Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16
1.1 Характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота 16
1.2 Динамика репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота в клеточных культура 23
1.3 Методы выявления инфицированных вирусом лейкоза животных 26
1.4 Передача вируса лейкоза крупного рогатого скота в естественных условиях и в эксперименте 36
1.5 Предрасполагающие факторы развития лейкозного процесса у крупного рогатого скота 44
1.6. Полимеразная цепная реакция в диагностике лейкоза 47
171. Иммунитет и специфическая профилактика лейкоза крупного рогатого
скота 49
1.8. Заключение 55
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ' 60
2.1 Материалы и методы исследований 60
2.2 Результаты собственных исследований 91
2.2.1 Изменения гематологических показателей в динамике развития лейкозного процесса у крупного рогатого скота 91
2.2.2 Колостральный иммунитет у телят, родившихся от больных лейкозом коров 95
2.2.3 Инфицированность телят родившихся от родителей, больных вирусом лейкоза крупного рогатого скота 100
2.2.4 Внутриутробное инфицирование эмбрионов у коров, положительно реагирующих в РИД и РДСК, с учетом гематологических показателей коров-матерей и возраста плода 104
2.2.5 Экономическая эффективность противолейкозных мероприятий в ГУ СП «Стерлитамакское» Республики Башкортостан 108
3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 119
ВЫВОДЫ 129
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 131
БИБЛИОГРАФИЯ 132
ПРИЛОЖЕНИЯ 158
- Характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота
- Изменения гематологических показателей в динамике развития лейкозного процесса у крупного рогатого скота
- Инфицированность телят родившихся от родителей, больных вирусом лейкоза крупного рогатого скота
Введение к работе
Лейкозы и другие злокачественные заболевания кроветворной ткани, объединяемые в группу гемобластозов, - одна из самых острых и актуальных проблем современной онкологии. Повсеместно растет число больных лейкозом людей, особенно детей, а также сельскохозяйственных и домашних животных. Протекает болезнь очень тяжело и, до недавнего времени, считалась неизлечимой. Сейчас появились обнадеживающие результаты при лечении новыми комплексными методами, включающими иммунотерапию. У животных на первый план выходит профилактика лейкозов.
Болезнь у животных и человека наряду с проникновением и накоплением в тканях лейкозных клеток (инфильтрацией) часто сопровождается увеличением и в кровяном русле числа клеток белой крови разной степени зрелости. Если таких форменных элементов много, то кровь становится более светлой, беловатой, поэтому появился термин «белокровие», теперь уже устаревший. Однако белокровие не всегда явно выражено, при лимфосаркомах и некоторых других формах гемобластозов оно может отсутствовать или появляться в финальной стадии развития болезни.
Опухолевые заболевания кроветворной ткани человека и животных имеют одну общую особенность — тяжелый системный характер поражения, их крайне тяжело диагностировать, а значит, эффективно и вовремя бороться с ними.
В последние годы внимание исследователей уделяется вопросам эпизоотологии, патогенеза, инфекционных свойств возбудителя, диагностики и профилактики лейкоза крупного рогатого скота.
Многочисленные публикации и данные официальной ветеринарной статистики свидетельствует о том, что среди инфекционных болезней крупного рогатого скота лейкоз по тяжести поражения органов, тканей, массовости проявления и экономическим последствиям занимает лидирующее место и составляет 57 % от других нозологии (Гулюкин М.И., 2003 г.).
Лейкозы поражают почти всех млекопитающих, птиц, рыб и амфибий, что нашло отражение в эмблеме международной ассоциации по сравнительному изучению лейкемий.
Рисунок 1. Эмблема Международной ассоциации по сравнительному изучению лейкозов..
Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота является РНК-содержащий вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС, BLV), относящийся к семейству Retroviridae, роду Deltaretrovirus. в который входят также Т-лимфотропные вирусы человека и обезьян, в том числе вирус Т-клеточного лейкоза человека (HTLV). В результате однократно произошедшего инфицирования, ВЛКРС присутствует в организме животного пожизненно в форме провируса. интегрированного в ДНК клеток хозяина. Продукция вирионов подавляется на уровне транскрипции, поэтому свободных зрелых вирионов или их антигенов в организме инфицированного животного, как правило, нет. Вместе с тем, происходит выработка антител к
белкам вириона, которая служит наиболее постоянным и доступным для диагностирования признаком индуцированной ВЛКРС инфекции.
Вирус поражает клетки лимфоидной ткани, т.е. является лимфотропным. Он ассоциирован с клеткой и персистирует в субпопуляции периферических В-лимфоцитов, которые в результате инфекции пролиферируют обусловливая развитие персистентного лимфоцитоза.
Онкоген в составе генома ВЛКРС не выявлен. Для развития опухолей обязательна экспрессия регуляторного трансактивирующего вирусного белка Tax, не включающегося в состав вириона. Ген Tax ВЛКРС и HTLV заменяет этим вирусам онкоген.
Спектр хозяев ВЛКРС. В естественных условиях вирус лейкоза крупного рогатого скота вызывает инфекцию у крупного рогатого скота, а при экспериментальном заражении у других видов животных: овец, коз, свиней, лошадей, кроликов. «Онкогенный потенциал ВЛКРС реализуется, как правило, только при инфицировании жвачных крупного рогатого скота, овцы и козы. В последнее время отмечено инфицирование ВЛКРС овец в естественных условиях.
Пути и факторы передачи ВЛКРС. Вирус лейкоза крупного рогатого скота является экзогенным и передается только через соматические клетки (лимфоциты). Источником возбудителя инфекции является животное, инфицированное ВЛКРС.
Факторами передачи инфекции являются любые биологические
жидкости, секреты -и экскреты инфицированного животного (кровь, носовой
секрет, моча и др.), если они содержат инфицированные лимфоциты. Чаще
всего вирус передается с кровью. Наибольшую опасность с точки зрения
распространения инфекции представляют животные с персистентным
лимфоцитозом, у которых доля инфицированных лимфоцитов в
периферической крови значительно выше, чем у животных инфицированных, но не достигших гематологической стадии заболевания. Передача ВЛКРС от инфицированной матери её потомству (вертикальный путь передачи) при отсутствии отягчающих факторов происходит всего в 5 % случаев, но иногда
7 может достигать практически 30 %. Горизонтальный путь передачи В Л в
эпизоотическом процессе считается основным. Инфекция распространяется
при совместном содержании инфицированных и неинфицированных
животных, при проведении отелов здоровых и инфицированных животных в
одном помещении, через общие кормушки, поилки и доильные аппараты, а
также за счет воздействия антропогенных факторов (мечение животных,
обрезка рогов и копыт, фиксация за носовую перегородку, ректальные
исследования и др.). Доказана возможность передачи ВЛКРС кровососущими
насекомыми (слепнями).
Многие исследователи считают, что проблема лейкозов — наиболее интенсивная точка роста наших знаний о причинах и механизмах опухолевой трансформации клеток и развитии опухолевого процесса. Действительно, полученные при глубоких исследованиях лейкозной трансформации клеток данные обогащают биологию принципиально новыми положениями.
Широкое распространение заболевания во многих странах мира, отсутствие средств терапии и специфической профилактики определяют актуальность темы и выдвигают проблему лейкоза крупного рогатого скота в число сложных задач не только ветеринарии, но и биологии в целом (Левашев А.Т., 1994; Незавитин А.Г., 1995; Галеев Р.Ф., 2000; Петров Н.И., 2005; Храмцов В.В.,2005).
Для эффективной борьбы с лейкозом крупного рогатого скота показано использование специфических средств профилактики на основе инактивированного вируса (Miller et al., 1983, Парфанович М.И. и др., 1987; Бурба Л.Г и др., 1985; Федорова Н. А и др., 1987; Крикун В.А и др., 1996; Галеев Р.Ф., 2000).
Исследованиями последних лет доказано, что:
- у животных,,инфицированных ВЛКРС, через 6-8 недель обнаруживают
в крови антитела к вирусу лейкоза;
- ВЛКРС и антитела к нему персистируют в крови одновременно в
течении нескольких лет (инаппарантная инфекция);
- у животных, признанных больными лейкозом по гематологическим
показателям, в 93-100 % случаях выявляют антитела к ВЛКРС, и лишь 10-30 % серологически положительных животных имеют персистентный лимфоцитоз (БурбаЛ.Г., 1983);
- у телят, получавших в первые сутки после рождения молозиво от
больных лейкозом или инфицированных вирусом лейкоза коров, образуется
колостральный иммунитет. Опыты, проведенные учеными ВИЭВ, показали,
что такой иммунитет предохраняет в среднем 60 % телят при прямом
подкожном заражении их ВЛКРС, тогда как телята, получавшие свободное от
антител к вирусу лейкоза молозиво здоровых коров, инфицировались ВЛКРС в
100 % случаях; трансплацентарно антитела от матери к Плоду не передаются,
полученные телятами с молозивом они сохраняются в крови до 6 месяцев
(Шишков В.П., Галлеев Р.Ф., Гулюкин М.И., Симонян Г.А., 2000).
Выявлено инфицирование плодов ВЛКРС трансплацентарным путем в пренатальный период. В зависимости от степени инфицированности животных вирусом лейкоза и частоты клинико-гематологического проявления болезни в стаде отмечали от 6 до 20 % телят внутриутробно заразившихся вирусом лейкоза. Высокая (от 18 до 20 %) инфицированность отмечалось у телят, родившихся от коров с клинико-гематологическим и опухолевыми проявлениями лейкоза. У инфицированных в пренатальный период 5-8 месячных плодов развивался инфекционный процесс и образовывались' антитела к вирусу лейкоза с одновременной персистенцией вируса в крови.
В постнатальный период иммунологическими методами отмечали увеличение телят, инфицированных ВЛКРС, коррелирующее с возрастом животных. Так в возрасте от 6 до 12 месяцев наблюдалось в среднем 9 % телят, заразившихся ВЛКРС, в возрасте от 1 до 3 лет -15 %, от 3 до 10 лет- 30 % животных в стаде были инфицированы ВЛКРС (Бурба Л.Г., 1983).
