регуляторных и даже в транслируемых частях генов.
Возникновение LTR очень важно для экспрессии вирусных генов. Они содержат вирусные регуляторные транскрипционные элементы: промотор, энхансер, и другие. Например, некоторые вирусы содержат элементы, определяющие зависимость вирусной транскрипции от наличия определенных гормонов. LTR и являются теми регуляторными сигналами, которые вирус использует для эксплуатации клеточной транскрипционной машины в своих целях. Находясь в составе геномной ДНК, вирусные гены транскрибируются под контролем LTR (Bieniasz, Grdina, Bogerd et al 1999).
Забор цельной крови КРС и выделение ДНК
В пробирки объемом 2 мл вносили 0,5 мл стабилизированной и гомогенизированной встряхиванием крови и добавляли 1,5 мл деионизованной воды. Гемолиз эритроцитов проводили при комнатной температуре в течение 20 минут. Пробы центрифугировали при 10000 об/мин 10 минут. Супернатант сливали и к осадку добавляли в пробирку 1 мл физиологического раствора. Раствор гомогенизировали путем встряхивания пробирок на аппарате вортекс ВП2 до полного суспензирования осадка в физиологическом растворе. Пробы центрифугировали при 10000 об/мин 10 минут. Растворение осадка в физиологическом растворе с последующим центрифугированием повторяли трижды. К сухому осадку добавляли по 0,3 мл буфера. Освобождение ядерной ДНК от остатков ядер и других мембран проводили с помощью детергентов и протеолитического фермента протеиназа К при температуре +37С в течение 1,5 часов. Пробу ДНК смешивали с равным объемом фенола. Содержимое перемешивали до образования эмульсии. Пробы центрифугировали 3 мин при 16000 об/мин при комнатной температуре. Верхний водный слой переносили в чистую пробирку. В каждую пробу добавляли 5М раствор NaCl до концентрации 100 мМ. Добавляли в каждую пробу по 3 мкл тРНК (10 мг/мл). В каждую пробу вносили двойной объем этанола 96 % . Пробы инкубировали при низкой температуре (-20С) в течение 30 - 60 мин для осаждения ДНК. Пробы центрифугировали при 10000 об/мин 6 минут. Супернатант сливали, осадок промывали этанолом 70%. Осадок высушивали при комнатной температуре, растворяли в 15-50 мкл деионизованной воды. Растворение ДНК проводили при комнатной температуре в течение 1-3 часов. Раствор ДНК хранили при температуре +4 С (в случае использования в течение 1-3 дней) или - 20 С (для длительного хранения).
Подбор праймеров к геному провируса ВБИ Из представленных в базах данных EMBL, GenBank и DDBJ была создана подбаза, содержащая все известные данные о нуклеотидных последовательностях генома и отдельных генов ВБИ. Следующим шагом было множественное выравнивание участков генома выбранных изолятов с помощью пакета прикладных программ LaserGene MegAlign_v6. Оценку вариабельности выбранных последовательностей ДНК и поиск консервативных участков для конструирования видоспецифичных праймеров осуществляли в режиме online с помощыо системы ClastalW Multi Sequence Alignment. При анализе генома ВБИ были обнаружены высококонсервативные участки в генах gag и рої, на основании которых были подобраны специфические праймеры. Праймеры, синтезированные на синтезаторе ASM - 102 ("Биоссет", Новосибирск) и очищенные посредством электрофореза в ПААГ, были получены от фирмы "Синтол" (Россия). Термодинамический анализ праймеров и ампликонов был произведен с помощыо программы Oligo.
