Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из факторов, определяющих эффективность борьбы с инфекционными болезнями животных, в т.ч. и лейкоза крупного рогатого скота, является наличие высокоспецифичных и чувствительных методов прижизненной диагностики.
Используемый в настоящее -время в ветеринарной практике серологический метод диагностики (РИД) - прост в постановке и оценке результата, но обладает недостаточной для полного выявления всех инфицированных животных чувствительностью (К.L.Jacobson et al.,1985; В.Г.Арутюнян, 1992; А.В.Киселев, 1992). Более эффективный тест на основе иммуноферментного анализа позволил бы в сжатые сроки проводить оздоровление, особенно на завершающих стадиях, и надежно контролировать благополучие стад.
К достоинствам метода относятся высокая специфичность и превосходящая РИД чувствительность, (D.R.Monke et al., 1992; D. Ве-Ier and H.Siakkou, 1994), быстрота получения информации и возможность автоматизации постановки реакции (F.Bricout, 1987; Ia-cobello С. et al., 1988). В ИФА можно определять антивирусные антитела не только в индивидуальных, но и в сборных пробах сыворотки крови и молока (R.M.Jacobs et al., 1991). В настоящее время метод широко применяется в зарубежной практике и позволил практически завершить оздоровления ферм на территории Западной Европы (I.Schwartz and D.Levy, 1994).
Высокочувствительный иммуноферментный анализ (ИФА) для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в настоящее время в нашей стране не используется из-за отсутствия высокоочищенных и специфичных реагентов, в частности, детектирующих конъюгатов из антивидовых антител, а также из-за неотработанности соответствующих тест-систем. Наиболее специфичные реагенты для иммуноанали-за готовят на основе моноклональных антител (МКА).
Цель работы. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота животных (ВЛКРС) и оценка ее чувствительности и специфичности в сравнении с РИД. Для реализации указанной цели были определены следующие задачи:
1. Получить клоны гибридом, синтезирующие МКА к специфическим фрагментам иммуноглобулинов основных классов крупного рогатого скота (IgGl. IgG2, IgA, slgA, L-цепи), и выбрать из их числа клоны, наиболее перспективные для изготовления высококачест-
венных иммунопероксидазных конъюгатов и использования в иммуноа-нализе.
-
Получить клоны гибридом, синтезирующие МКА к р24 антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота, которые можно было бы использовать в конкурентном или сэндвич- вариантах ИФА, или для аффинной очистки р24 антигена.
-
Разработать набор реагентов для выявления инфицированных вирусом лейкоза животных в ИФА, наиболее приемлемый для практического применения.
-
Оценить, специфичность и чувствительность разработанной' тест-системы в сравнении с РИД.
Научная новизна. Впервые в стране получены панели гибридом, устойчиво синтезирующие моноклональные антитела к фрагментам иммуноглобулинов крупного рогатого скота: IgG, IgGl, IgG2, L-цепи, IgA, slgA и к p24 антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота. Предложен вариант скрининга гибридом, синтезирующих антивидовые моноклональные антитела, .при помощи меченного видового IgG. Определена кинетика связывания окисленной перйодатом перок-сидазы из корней хрена (HRP0) с антителами. Определена кинетика связывания иммунореагентов с поверхностью планшета и с другими иммунореагентами на всех стадиях разработанного сэндвич-варианта иммуноферментного анализа. Показана на практике возможность аффинной очистки моноклональных антител с высоким сродством к антигену при помощи гомологичного антигена (IgG северного оленя). Показана роль балластных антител в возникновении неспецифических реакций в иммуновферментном анализе.
Практическая значимость работы. Получены клоны гибридом к основным классам иммуноглобулинов крупного рогатого скота и к р24 антигену ВЛКРС. Клоны устойчиво синтезируют моноклональные антитела, которые можно использовать в иммунодиагностике для дифференциации иммунного ответа по подклассам иммуноглобулинов или для их количественного определения по Манчини (G.Mancini et al., 1965) и в ИФА. Усовершенствована методика изготовления иммунопероксидазных конъюгатов.
Разработана тест-система иммуноферментная для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Разработаны и утверждены Департаментом ветеринарии МСХиП РФ "Временные наставления по применению тест-системы иммуноферментной для выявления
антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота" и Технические условия на изготовление реагентов указанной выше тест-системы.
Разработан сэндвич- вариант ИФА для определения антител к р24 антигену в пробах сыворотки крови и молока, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью.
На защиту выносятся условия приготовления реагентов иммуно-ферментной тест-системы для определения антител к р24 антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота и условия проведения им-муноферментной реакции.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ИЭВСиДВ в 1991 - 1995 гг.; на всесоюзной научно-теоретической конференции "Использование достижений биотехнологии в животноводстве и ветеринарии" (1991г); научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения проф. Щепилова Н. С. (1993 г.); научно-практической конференции "Проблемы адаптации сельскохозяйственных животных в Сибири" (1995 г.); конференции молодых ученых, посвященной 26-летию СО РАСХН (1995г.); на межлабораторном совещании сотрудников ИЭВСиДВ (1996 г.).
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 4 научных работах в сборниках научных трудов ИЭВСиДВ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 11 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы, состоящей из 178 источников, из которых 48 отечественных.