Известно, что при низком уровне зараженности животных ВЛКРС в стаде, оздоровление хозяйств от лейкоза и бессимптомйой онкорновирусной инфекции осуществлялось в течение 12-18 месяцев с момента первого" серологического исследования при условии удаления из стада всех
9 серопозитивных животных после каждого серологического исследования,
проводимого с интервалом 3-6 месяцев. При инфицированности 30 % и более
животных и невозможности быстрого удаления из хозяйства серопозитивных
животных оздоровление проводили путем разделения стада на две группы
(серопозитивную и серонегативную) с раздельным содержанием групп и
длительной передержкой животных, инфицированных ВЛКРС. При таком
методе оздоровление возможно в течение 3-х лет.
Не до конца изучены закономерности распространения вируса и истинная эпизоотическая обстановка, факторы передачи ВЛКРС от коров матерей потомству, колостральный иммунитет телят.
Лейкоз крупного рогатого скота в настоящее время распространен во всех субъектах Российской Федерации. По официальным данным в Российской Федерации имеется более 3 тысяч неблагополучных пунктов по лейкозу крупного рогатого скота. Уровень инфицированности составляет от 12 до 15 % (в отдельных регионах значительно выше), а уровень заболеваемости 3-4 %. Такая эпизоотическая ситуация сохраняется уже в течение нескольких лет.
С 1997 г эта болезнь занимает первое место в структуре инфекционной патологии. (Гулюкин М.И., 2007)
Социальная значимость проблемы. Установлено, что молоко и мясо больных лейкозом животных содержат метаболиты триптофана и других циклических аминокислот и, следовательно, являются экологически опасными для человека. Показана возможность преодоления вирусом лейкоза видовых барьеров. В условиях эксперимента удалось воспроизвести инфекцию вирусом лейкоза крупного рогатого скота у овец, кроликов, свиней, обезьян. В опытах на кроликах при выпаивании им молока от больной лимфолейкозом коровы удалось воспроизвести инфекцию в 5 случаях, в одном случае закончившуюся развитием лимфолейкоза. Имеются случаи вирусоносительства у овец в естественных условиях.
10 Определено сходство нуклеотидной последовательности белков вируса
лейкоза крупного рогатого скота и вируса Т-клеточного лейкоза человека
(NTLV).
Экономическая значимость проблемы. Лейкоз причиняет животноводству большой экономический ущерб, который выражается в недополучении молока и приплода, преждевременной выбраковке коров и быков-производителей, утилизации туш больных животных, нарушении воспроизводительной функции больных коров, ограничении племенной работы и хозяйственной деятельности в связи с неблагополучием. Подсчитано, что животные, инфицированные вирусом лейкоза, имеют молочную продуктивность на 12,7 % и содержание жира в молоке на 0,09 % ниже, чем серонегативные. Кроме этого, омоложение оздоравливаемого стада за счет выведения из товарного производства полновозрастных коров и замены их нетелями снижает валовое производство молока на 6,0 %.
Ретроспективный анализ статистических данных на глубину до 25 лет показывает, что ежегодно лейкоз диагностировали у более чем 50 тыс. голов крупного рогатого скота. Все они были сданы на мясокомбинат. Согласно Правилам ветсанэкспертизы туши больных лейкозом животных или отдельные органы бракуются целиком и направляются в утиль или в промпереработку.
Разработка эффективных мер борьбы с лейкозом крупного рогатого скота стала возможной после открытия возбудителя инфекции - вируса лейкоза крупного * рогатого скота (ВЛКРС). В результате разработки серологического метода диагностики инфицированного ВЛКРС поголовья -реакции иммунодиффузии в геле агара (РИД) и иммуноферментного анализа (ИФА) - открылся путь к проведению эпизоотологического мониторинга и проведению противолейкозных мероприятий. Стало очевидным, что решение проблемы лейкозов возможно только на основе общих принципов борьбы с инфекционными болезнями.
Современные оздоровительные противолейкозные мероприятия основаны на выявлении и изоляции (удалении) из стада животных, инфицированных ВЛКРС. Результаты многих исследований доказали, что РИД
и ИФД являются надежными методами прижизненной диагностики, вызываемой ВЛКРС инфекцией, и их использование позволяет успешно бороться с болезнью.
В результате успешного проведения оздоровительных мероприятий в странах Западной Европы проблема лейкозов крупного рогатого скота фактически перестала существовать, но интенсивное изучение вируса лейкоза и вызываемого им инфекционного процесса продолжается. Лейкоз крупного-рогатого скота - это уникальная модель вирусного канцерогенеза, на которой
можно отрабатывать принципы конструирования средств специфической профилактики злокачественных новообразований у человека и животных. В нашей стране и в других странах с высокой превалентностью лейкоза крупного рогатого скота применение эффективной и дешевой вакцины позволило бы значительно повысить темпы оздоровления и снизить ущерб от выбраковки инфицированных животных.
Лейкоз крупного рогатого скота наносит громадный ущерб генофонду в племенном животноводстве.
В проблеме лейкозов крупного рогатого скота возник своего рода застой. Эпизоотологическая ситуация за ряд последних лет не улучшается, тормозится племенная работа. Поэтому возникает необходимость внести некоторые изменения в методологию противолейкозной работы. Система эпизоотологического мониторинга позволяет расширить взгляды на эпизоотологический процесс при лейкозе крупного рогатого скота, а кроме этого раскрывает многие вопросы методологии, организации противоэпизоотологических мероприятий, управленческих решений и др. (Гулюкин М.И., 2007)
Таким образом, наиболее актуальной проблемой и перспективным направлением научно-исследовательской работы является изучение колострального иммунитета и внутриутробное инфицирование телят вирусом лейкоза от коров-матерей с различной степенью выраженности лейкозного процесса.
12 Цель и задачи исследований.
Перед нами были поставлены следующие цели:
Выявить степень выраженности колострального иммунитета у телят к вирусу лейкоза и возможность заражения их в этот период.
Определить факторы внутриутробного инфицирования телят вирусом лейкоза крупного рогатого скота.
Для достижения цели исследования необходимо решить следующие задачи:
Изучить изменения гематологических показателей в динамике развития инфекционного процесса у крупного рогатого скота при лейкозе.
Исследовать влияние титра молозивных антител на длительность-персистирования в крови телят, а также на возможность их заражения в этот период.
Исследовать степень инфицированности телят, родившихся от больных лейкозом родителей.
Определить степень внутриутробного инфицирования эмбрионов у коров, положительно реагирующих в РИД и РДСК, с учетом гематологических показателей коров-матерей и возраста плода.
Определить экономическую эффективность противолейкозных мероприятий в ГУ СП «Стерлитамакское» Республики Башкортостан.
Научная новизна работы. Впервые изучено внутриутробное инфицирование эмбрионов у коров с учетом гематологических показателей коров-матерей и возраста плода при ВЛКРС.
Выявлены особенности гематологических изменений при ВЛКРС в динамике развития лейкозного процесса.
Выявлено, что от заражения вирусом лейкоза телят до 5-ти месячного возраста предохраняют колостральные антитела против ВЛКРС, полученные от коров - матерей с молозивом. Этим подтверждено значение выпаивания-молозива в качестве специфической профилактики при ВЛКРС.
13 Доказано, что вертикальный путь передачи ВЛКРС не является
основным путем распространения.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют: дифференцировать гематологические изменения крови при ВЛКРС от других заболеваний сопровождающихся лейкоцитозом^ рекомендовать своевременную выпойку молозива телятам, родившимся от инфицированных вирусом лейкоза коров-матерей, в качестве специфической профилактики; ускорить оздоровление неблагополучных хозяйств путем получения здорового потомства от больных лейкозом коров.
Результаты работы используются в учебном процессе и в научных исследованиях на кафедре «Паразитология, микробиология и вирусология» ФГОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет», в ГОУ СПО «Стерлитамакский сельскохозяйственный техникум». Материалы диссертационной работы использованы при написании учебных пособий «Проведение практических занятий по дисциплине «Патологическая физиология и патологическая анатомия» по специальности 3104 «Ветеринария» (Хусаинов Р.Ф., Москва, 2003), имеющий гриф «Учебное пособие» УМЦ СПО при МСХ РФ, и «Учебное пособие по проведению практических занятий по учебной дисциплине «Патологическая физиология и патологическая анатомия» для студентов средних специальных учебных заведений по специальности 110502 «Ветеринария» (Хусаинов Р.Ф., 2006), имеющий гриф «Учебное пособие» Министерства образования Республики Башкортостан.
Результаты наших исследований вошли в «Национальную программу профилактики и оздоровления хозяйств Республики Башкортостан от лейкоза крупного рогатого скота на 2006-2010 годы».
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Изменения гематологических показателей в динамике развития инфекционного процесса у крупного рогатого скота.
2. Колостральный иммунитет у телят, родившихся от больных лейкозом
коров.
Инфициров'анность телят родившихся от родителей больных вирусом лейкоза крупного рогатого скота.
Внутриутробное инфицирование эмбрионов у коров, положительно реагирующих в РИД и РДСК, с учетом гематологических показателей коров-матерей и возраста плода.
5. Экономическая эффективность противолейкозных мероприятий в
ГУ СП «Стерлитамакское» Республики Башкортостан.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и одобрены на 1-ой Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в реализации приоритетного национального проекта «Развитие АПК» (Уфа, 2006 г.); Международной научно - практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и биотехнологий» (Оренбург, 2007 г.); Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежная наука и АПК: проблемы и перспективы» (Уфа, 2008 г.); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием в рамках XVIII Международной специализированной выставки «Агрокомплекс - 2008» (Уфа, 2008 г.); на расширенном заседании кафедры «Паразитология, микробиология и вирусология» ФГОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» (протокол №12 от 27 июня 2007 года).
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе две статьи изданы в ведущих научных журналах рекомендованных перечнем ВАК Российской Федерации (Известия Оренбургского государственного аграрного университета, Ветеринарный врач).