Подбор ДНК-мишени и конструирование праймеров для идентификации ДНК ВБИ методом ПЦР
В настоящее время для диагностики лентивирусных инфекций применяют серологические методы и метод полимеразной цепной реакции. Выбор методики обнаружения ВБИ зависит от возможностей лаборатории и задач, стоящих перед исследователями. Одним из наиболее распространенных методов серологической диагностики ВБИ является Вестерн - блот (Whetstone et al 1990; Carpenter et al 1992; Jacobs et al 1992; Meas et al 1998; Usui et al 2003). Метод Вестерн - блота позволяет выявлять антитела сразу к нескольким антигенам ВБИ (gplOO, р32, р26, р19, р16 и р13). Метод иммуноферментного анализа для диагностики ВБИ (Isaacson JA et al. 1998) и индикация ВБИ на основе реакции иммунофлюоресценции (Orr et al 2003) используются существенно реже, что объясняется отсутствием стандартных реагентов для этих методик. При создании серологических тест-систем необходимо обладать вирусным антигеном, который можно получить из культуры клеток, зараженных инфекционным ВБИ или трансфицированной плазмидой, содержащей полный геном ВБИ. Антиген может быть получен также путем экспрессии вирусных генов в бактериях с помощью генно - инженерных подходов. При инициации исследования по распространению ВБИ - инфекции возникает необходимость в создании чувствительного и специфичного метода обнаружения ВБИ, позволяющего выявить непосредственно вирус (а не антитела) в крови животного или в культуре клеток. Наиболее универсальным методом обнаружения вирусов в биологических объектах на данный момент является полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая идентифицировать провирусную ДНК вируса. Кроме того, несомненным преимуществом ПЦР является возможность обнаружения провируса ВБИ в разнообразных физиологических жидкостях животных (кровь, сперма, молоко, мышечная ткань и т.д.) и культуре клеток инфицированных ВБИ. С помощью ПЦР возможна диагностика инфекции на ранних стадиях развития, до возникновения антительного ответа.
Благодаря своим очевидным преимуществам ПЦР используется практически всеми исследователями, занимающимися диагностикой ВБИ вне зависимости от использования других методов диагностики и источников исследуемого материала. Так, ПЦР используется для подтверждения инфекционного статуса животного, полученного при использовании серологических методов обнаружения ВБИ (Meas et al 1998; Meas et al 2000; Usui et al 2003; Meas et al 2003; Meas et al 2004); при исследовании возможности вертикальной передачи ВБИ (Meas S. Et al 2002); при установлении нуклеотидных последовательностей различных генотипов ВБИ, полученных из разных стран (Carpenter et al 2000; Patil et al 2003); при исследовании тропизма ВБИ к различным клеткам и органам КРС (Wu et al 2003), для установления способности ВБИ преодолевать межвидовые барьеры и инфицировать клетки других млекопитающих (Pifat et al 1992).
Ключевым моментом при создании тест - системы ЦПР является подбор олигонуклеотидных зондов (праймеров), функция которых состоит в специфическом образовании водородных связей с ДНК-мишенью. Подбор праймеров, как правило, осуществляется с использованием мировых баз данных EMBL, GenBank и DDBJ, содержащих все известные данные о нуклеотидных последовательностях генома и отдельных генов ВБИ. На основании этой информации разными исследователями подбирались различные участки генома ВБИ, чтобы в последствие использовать их в качестве ДНК - мишени для праймеров. Как правило, исследователи находили несколько консервативных последовательностей в разных генах ВБИ (env, gag, рої) и впоследствии опробовали чувствительность и специфичность каждой подобранной пары праймеров (Patil et al 2003; Gonzalez et al 2000; Limanskaya et al 2005). Согласно публикациям, наиболее консервативые последовательности находили в разных участках генома ВБИ. Так, в ряде случаев наиболее удачными оказались праймеры: к гену pol (Meas et al 2004; Limanskaya et al 2005), к гену env (Carpenter et al 2000) и к гену gag (Patil et al 2003). В некоторых случаях также применялся двухраундный (гнездовой) ПЦР, позволяющий повысить чувствительность реакции (Gonzalez G. Et al 2001; Meas S. Et al 2004).