15 Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 158
страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,
материала и методов исследований, результатов собственных исследований,
обсуждения результатов собственных исследований, выводов и практических
предложений. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 13 рисунками.
Библиографический список включает 243 наименования, в том числе 88
наименований на иностранных языках.
1.0 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Характеристика биологических особенностей вируса лейкоза крупного
рогатого скота.
Лейкоз крупного рогатого скота относится к заболеваниям опухолевой природы - гемобластозам, основным признаком которых является злокачественное разрастание клеток кроветворной ткани и нарушение их созревания (Шишков В.П., Бурба Л.Г., 1988; Нахмансон В.М. соавт.,1995; Гулюкин М.И., 1999; Крикун В.А., 2002; Галеев Р.Ф. 2003; Магер С.Н., Храмцов В.В., 2005)
По мнению В.М. Лемеша (1990), клинический лейкоз характеризуется как персистентный лимфоцитоз или лимфоцитарная неоплазия.
Это заболевание регистрируется во многих странах мира, что выдвигает проблему опухолевого роста в число наиболее сложных задач медицины и ветеринарии (Onumaetal., 1984; Кудрявцева Т.П., 1980;).
В естественных условиях крупный рогатый скот заражается вирусом лейкоза главным образом горизонтальным путем, но может и конгенитальным способом. У инфицированного животного развивается сильный и постоянный гуморальный ответ на структурные белки вируса. Место и механизм персистенции вируса неизвестны. В большинстве случаев инфицированные животные остаются здоровыми и не снижают продуктивности.( Нахмансон В.М., Дун Е.А., Бурба Л.Г., Кузин, А.И.,1997; Крикун В.А.,1984, 2002; Магер С.Н., Храмцов В.В., 2005; Stear M.J., Dimmock С.К., Newman M.J., Nickolas F.W., 1988)
В зависимости от многих факторов, включая генетические и факторы окружающей среды, у 30 -70 % инфицированных животных развивается одна из форм болезни, известная как персистентный лимфоцитоз. Персистентный лимфоцитоз характеризуется увеличением количества циркулирующих в крови В - лимфоцитов, о чем свидетельствует наличие поверхностных иммуноглобулинов и Fc-рецепторов на циркулирующих клетках.
17 Вирус лейкоза присутствует в субпопуляции циркулирующих В-
лимфоцитов животных с персистентным лимфоцитозом (Валихов А.Ф., 1976,
1978; Жавненко В.М., 1988; СВ. Зеливянский СВ., Карпов В.А., В.В. Баурин
В.В., 1994; Paulsen J., 1977; KettmannR., 1980).
R. Kettmann (1980) установил что генетическая информация вируса лейкоза включена в различных сайтах клеточной ДНК В- лимфоцитов. Кроме того, циркулирующие при персистентном лимфоцитозе, лимфоциты являются поликлональными, исходя из сайтов интеграции провируса, они еще не имеют хромосомных аномалий.
Основываясь на цитологических, цитоферментных и иммунохимических методах и по аналогии с классификацией Kiel злокачественных лимфом человека лимфоциты опухолей, индуцированных вирусом лейкоза, принадлежат к В- клеткам с неодинаковым у разных животных фенотипом дифференциации опухолевых клеток.
Методом гибридизации на фильтрах по Саузерну ДНК опухолевых клеток с провирусными последовательностями показано, что генетическая информация вируса интегрирована в ДНК большинства опухолевых клеток в одном и том же сайте. Это отличает их от той ситуации, которая имеет место при персистентном лимфоцитозе, т. е. опухолевые клетки являются моно- или олигоклональными по сайтам вирусной интеграции (R.Kettmann et al., 1980). Отдельные опухоли могут содержать 1-3 провируса.
Вирусоподобные частицы были выявлены в ультратонких срезах клеток опухолей и осадков, полученных из молока (Dutcher R et al., 1964). Однако впервые достоверно, описана морфология ВЛКРС в работе J. М. Miller (1969). Зрелые вирионы ВЛКРС состоят из центрально расположенного электронно-плотного нуклеоида, диаметр которого в зависимости от методов фиксации и обработки препарата варьирует от 40-90 нм. Центральная часть нуклеоида (кор) отделена от внешней вирусной оболочки промежуточным слоем. Когда кор имеет максимальные размеры, то просветленное пространство между промежуточным слоем уменьшено, матрикс нуклеоида менее конденсирован и представлен гранулярным веществом. При меньшем размере кора его матрикс
." . ' 18 '.
сильно конденсирован, гомогенен, а просветленное пространство между нуклидом и промежуточным, слоем трудноразличимо. Гексагональное . очертание ну клеоида в ультратонких срезах предполагает возможную икосаэдрическую структуру. Внешняя вирусная оболочка представлена двухконтурной мембраной,, которая лабильна, из-за чего диаметр вириона может сильно варьировать - от 73 до 120 нм. В среднем диаметр вириона В ЛКРС составляет 101±2 нм. На поверхности внешней оболочки выявляют шипики длиной 8-11нм с пуговкообразными утолщениями на' концах. В краткосрочных культурах лимфоцитов вирус располагается в виде скоплений вне клеток, окруженных клеточным детритом? Внутриклеточный вирус локализуется в цитоплазматических вакуолях. В краткосрочных культурах лимфоцитов вирус накапливается в больших количествах преимущественно во внеклеточном пространстве, но нередко внутри клеток в цитоплазматических вакуолях. Внеклеточный и внутриклеточный, вирус располагается в виде' скоплений и окружен клеточным детритом. (Мишкинене А; Э;, 1991; Смирнова И.А., Билько Н.А., Кишинская EX., 1993; Орлянкин Б.Г., Гулкжин М.И., Замараева Н.В., Кунаков К.Ю., 2000; Cohn М., Epstein R., 1991; Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M., 1991; Davies C.J., 1991)
В краткосрочных культурах лимфоцитов очень редко встречают почкующиеся формы вируса. При использовании анти- ВЛКРС - сыворотки, меченной ферретином, показано, что метка локализуется в основном на вирусных частицах, а цитоплазматическая мембрана не является местом предпочтительной локализации ВЛКРС и вирусспецифических белков.
Зрелые вирусные частицы иногда располагаются в цитоплазматических вакуолях внутри клеток, накопление вирионов в них идет за счет почкования на мембране внутрь вакуоли. (Немейкайте А. Й., 1990; Van Der Maaten M.J., Miller J.M., Boothe A. D., 1974; Onuma M., 1976; Lewin H.A., 1985; Lilly F.,
1991) '. . -..,: ;,;'. ;;;. :,'-:...';' '
В перевиваемых культурах клеток почкующиеся формы встречаются более часто. Формирование нуклеоида начинается со скопления в виде полумесяца электронно-плотного вещества под плазматической мембраной.
19 Иногда в местах формирования нуклеоида наблюдают гранулы, по размерам
сходные с рибосомами. Высвобождающиеся вирионы имеют нуклеоид с
электронно-прозрачным центром и неравномерно распределенным по его
периферии электронно-плотным веществом.
В перевиваемых культурах также наблюдали почкование ВЛКРС внутрь цитоплазматических вакуолей. На первой стадии отмечают на внутренней поверхности мембраны, ограничивающей вакуоль, скопление почкующихся форм вируса. Вакуоли накапливают зрелые вирионы вместе с клеточным детритом. На этом основании A. Burny и др. (1978) приводят следующее описание одного из возможного путей морфогенеза ВЛКРС. Почкование вируса внутрь вакуоли сопровождается прогрессирующей дегенерацией цитоплазматического матрикса, затем везикула мигрирует к цитоплазматической мембране и высвобождает свое содержимое во внеклеточное пространство. Если такой путь морфогенеза преобладает в культурах, то этим можно объяснить, почему осадок вируса часто в большей степени контаминирован клеточным детритом (Шишков В.П., Бурба Л. Г., 1988)
В результате денатурации 60 -70S ВЛКРС вирионы РНК образуются poly (А) - содержащие субъединицы, которые имеют скорость седиментации 38S и мигрируют как единичный компонент с молекулярной массой 2,95 106Д (са 8,8 kb) в SDS полиакриламидном геле (Крикун В.А., 1999; Chysdael et al.,1979; Bernoko D., 1991). Это значение согласуется с данными для интегрированной ДНК ВЛКРС из различных источников, установленными в пределах 8,3-9,4 kb, и для ВЛКРС - провирусов, клонированных как из опухолей крупного рогатого скота, так и из FLK- ВЛКРС- продуцирующей клеточной линии.
Геном ВЛКРС содержит 8714 нуклеотидов и имеет следующую генетическую структуру; s' -LTR - gag -poi-env-рХвь - LTR-3' . LTR- состоит из 530 пар оснований. Донорный сайт сплайсинга находится в R- участке. За LTR следует лидерная последовательность в 97 пар. Первую открытую рамку считывания составляет ген gag. Этот участок кодирует белок — предшественник со структурой NH2 - р15 - р24- СООН. Через 500 пар после
20 концевого триплета gag начинается вторая рамка считывания для рої,
кодирующая 852 аминокислоты. Характерно, что оба концевых участка pol-
продукта обнаруживают большую гомологию с соответствующими участками
вируса С- типа млекопитающих. Pol- продукт (95 кД) несколько больше, чем
полимераза ВЛКРС (70 кД). Возможно этот ген кодирует донуклеазу. Треть
рамку составляет ген env кодирует 515 аминокислот, составляющих
поверхностный гликопротеид gp51 трансмембранный белок gp30. В
противоположность рої - продукту gp30 выявляет большую гомологию с
вирусами лейкозов мышей, чем с вирусами лейкозов птиц, что позволяет
предполагать химерную природу ВЛКРС. На основании этих данных
высказывается предположение, что вирусы лейкоза крупного рогатого скота и
человека (ВЛКРС и HTLV) составляют отдельную таксономическую группу
ретровирусов. (Янушаускас, К.Т.,1972; Sagata N et al., 1985; Walford R.L., 1970;
Takashima I. 1982; Trowsdale J. 1991).
Длинные концевые повторы состоят из 530 пар оснований с обратным
повтором в 6 пар оснований на 5' и У - концах, фланкированных прямыми
повторами в 6 пар оснований из ДЬЖ хозяина. Непосредственно к 5' -LTR
примыкают сайт связывания с тРНК про для инициации синтеза минус - нити
ДНК. иЗ-участок содержит предполагаемые промоторы транскрипции (боксы
ЦАТ и TATA), но они содержат необычные последовательности (Ц-Ц-А-А-Ц-
Т и Г-А-Т-А-А-А-Т). U3 - участок содержит так же и усилительный элемент,
последовательности которого напоминают последовательности других
усилителей, в особенности иммуноглобулинового. Основной структурной
особенностью LTR ВЛКРС является удлиненный участок основании R 228 пар
оснований, который разделяет сигнал присоединения поли (А) (А-А-Т-А-А) от
поли (А) - сайта на 260 пар оснований. Предполагается, что длинный R-
участок образует шпилечную структуру на молекуле РНК, способствуя
соединению обоих терминирующих кодбнов и обеспечивая нормальную
терминацию цепи. Эти структурные особенности характерны и для LTR
HTLV; показана относительная гомология последовательностей (<50 %) между
ними, что свидетельствует об эволюционном родстве этих вирусов. Не
21 исключено что механизм биологического действия этих вирусов так же может
быть одинаков (Sagata. N., 1984; Bell J.I., Todd J.A., McDevitt H.O., 1989)
Анализ очищенных вирионов ВЛКРС методом электрофореза в SDS полиакриламидном геле или гельфильтрацией в присутствии гуанидин-гидрохлорида показал наличие в составе вирионов четырех главных негликозилированных белков (р24, р15, р12, р10) и двух гликозилированньгх компонентов (gp51 и gp30).
Белок р24 был первым выявленным структурным белком (Miller S.M., Olson С, 1972). Белок р24 был очищен до гомогенности и хорошо изучен. Белок является нейтральным и умеренно гидрофобным.
Несмотря на то что у р24 ВЛКРС, как и рЗО всех ретровирусов млекопитающих, амино- и карбоксильные аминокислоты представлены пролином и лейцином соответственно этот белок по химическому составу отличается от главного белка кора других ретровирусов. Тем не менее установлена статистическая гомология последовательностей между р24 ВЛКРС и главным белком р24 кора вируса Т- клеточного лейкоцитоза человека (HTLV) (Oroszlan et al., 1982). Моноклональные антитела к р24 ВЛКРС идентифицируют два различных антигенных сайта на молекуле белка (Brack С et al., 1982). Моноклональные антитела к р24 ВЛКРС идентифицируют два различных антигенных сайта на молекуле белка (Bruck С et al., 1983). В сыворотке инфицированных животных содержатся антитела к этим эпитопам.
Белок р15- слабый основной белок, не содержащий остатки метионина. Он является главным фосфопротеидом вирионов ВЛКРС (Uckret, Н. Wunderlich, 1979) и, как установлено в опытах по сшивке белков химическими реагентами, совокупность молекул р15 представлена двумя разновидностями: одни молекулы связаны с липидным слоем двухслойной мембраны вируса, другие - с вирусной РНК (Uckert и др., 1983).
Белок р12 — основной белок с высоким содержанием остатков глицина и пролина и, следовательно е.го молекула имеет низкий уровень вторичной организации. Опыты по сшивке химическими веществами показали, что р12 в
22 вирионе тесно связан с вирусной РНК (Uckert и соавт., 1983; Bignon, J.D.,
1990;). Сравнение последовательностей аминокислот белка р12 с продуктом
нуклеотидных последовательностей гена gag, клонированного из провируса
клеток опухоли, показало, что р12 располагается на СООН - конце первичного
транспортированного продукта гена gag. Также показана минимальная
изменчивость последовательностей р12 из двух изолятов ВЛКРС. Такой
минимальный генетически дрейф среди независимых изолятов дает
дополнительное подтверждение гомологии, установленной между р12 ВЛКРС
ир15 HTLV (Oroszlan et al., 1983; Dusinsky R., 1987; Davies C.J., 1991).
По аналогии с другими ретровирусами ВЛКРС должен содержать трансмембранный белок кодируемый геном env. В1984 Schults с соавт используя метод разделения вирусных белков на пористом стекле с последующей хроматографией в обратной фазе, выделил два белка оболочки ВЛКРС -gp60 и рЗО. Антисыворотка, полученная против gp60, реагировала так же с гликопротеидом с молекулярной массой 51-52 кД.
Впервые выявленный рЗО отличается gp30 ВЛКРС и обладает высокой гомологией с трансмембранными белками ретровирусов В- и С - типа, а так же с 3- областью env гена вируса Т- клеточного лейкоза человека.
Внутриклеточные предшественники белков вирионов ВЛКРС были выявлены иммунопреципитацией сыворотками определенной специфичности к экстрактам клеток, инфицированных ВЛКРС (Немейкайте, А. Й., 1990; Ghysdael et al., 1978; Cohn, M. Т., 1978; Mamonn et al., 1983)'или ооцитов Xenopus laevis, инъецированных 38S РНК ВЛКРС (Ghysdael et al., 1979).
Во всех случаях выявляли два полипептида с молекулярной массой 70кД (Рг 70gag) и 45кД (Pr 45gag), которые являются предшественниками р24, р15, р12 и рЮ. Недостаточно ясна зависимость между Pr 70gag и Pr 45gag; несмотря на то, что метионинсодержащие пептиды Pr 45gag имеются в Pr 70gag , все же маловероятно , что Pr 45gag происходит из Pr 70gag в результате протеолитического расщепления, поскольку соотношение Pr 70gag/Pr 45gag в инфицированных клетках остается одинаковым независимо от времени введения пульс — метки и не изменяется при метке клеток в присутствии
23 аминокислотных аналогов, которые явно ингибируют дальнейшее
протеолитическое расщепление. Кроме того, оба Pr 70gag и Pr 45gag,
синтезированные в лизатах ретикулоцитов по программе В ЛКРС 38S РНК,
содержатся в таком «же соотношении что и в инфицированных В ЛКРС клетках
(Ghysdael et al., 1979 Немейкайте, А. Й., 1990).
По-видимому, Pr 70gas и Pr 45gag синтезируются независимо, возможно, на
различных популяциях 38S и РНК.
1.2 Динамика репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота в
клеточных культурах.
Вирус лейкоза впервые удалось обнаружить в краткосрочных культурах лимфоцитов крови 'инфицированных животных (Miller et al., 1969). ВЛКРС репродуцируется в перевиваемых хронически инфицированных культурах клеток тканей животных разных видов. Наибольшее распространение в мире получила перевиваемая линия клеток FLK-BLV, которую получил в 1974 г. Van der Maaten путем кокультивирования эмбриональных клеток почки овцы с лимфоцитами лейкозной коровы. Эта линия клеток используется для биохимических, морфологических и серологических исследований (Sherman et al., 1992; Van der Maaten et al, 1974-1976; Yoshivaka et al., 1986).
В настоящее время получены и широко используются перевиваемые хронически инфицированные ВЛКРС линии клеток: фибробласты легкого эмбриона коровы (АИД-15); почки эмбриона коровы (ПЭК); почки эмбриона овцы (FLK-BLV); легкого эмбриона летучей мыши (Тбі-Lu); легкого макаки-резус (BLV- Simian); селезенки овцы (FLS, S-1228); тимуса эмбриона коровы (T3K-MBA-766LmTT) (Brack et al, 1982; Ferrer, 1980; Yoshivaka et al, 1986). Большинство экспериментальных работ по изучению структуры ВБЛ и биосинтеза вирусных компонентов выполнены с использованием культуры FLK- BLV (Van der Maaten et al, 1974; 1976). Эта клеточная линия является
24 лучшим продуцентом вируса; на одну клетку FLK- BLVb среднем приходится 600 копий вирусоспецифической РНК.
Позднее получена новая линия FLK(Fetal Lamb Kidney) - BRV (почка плода овцы и лимфоцитов), используемая для изучения морфологии ВЛКРС. В 1991 г. получен новый штамм почки эмбриона коровы М 118 ВСКК (П) для культивирования ВЛКРС и накопления вирусной биомассы с целью приготовления иммунодиагностических и профилактических препаратов (Немейкайте, А. Й.э 1990; Рачкус Ю. А..с соавт., 1991). Продукция вируса зависит от концентрации эмбриональной сыворотки в ростовой среде и снижение её с 10 до 5,0 или 2,5 % приводит к снижению продукции вируса на 40 и 80 % соответственно. Усиление репродукции вируса наблюдали при добавлении в ростовую среду 20 мкг/мл инсулина. Добавление дексаметазона ингибирует репликацию и снижает выход вируса на 50 %. ФГА, Кон-А и липополисахарид не оказывали заметного действия. Культивирование клеток FSK-BLV на микроносителях типа Цитолар или Cytodex повышает урожай вируса в 3-4 раза по сравнению с роллерным или стационарным режимами культивирования.
Методом клонирования FSK- BLV получены сублинии, различающиеся по уровню продукции вируса (Mamoun et al., 1981). Репродукция вируса в 3-х из 18-ти клонированных сублиний в стационарном режиме была на уровне родительской линии в роллерных установках. Роллерный режим позволяет значительно снизить расход среды: 10-кратное увеличение площади монослоя при 2-кратном увеличении расхода позволяет получить сіл культуральной среды до 2 мг gt*51 ВЛКРС. Максимальный урожай вирусного АГ получен в культуре FSK-BLV, с использованием сыворотки крови лошади. Урожай вирусного АГ в культурах, выращенных на сыворотке крови безмолозивных телят, плодов коровы и коров был ниже и составил ОД 89, 0116 и 0,025 мг/мл соответственно (Lesnik et al., 1989). В большинстве случаев с момента установления инфицирования клеток наблюдалось увеличение продукции вируса на протяжении нескольких начальных пассажей, затем продукция вируса снижалась или исчезала. Однако, клетки FLK и ТЭК-МВА-76 сохраняют реїтоодукцию вируса на высоком уровне на протяжении многих пассажей (свыше 200). AT против gp51 вируса, в отличие от AT к р24, подавляют
репликацию вируса в краткосрочных культурах лимфоцитов. Ингибирование экспрессии вирусного генома происходит только в том случае, если в ростовую, среду добавляют плазму крови инфицированных животных (Немейкайте, А. Й., 1990; Прохватилова, Л. Б., 1998). Именно она содержит фактор, блокирующий экспрессию вирусного генома в культуре лимфоцитов (Tsukyama., 1985). Блокирующий фактор выявлен в плазме крови 16-ти из 22-х инфицированных коров, и 2-х из 17-ти свободных от BLV коров (Gupta et al., 1989). Ингибирующим действием на экспрессию вирусного генома обладали лизаты тромбоцитов крови, инфицированных и свободных от ВБЛ KopoB(Tsukyama., et al., 1987). Репликация ВЛКРС в культурах клеток не сопровождается деструкцией чувствительных клеток и не проявляется разрушением монослоя. Однако, в отличие от других известных ретровирусов ВЛКРС индуцирует образование синцитиев в монослойных культурах ^трансформированных клеток КРС, овец, коз, человека, обезьян и летучих мышей.
Наиболее чувствительными клетками-мишенями являются монослойные культуры клеток селезенки эмбриона КРС на ранних пассажах. Инфицированные ВЛКРС клетки индуцируют формирование синцитиев в монослойных культурах клеток крыс, трансформированных вирусом саркомы Рауса (ХС-клетки) в культурах клеток кошек, трансформированных вирусом саркомы мышей (СС81-клетки (Пальцев М.А., 1995; Ferrer., 1980). Бесклеточные препараты ВЛКРС такжа индуцируют образование синцитиев и чувствительных клеток. УФ-облучение, обработка ультразвуком, прогревание при 56 в течение 30 мин, замораживание и оттаивание полностью инактивирует синцитийобразующую активность препаратов ВЛКРС.
Для стимуляции продукции вируса лейкоза и его АГ в перевиваемых культурах клеток (FLK-BLV) и (ТЭК-МВА-76) рекомендован инсулин (Кондричева.Н.Н., 1996). Однако вопросы культивирования линии клеток, персистентно продуцирующих ВЛКРС, определение оптимальных условий осаждения, очистки и концентрирования вируса лейкоза с целью получения, максимального количества специфических и высокоактивных диагностических препаратов к началу наших исследований требовали своего решения. Кроме
того, накопление биомассы культур клеток, содержащие значительное количество ВЛКРС, открывает возможности разработки технологии получения инактивированного иммуногена для создания специфического иммунитета у телят к ВЛКРС (Жданов В.М. соавт., 1974; Головченко В.П. с соавт., 1979; Ferrer etal., 1973; Xu. А.,1992; Stear M.J.,1998 ).
1.3 Методы выявления инфицированных вирусом лейкоза животных.
Особенности течения лейкоза свидетельствует о том, что клиническим и патологоанатомическим изменениям предшествует довольно продолжительное нарушение гемопоэза. Заболевание в большинстве своем развивается постепенно и незаметно. В течении нескольких лет общее состояние животного, упитанность, молочная продуктивность и воспроизводительные функции не вызывают подозрения на лейкоз. В этот период в периферической крови обнаруживаются количественные и качественные изменения морфологической картины. В дальнейшем при прогрессировании болезни в зависимости от локализации и степени поражения органов появляются разнообразные характерные клинические симптомы.
Длительность бессимптомного течения лейкоза у крупного рогатого скота и многочисленность пораженных животных в этом периоде болезни явилось основанием для введения понятии субклинической (гематологической) и клинической (опухолевой) стадии лейкоза.
Соответственно этому и были разработаны гематологический и клинический методы, основанные на качественных изменениях клеточных элементов крови кроветворных органов (Бурба Л.Г.,1983; Кузнецова Н.В., Николаева Н.В., Никольская Т.А., 1993; Узуев Т.М.,1994; Симонян Г.А., 1995Г Хисамутдинов Ф.Ф.,1997; Смирнов, Ю.П., 2001; Bendixen Н. J., 1973; Collins W.M., 1980; Shmutz S.M., 1991).
Периферическая кровь отражает почти все патологические процессы, протекающие в организме явно или скрыто. Еще в 1954г. Р. Гётце и соавторы установили что при лейкозе крупного рогатого скота увеличение количества лейкоцитов в - крови в большинстве своем происходит за счет
27 лимфоцитоподобных клеток (мононуклеаров). На основании этого ими была
создана схема упрощенной диагностики лейкоза, названная "леикозным
ключом" Гётце. Сущность ее заключалась в оценке двух показателей белой
крови (количества лейкоцитов в 1мкл крови и процента лимфоцитов в
лейкоцитарной формуле).
В последующем были внесены соответствующие коррективы для усовершенствования гематологического метода диагностики. Так Г. Бендиксен (1960) и Г. Винквист (1961) предложили диагностировать лейкоз по абсолютному количеству лимфоцитов в 1мкл крови. При этом для пяти возрастных групп животных предусматривалось определенное количество лимфоцитов, характерное для здоровых, подозрительных и больных лейкозом животных.
На данном этапе исследование десятков тысяч крупного рогатого скота показали, что наиболее вариабельными являются показатели красной крови, т.е. количество эритроцитов и содержание гемоглобина в 1мкл крови, которые не имеют диагностического значения при лейкозе. Количество лейкоцитов и процентное содержание белых кровяных телец обладают в большинстве своем определенным постоянством состава. В ряде случаев они подвергаются незначительным количественным изменениям, обуслбвленным теми или иными функциональными состояниями организма. Однако эти изменения не стабильны, обратимы и при повторных исследованиях через 1,5 месяца исчезают. Сравнительное значимое изменения в показателях белой крови наблюдаются в связи с возрастом животных, что находит отражение в "лейкозном ключе" (СимонянГ.А., 1975)
"Лейкозные ключи" выявляют больных с повышенным количеством лейкоцитов и лимфоцитов крови. Однако с их помощью не удается выявить случай с лейкопеническим и алейкемическим составом крови.
При гематосаркомах и значительном опухолевом поражении органов лимфоидной ткани замедляется, а затем и полностью прекращается лимфоцитообразование и поступление их в периферическую кровь. Поэтому в конце болезни сублейкемический уровень лейкоцитоза может снизиться до
28 алейкемического уровня, лимфоцитоз сменяется относительной нейтрофилией.
При этом в мазках крови обнаруживают единичные опухолевые 'клетки.
Вместе с тем при многообразии форм болезни количественное и качественное
содержание лейкоцитов не всегда отражает характер поражений кроветворных
органов (Симонян Г.А., Хисамутдинов Ф.Ф., 1995).
Симптомокомплекс при лейкозе крупного рогатого скота обусловлен
функциональными нарушениями и морфологическими изменениями в органах
«
и тканях кроветворной и негемопоэтическбй системы. Характер клинических симптомов зависит от опухолевого поражения той или иной системы органов, а полнота их проявления - от стадии течения лейкозного процесса. (Шишков В.П., 1980; Соловьев Ю.В., 1988; Хайрулин М.3.,1998; Татарчук А.Т., 1998; Bodmer W.F.,1981; Bernoko D., 1994)
По мнению В.П. Шишкова, Л.Г. Бурба (1988) в предлейкозном состоянии и начальной стадии болезни клинические симптомы обычно отсутствуют при сохраненной продуктивности и воспроизводительной функции животного. Первые клинические признаки появляются в развернутой стадии лейкоза и прогрессируют по мере дальнейшего развития лейкоза. Переход гематологической (субклинической) стадии в клиническую часто происходит после отела, при интоксикации, присоединении вторичной инфекции и стрессовых ситуациях.
Помимо органов кроветворения часто в патологический процесс вовлекаются другие внутренние органы, не имеющие непосредственного отношения к кроветворению. Поэтому клинические симптомы подразделяют на специфические, характеризующие лейкоз, и неспецифические, отображающие функциональные нарушения той или иной системы органов вследствие их опухолевых поражений (Румянцев, 1972; Васильев Н.Т с соавт., 1975; Симонян Г.А с соавт., 1975; Нахмансон В.М., 1986; Смирнова П.Н., 1992; Мандыгра Н.С., 2000; Магер С.Н., 2006; Miller S.M., 1974; Onuma М.,1976; Park С.А., 1991)
Неспецифические клинические симптомы представляют собой расстройства общего характера, которые могут наблюдаться при многих
29 болезнях. Они не отражают особенностей клиники лейкоза и поэтому не
имеют решающего значения. Вместе с тем эти симптомы в сочетании с
показателями крови1 могут быть использованы в диагностических целях и при
определении состояния лейкозного процесса. Неспецифические симптомы
чаще всего выражаются в ухудшении общего состояния животного, плохом
усвоении кормов, отсутствии аппетита, снижении удоя, быстрой
утомляемости, недомогании и прогрессирующем исхудании. При поражении
желудочно — кишечного тракта наблюдают расстройство пищеварения,
ослабление сердечной деятельности, цианоз и желтушность слизистых
оболочек, нарушения дыхания, отеки в области подгрудка, живота, вымени и
подчелюстного пространства (Кудрявцева Т.П., 1981).
При сдавливании нервных стволов конечностей или прорастании лейкозной опухоли в спинномозговой канал отмечаются хромата на одну или обе задние конечности и слабость, животное с трудом встает или вообще не поднимается (Бурба Л.Г., 1983).
Поражение мочевого пузыря или преддверия влагалища сопровождается затруднением выделения мочи, а поражение матки - абортом и яловостью. Опухоли в половых путях часто препятствуют развитию плода или нормальному отелу. В 5 % случаев наблюдаются увеличение одной или нескольких долей вымени, инфильтрация подкожной клетчатки вымени.
Характерные 'симптомы выражаются в увеличении поверхностных (предлопаточных, околоушных, подчелюстных, надколенных, надвыменных и др.) и доступных ректальному исследованию внутренних лимфатических узлов, селезенки и печени, в появлении опухолевых разрастаний в различных частях тела, органах и орбитах глаз (Симонян Г.А., 1975).
Характер и степень поражения лимфоузлов бывают различными в зависимости от формы болезни. Различают три формы опухолевого поражения животных: системное (генерализованное) поражение лимфатических узлов, преимущественное поражение кожи и подкожных лимфоузлов. Генерализованное Поражение встречается реже, чем поражение регионарных. Внутренние лимфоузлы поражаются чаще наружных. В этом случае
изменения касаются: глубоких паховых лимфоузлов, опухолевые разрастания стенок матки, мочевого пузыря, под крестцовыми и поясничными позвонками - мелкие опухолевые образования. Иногда вся тазовая полость бывает заполнена опухолями. Кудрявцева Т.П., 1981; Емельяненко П.А., 1982; Авилов В.М., 1995; BruckC, Chander S, Ноге W, GreigA., 1976)"
К специфическим клиническим симптомам относится и увеличение селезенки, границы которого легко установить при перкуссии. Степень поражения селезенки зависит от формы болезни. При лимфолейкозе и остром лейкозе селезенка увеличивается в несколько раз, достигая массы 25кг и размера ЮОхЗОхЮсм. Сильное увеличение селезенки сопровождается высоким лимфоцитозом в периферической крови. При умеренном увеличении одной лишь селезенки общее состояние животного, продуктивность и воспроизводительная функция остаются долгое время в пределах нормы. Однако последующее вовлечение в процесс лимфатических узлов способствует быстрому прогрессированию болезни и появлению других симптомов (Кудрявцева, Т.П., 1980; Дун, Е.А., 1982; Коромыслов, Г.Ф., 1984; Кузнецова, А.В., 1995; Галеев Р.Ф., Хакимов Э.Н., Самигуллин И.Ш., Гареев К.А., 1999; Кудрямов А.А., 1999; Карягин, А.Д., 2001; Johannsen R., 1981 Joosten I. 1998; Lewin H.A, Bernoco D., 1986;)
Наряду с энзоотическим лейкозом крупного рогатого скота -отмечается и лейкоз молодняка с нередким опухолевым поражением зобной железы. При этом наблюдаются затрудненное дыхание, хрипы и слизистое течение из носовой полости. Диагноз ставят по увеличенным лимфатическим узлам. В некоторых случаях встречается кожная форма лейкоза, описанная H.Bendixen (1963). На теле животного появляются узелковые припухлости по 2,5см в диаметре, хорошо заметные на шее, спине, крестце и бедрах. В течении нескольких недель происходит облысение припухлости, ее поверхность покрывается корочкой, состоящая из эпителия и экссудата. Корочки отпадают, облысевшие участки вновь покрываются шерстью. Однако через несколько месяцев после кажущегося выздоровления наступает рецидив с появлением
31 тех же признаков болезни. Происходит инфильтративное поражение
внутренних органов, и животное погибает.
Таким образом, характерные клинические признаки, а так же опухолевые поражения брюшной и тазовой полостей, устанавливаемые ректальным исследованием, являются достоверными диагностическими признаками лейкоза. Неспецифические симптомы, отражающие опухолевые поражения внутренних органов, только в сочетании с показателями крови приобретают диагностическое значение (Симонян Г.А., 1975; Кудрявцева Т.П., 1981).
Цитоморфологический метод является одним из современных методов морфофункциональных исследований, позволяющий углубленно изучать процессы, происходящие на клеточном, субклеточном и молекулярном уровне, .которые позволяют более четко дифференцировать патологические лейкозные клетки от клеток нормального кроветворения, Цитоморфологический метод позволяет установить характер патологического процесса, протекающего со скрытыми или выраженными клиническими симптомами. Этот метод является как бы связывающим звеном между клиническим, гематологическим и патоморфологическими исследованиями. При этом часто представляется возможность установить начальную стадию болезни, изменение отдельных органов при отсутствии видимых признаков на вскрытии животного. Ещё на заре изучения лейкоза сельскохозяйственных животных помимо увеличения количества лейкоцитов в периферической крови обнаруживали незрелые или недифференцированные клетки, названные лимфоидоцитами, ридеровскими или лейкозными клетками (Мусиенко П.М., 1988; Кузмичев B.C., 1991; Ильницкий А.П., Колпакова А.С., Смирнова Ю.П., Щербак Н.П., 1993; Логинов СИ., 19,99; Мандыгра Н.С., 2000; Walford R.L., 1970; Caldwell J., Bryar C.F., Cumberland P. A., Weseli D.I., 1977; Casati M.Z.,1991; Van EijkMJ.T., 1992)
Под патологическими, опухолевыми и молодыми клетками подразумевают недифференцированные или малодифференцированные клетки гемопоэза различной степени зрелости, все возможные клетки атипичной морфологии, ридеровские и двуядерные формы лимфоцитов, крупные
32 многоядерные клетки и др (Шулер, Д., 1972; М.И. Гулюкин М.И., Дун Е.А.,
Н.В. Замараева Н.В., 2000)
При обнаружении в крови свыше 3 % малодифференцированных или атипичных клеток животное независимо от абсолютного содержания в крови лейкоцитов, рассматривается как подозрительное по заболеванию лейкозом.
Все клеточные элементы крови и кроветворных органов, встречаемых как у здоровых, так- и больных лейкозом животных, в зависимости от степени зрелости, морфологической структуры и принадлежности к кровяным или тканевым элементам подразделены на четыре группы.
М.И. Гулюкин, Л.Г. Бурба, Л.А. Иванова, А.В. Васин (1987) пришли к выводу, что появление в крови молодых атипичных клеток и увеличение их количества зависят от степени и характера поражения кроветворных органов.
Г.А.Симонян, П.Д.Колчин, Н.Т. Кочетова (1990) считают, что для ранней стадии всех форм лейкоза диагностическое значение приобретает повышенное количество клеток первой группы и, в частности лимфоцитов. Увеличение количества лимфоцитов в периферической.крови не вызывает сомнения, что какая-то часть из них уже является лейкемической по своей природе. Поэтому необходимо установить возможность наличия морфологических отличий между лимфоидными элементами крови здоровых и больных лейкозом животных.
Еще в 1958 году Грудманн и др. обнаружили в лимфатических узлах и селезенке два вида лимфоцитов. Одни из них морфологически характеризуются одной большой отчетливой нуклеолью в ядре, расположены в фолликулах лимфоузлов и селезенки и поэтому названы фолликул-лимфоцитами. Другие, малые лимфоциты, расположены в синусах лимфоузлов и красной пульпе селезенки, отличаются несколькими мелкими нуклеолями и названы синус-лимфоцитами. Морфологическое различие двух групп лимфоцитов, выявляемых в лимфоузлах и селезенке, сохраняется и в периферической крови и обнаруживают это различие при определенных методах окраски мазков (по Штокингеру-Кёльнер).
33 Д. Урбанек (1967) установил в крови крупного рогатого скота 79 %
синус-лифоцитов и 13 % фолликул-лимфоцитов. По данным Зайльса (1967) 50
% клеток составляют синус-лимфоциты, 25 %- фолликул-лимфоциты и
остальные 25 % - недеференцированные клетки.
Исследования, проведенные Г.А. Симоняном и Ф.Ф. Хисамутдиновым
(1995) показали, что у здорового крупного рогатого скота в отличие от людей в
крови превалирует многоядрышковые клетки, т.е. синус-лимфоциты. При
среднем содержании синус-лимфоцитов 60,4 % (с колебаниями 44-68 %) число
фолликул-лимфоцитов составило в среднем 21,2 % (с колебаниями 8-30 %). У
остальных 18,4 % клеток нуклеоли в ядре отсутствовали (с колебаниями 10-25
У больных лейкозом животных с сублейкемической картиной крови отмечали некоторое увеличение среднего количества полиядрышковых лимфоцитов (61,7 %) с заметным расширением пределов колебания (31-85 %). Строгой закономерности увеличения процента синус-лимфоцитЪв в связи с нарастанием количества лейкоцитов не наблюдалось. У одних животных с лейкоцитозом 26тыс/мкл процент синус-лифоцитов был равен 80, а у других с количеством лейкоцитов 50тыс/мкл - только 35.
По мнению Г.А. Симоняна и Ф.Ф. Хисамутдинова (1995) существенной разницы в соотношении синус - и фолликул-лимфоцитов у здоровых и больных в начальной стадии лейкоза почти не обнаружено. Они объясняют это сравнительным доброкачественным течением хронического лейкоза. А повышение процента синус-лимфоцитов у некоторых больных связывают с начавшейся тенденцией к дальнейшему увеличения количества лейкоцитов в крови.
У коров с лейкемическим составом крови суживается предел колебания (52-78 %) синус-лимфоцитов и увеличивается среднее количество их до 63,3 % за счет уменьшения процента недифференцированных и фолликул -лимфоцитов. С ' прогрессированием лейкозного процесса зачастую наблюдается усиленная пролиферация синус - лимфоцитов. Следовательно, в большинстве случаев при хроническом лейкозе у крупного рогатого скота,
34 протекающем с высоким лейкоцитозом и лимфоцитозом в крови, темпы
кяеткообразованйя синус - лимфоцитов несколько опережает темпы
образования фолликул - лимфоцитов.
К одним из методов диагностики лейкоза можно отнести тест активности рибосомных цистронов лимфоцитов крови при лейкозе.
В интерфазной клетке функционирующие кластеры рибосомных образуют "интерфазные" ядрышковые организаторы (ЯОР), которые при использовании соответствующих методических приемов выявляются в виде (нуклеолей), расположенных в ядре хромосом и играют существенную роль в контроле пролиферации и синтезе белков. Число ЯОР тесно коррелирует со временем удвоения клеток (Other et al., 1992; Hoang-Xuan M., Charron D., Zilber M.T., Levy D.s 1982; Fries R. 1988) и является одним из важных показателей оценки пролиферативной активности клеточных популяций (McGary D.R., 1970; Lunden А., 1990; Crocer.,1999). Наблюдаемое при лейкозе крупного рогатого скота повышение количества лейкоцитов в периферической крови за счет лимфоцитов, увеличение лимфатических узлов, селезенки, а так же инфильтрация клеточными элементами лимфоидного происхождения других -это проявление клональной экспансии популяций лимфоидных клеток (Галеев Р.Ф.,1999; Кудрямова А.А., Петров Н.И., 1999).
ЯОР расположены в ядре лимфоцитов в виде округлых нуклеолей окрашивающихся раствором коллоидного серебра в темно-коричневый цвет.
Индекс ЯОР в популяции положительно реагирующих в РИД коров (п=22) составляет 2,50-3,86 при его среднем значении по группе 3,15 ± 0,08. У животных контрольной группы индекс ЯОР бывает 1,17 -2,86, при среднем значении популяции 2,09 ± 0,55, что достоверно (Р< 0.01) ниже данного показателя у подопытных животных. Исследование, проведенное через год, показало, что у оставшихся 10 животных, положительно реагирующих в РИД, индекс ЯОР был в диапазоне 3,62-4,62 (при среднем значении 4,22 ± 0,11), тогда как средний индекс ЯОР в контрольной группе оставался практически прежним 2,11 ± 0,31 (Р< 0.001).
35 Следовательно, средний индекс ЯОР у животных, положительно
реагирующих в РИД, по истечении года достоверно увеличился (Р<0.001)
(Sigurdardettir S., 1988; SpoonerR.L., 1978)
По мнению Г.Н. Сердюка, Ю.В. Силина, Т.П. Сторожилова (1996) в клеточных популяциях in vivo, то есть в условиях организма*, повышение индекса ЯОР отражает усиление пролиферативного потенциала данной системы. Как на первом, так и на втором этапе исследования наблюдаются достоверные различия по данному параметру между здоровыми и положительно реагирующими по РИД животными.
Исходя из полученных результатов Г.Н. Сердюк, Ю.В. Силин, Т.П. Сторожилова (1996) пришли к выводу, что вирус лейкоза крупного рогатого скота, интегрируясь в геном гемопоэтических клеток, приводит к существенному изменению регуляции гемопоэза животных, что в свою очередь вызывает значительное повышение активности ^рибосомных цистронов и увеличивает индекс ЯОР лимфоцитов периферической крови.
Для диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в нашей стране с 1985 года используется реакция иммунодиффузии (РИД) в агаровом геле с гликопротеидным антигеном ВЛКРС, которая считается сравнительно надежным и доступным диагностическим серологическим методом (Шишков В.П. соавт., 1986; Нахмансон В.М. с соавт., 1983- 1997; Петров Н.И., 1997; Гулюкин М.И. с соавт., 1999- 2000; Смирнов Ю.П., 1999; Мандыгра Н.С., 2000). С использованием серологической диагностики разработаны методы оздоровления неблагополучных по лейкозу популяций крупного рогатого скота, основанные на выявлении инфицированных животных в стаде, выращивании здорового молодняка и постепенным вытеснением инфицированных коров здоровыми нетелями (Гусев А.А. с соавт., 1987; Донник И.М., 1995; Мандыгра И.С., 1995; Смирнов Ю.П, 1995; Крикун В.А., 2002). Однако в процессе оздоровления хозяйств от лейкоза с использованием реакции иммунодиф фузии в некоторых случаях возникают трудности, связанные: с низкой
36 чувствительностью РИД, с так называемым выпадением реакции, с невозможностью ее использования для телят возраста менее 5 — 6-ти месяцев, с явлением иммунной толерантности, когда наблюдают вирусоносительство без антителообразования (Смирнов Ю.П., 1999; Крикун В.А., 2002).
Многие авторы рекомендуют метода прямого обнаружения провируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью молекулярно-генетического анализа на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая зарекомендовала себя как надежный, специфичный, достоверный и чувствительный. тест для раннего выявления инфицированных ВЛКРС животных. С помощью ПЦР удается обнаруживать даже деградированную ДНК или РНК, оставшуюся после разрушения вирусных частиц, присутствующую в следовых количествах. Установлено, что около 16 % молодняка крупного рогатого скота, имеющего отрицательные показатели в РИД, содержат в геномной ДНК провирус ВЛКРС, который может быть выявлен только при помощи ПЦР. Полимеразную цепную реакцию можно с успехом использовать для определения источника инфекции в стадах, при племенной продаже, профилактике, для выявления случаев скрытого вирусоносительства и на заключительных этапах искоренения ретровирусной инфекции (Климова Г.В., 1995; Р.В.Облап Р.В., с соавт., 1996; Кузнецова Н. В., с соавт., 1997; Петров Н.И., 1997; Прохватилова Л.Б., с соавт., 1997; Калашникова Л.А., с соавт., 1999; Панин А.Н., 1999; Орлянкин Б.Г с соавт., 2000; Прохватилова Л. Б., с соавт., 2001; Макаров В.В., 2005).
1.4. Передача вируса лейкоза крупного рогатого скота в естественных условиях и в эксперименте.
Большое значение в предотвращении распространения лейкоза крупного рогатого скота, скорейшей ликвидации этого заболевания имеет изучение путей передачи возбудителя. Известно, что ретровирус передается
37 вертикальным и горизонтальным путями (Кукайн Р.А. с соавт., 1975; Р.Ф.
Галеев Р.Ф., Руденко А.А., Валиев Ф.Р., Абубакиров P.P., 2003; Larson et al.,
1970; Chander.,1976; Straub and Lierenz, 1976; Kettman R.,1976; Hines
Н.С.,1991).Вертикальная передача ретровируса лейкоза крупного рогатого скота
определяется как пренатальное инфицирование плода ретровирусом или
постнатальное заражение новорожденного теленка через молозиво и молоко от
матери потомству (Hines, Н.С. 1984; Kuzmak J., 1999).
При горизонтальном инфицировании ретровирус лейкоза передается крупному рогатому скоту контактно, перорально и другими путями (Крикун В.А.с соавт., 1980-1984; Крикун В.А., 1985; Piper et al, 1975; Straub., 1978). Предполагают, что при горизонтальном распространении вируса одним из путей его передачи является проникновение через кожу посредством кровососущих насекомых или при хирургических операциях (взятие крови, парентеральное введение препаратов). Эти предположения подтверждены (Шишков В.П. и др., 1986; Крикун В.А., 1991; Bech- Vielsen et al., 1978; Avram et al., 1980). Возможность передачи ретровируса минимальным количеством вируссодержащего материала доказана экспериментально. Так, Van Der Maaten and Miller (1977) показали, что заражение коровы ретровирусом лейкоза происходит после введения внутрикожно 2500 лимфоцитов (0.0005 мл цельной крови) от инфицированного животного.
Интересен опыт, проведенный Oshima et al (1981) по передаче ретровируса кровососущими насекомыми, в условиях приближенных к естественным, от больной лейкозом коровы на ягнят 4 - 5-ти месячного возраста. Три подопытных и один контрольный ягненок с коротко остриженной шерстью содержались в отдельных клетках, защищенных сеткой от гематофилов. Кровососущих насекомых, еще не полностью насосавших кровью у инфицированной БЛВ коровы, отлавливали и помещали в баночки, которые прикреплялись на тело подопытных ягнят. В течение 4-х дней на каждого ягненка было посажено 130-140 гематофилов. Все подопытные ягнята заразились, что подтверждено появлением у них в крови на 38-40 день антител против ретровируса, тогда как у контрольного ягненка антитела отсутствовали в течение трех месяцев (срок наблюдения}.
38
Исследователи пришли к выводу, что молозиво и молоко являются
потенциальным источником в горизонтальной передаче ретровируса лейкоза и
наиболее легким путем инфицирования (Докукин И.С, 1971; Коломиец А. Г и
др., 1979; Симонян Г.А. и Бражин Е.Ф., 1980; Straub., 1971;
Mammerickx..,1972; Seger and Morgan., 1976).
Эти сообщения согласуются с данными В.П.Шишкова и др. (1980), которые выявили БЛВ в лейкоцитах молока больного лейкозами крупного рогатого скота и вызывали у овец ретровирусную инфекцию после введения парентерально молока от этой коровы. Вирус в молоке, экспериментально инфицированной ретровирусом лейкоза коровы, появлялся через 15 дней после инокулирования.
Onurna et al., (1975) при длительном культивировании лейкоцитов молока от коров, инфицированных ретровирусом лейкоза крупного рогатого скота, выявили продукцию БЛВ. В опытах З.Н.Меньшикова, В.А.Крикун (1979 -1984), Bederke et al (1970), Straub et al (1974) доказано, что молоко от больных лейкозом коров не только содержит вирус, но и способно вызывать инфицирование телят и ягнят.
Сейчас не вызывает сомнений, что ретровирус лейкоза крупного рогатого скота находится в цельной крови, плазме, сыворотке крови, молозиве и молоке (Парфанович М.И. и др., 1978; Miller and Van Der Maaten.,1974 -1979).
Из слюны, мочи, фекалий и семени больных лейкозами животных ретровирус не выделен (Miller and Van Der Maaten., 1977). По данным Ressang, Mastenbroeck and Quak (1980) БЛВ не обнаружен на кожных покровах, в моче и сперме, хотя у экспериментально инфицированных быков выявляли антитела к ретровирусу в жидкости предстательной железы и у 21-го инфицированного животного слюна содержала антиген БЛВ. Считают, что семя от быков, инфицированных ретровирусом, не представляет серьезной опасности при искусственном осеменении. Отсутствие БЛВ в сперме установлено исследованиями Miller and Yan Der Maaten (1979) и В.П.Шишкова (1980), которые не вызвали онкорнавирусную'инфекцию у овец после инокуляции им спермы
быков, инфицированных ретровирусом лейкоза. Тогда как В.А.Крикун (1982), Lucas et al (1980) показали в эксперименте инфекционность спермы бьжов и баранов.
Бельгийские ученые Mammerickx and Derzelle (1969), Mammerickx (1972) предполагают, что естественное заражение плода от матери происходит в пренатальный период чаще всего и фактор, вызывающий лейкоз, может присутствовать в молоке. В 1970 году Olson et al., анализируя три семейства коров, подтвердили вертикальную передачу вируса лейкоза от инфицированных коров потомству. Это согласуется с данными Н.И.Петрова (1988), С.В.Калина (1990), А.С. Опаносюк, (1990), В.А. Крикун, (1999) Р.Ф. Танеева (1999 -2007), В.И. Колесникова, (2002), Wittmann (1970), о возможности вертикальной передачи вируса плоду во внутриутробный период или после рождения через молозиво и молоко от инфицированной ретровирусом лейкоза матери.
Однако пренатальная передача ретровируса лейкоза крупного рогатого скота не является основным его путем распространения, большинство животных инфицируются другими путями (Fen-er and Piper., 1978; Piper et al., 1979)7 Подтверждением этого положения явилось исследование Bech- Nielsen et al (1978), которые в стаде, где 95 % взрослых животных были инфицированы БЛВ, выявили только у 14 % новорожденных телят в сыворотках крови антитела против ретровируса лейкоза до приема молозива.
Интересные результаты получили С.A. Diglio and J.F. Ferrer (,1976) в своих исследованиях в- стаде с высоким процентом инфицированных ретровирусом животных. Ими установлено, что около 90 % телят после приема молозива имели антитела к БЛВ, но лишь 19 % из них были вирусоносителями. Авторы сделали вывод, что большинство телят получают материнские антитела к ретровирусу с молозивом и для выделения инфицированных телят в это время лучше всего применять методы, позволявшие выявлять вирус, такие как тест синцитиеобразования (Крикун В.А., 1999; Петров Н.И., 1999; Смирнов Ю.П., 2000).
В другом опыте, исследуя животных изолированного стада с множественными случаями лейкоза в РИД с гликопротеидгщм антигеном ретровируса, Ferdinand et al (1979) обнаружили у 59 % новорожденных телят
антитела к БЛВ после приема молозива и молока. Исходя из результатов своих наблюдений, авторы предлагают для предохранения телят от дальнейшего перезаражения следующие мероприятия:
Характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота
Лейкоз крупного рогатого скота относится к заболеваниям опухолевой природы - гемобластозам, основным признаком которых является злокачественное разрастание клеток кроветворной ткани и нарушение их созревания (Шишков В.П., Бурба Л.Г., 1988; Нахмансон В.М. соавт.,1995; Гулюкин М.И., 1999; Крикун В.А., 2002; Галеев Р.Ф. 2003; Магер С.Н., Храмцов В.В., 2005)
По мнению В.М. Лемеша (1990), клинический лейкоз характеризуется как персистентный лимфоцитоз или лимфоцитарная неоплазия.
Это заболевание регистрируется во многих странах мира, что выдвигает проблему опухолевого роста в число наиболее сложных задач медицины и ветеринарии (Onumaetal., 1984; Кудрявцева Т.П., 1980;).
В естественных условиях крупный рогатый скот заражается вирусом лейкоза главным образом горизонтальным путем, но может и конгенитальным способом. У инфицированного животного развивается сильный и постоянный гуморальный ответ на структурные белки вируса. Место и механизм персистенции вируса неизвестны. В большинстве случаев инфицированные животные остаются здоровыми и не снижают продуктивности.( Нахмансон В.М., Дун Е.А., Бурба Л.Г., Кузин, А.И.,1997; Крикун В.А.,1984, 2002; Магер С.Н., Храмцов В.В., 2005; Stear M.J., Dimmock С.К., Newman M.J., Nickolas F.W., 1988)
В зависимости от многих факторов, включая генетические и факторы окружающей среды, у 30 -70 % инфицированных животных развивается одна из форм болезни, известная как персистентный лимфоцитоз. Персистентный лимфоцитоз характеризуется увеличением количества циркулирующих в крови В - лимфоцитов, о чем свидетельствует наличие поверхностных иммуноглобулинов и Fc-рецепторов на циркулирующих клетках.
Вирус лейкоза присутствует в субпопуляции циркулирующих В лимфоцитов животных с персистентным лимфоцитозом (Валихов А.Ф., 1976, 1978; Жавненко В.М., 1988; СВ. Зеливянский СВ., Карпов В.А., В.В. Баурин В.В., 1994; Paulsen J., 1977; KettmannR., 1980). R. Kettmann (1980) установил что генетическая информация вируса лейкоза включена в различных сайтах клеточной ДНК В- лимфоцитов. Кроме того, циркулирующие при персистентном лимфоцитозе, лимфоциты являются поликлональными, исходя из сайтов интеграции провируса, они еще не имеют хромосомных аномалий.
Основываясь на цитологических, цитоферментных и иммунохимических методах и по аналогии с классификацией Kiel злокачественных лимфом человека лимфоциты опухолей, индуцированных вирусом лейкоза, принадлежат к В- клеткам с неодинаковым у разных животных фенотипом дифференциации опухолевых клеток.
Методом гибридизации на фильтрах по Саузерну ДНК опухолевых клеток с провирусными последовательностями показано, что генетическая информация вируса интегрирована в ДНК большинства опухолевых клеток в одном и том же сайте. Это отличает их от той ситуации, которая имеет место при персистентном лимфоцитозе, т. е. опухолевые клетки являются моно- или олигоклональными по сайтам вирусной интеграции (R.Kettmann et al., 1980). Отдельные опухоли могут содержать 1-3 провируса.
Вирусоподобные частицы были выявлены в ультратонких срезах клеток опухолей и осадков, полученных из молока (Dutcher R et al., 1964). Однако впервые достоверно, описана морфология ВЛКРС в работе J. М. Miller (1969). Зрелые вирионы ВЛКРС состоят из центрально расположенного электронно-плотного нуклеоида, диаметр которого в зависимости от методов фиксации и обработки препарата варьирует от 40-90 нм. Центральная часть нуклеоида (кор) отделена от внешней вирусной оболочки промежуточным слоем. Когда кор имеет максимальные размеры, то просветленное пространство между промежуточным слоем уменьшено, матрикс нуклеоида менее конденсирован и представлен гранулярным веществом. При меньшем размере кора его матрикс сильно конденсирован, гомогенен, а просветленное пространство между нуклидом и промежуточным, слоем трудноразличимо. Гексагональное . очертание ну клеоида в ультратонких срезах предполагает возможную икосаэдрическую структуру. Внешняя вирусная оболочка представлена двухконтурной мембраной,, которая лабильна, из-за чего диаметр вириона может сильно варьировать - от 73 до 120 нм. В среднем диаметр вириона В ЛКРС составляет 101±2 нм. На поверхности внешней оболочки выявляют шипики длиной 8-11нм с пуговкообразными утолщениями на концах. В краткосрочных культурах лимфоцитов вирус располагается в виде скоплений вне клеток, окруженных клеточным детритом? Внутриклеточный вирус локализуется в цитоплазматических вакуолях. В краткосрочных культурах лимфоцитов вирус накапливается в больших количествах преимущественно во внеклеточном пространстве, но нередко внутри клеток в цитоплазматических вакуолях. Внеклеточный и внутриклеточный, вирус располагается в виде скоплений и окружен клеточным детритом. (Мишкинене А; Э;, 1991; Смирнова И.А., Билько Н.А., Кишинская EX., 1993; Орлянкин Б.Г., Гулкжин М.И., Замараева Н.В., Кунаков К.Ю., 2000; Cohn М., Epstein R., 1991; Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M., 1991; Davies C.J., 1991)
Изменения гематологических показателей в динамике развития лейкозного процесса у крупного рогатого скота
За последние десятилетия объем исследований по лейкозам крупного рогатого скота значительно расширен. Однако до настоящего времени остаются не полностью изученными вопросы достоверности гематологического метода диагностики лейкоза и возможности дифференциации их от заболеваний нелейкозной природы. Гематологические исследования позволят установить критерии дифференциации диагностики лейкозов от заболеваний нелейкозной природы. Исследования проводили в неблагополучном по лейкозу хозяйстве ГУСП «Стерлитамакское» Республики Башкортостан в период с 2004 по 2007 год. Серологические исследования (реакция иммунной диффузии) проводили у всего маточного поголовья крупного рогатого скота старше 6-ти месячного возраста в количестве 3793 головы. Инфицированные вирусом лейкоза (по показателям РИД) оказались в 2004 году из 1050 коров - 915 (87,14 %); из 950 коров и телочек старше 6-месячного возраста в 2005 году - 565 (59,47 %); из 932 телок и нетелей старше 6-месячного возраста в 2006 году- 213 (22,85 %). По данным исследования по РИД в 2007 году всего поголовья крупного рогатого скота в ГУСП «Стерлитамакское» из 861 исследованных коров и телочек положительно реагировали 32 головы, что составляет 3,7 % от всего поголовья коров и телочек старше 6-мёсячного возраста, имеющихся в хозяйстве на момент исследования.
Положительно реагирующих на ВЛКРС животных в РИД переводили в МТФ «Заливное» для изолированного содержания, находящееся в отдалении от других животноводческих ферм. Коров и телок из лейкозного изолятора МТФ «Заливное» в последующем исследовали только гематологическим методом. Отрицательно реагирующих на лейкоз животных содержали в молочном комплексе «Наумовское».
За 2 года исследований животных лейкозного изолятора МТФ «Заливное» клинико - гематологические показатели изменялись, в основном, в сторону увеличения количества лейкоцитов. Используя «лейкозный ключ» (Г.А.Симонян, 1975) животных по результатам каждого исследования разделяли на гематологически здоровых, подозрительных в заболевании и больных лейкозом. Из 238 животных у 163 (68 %) выявили первичный лейкоцитоз (от 10,1 до 14,2 лейкоцитов тыс. х109/л крови), а у 141 животного был установлен "повышенный (более .70 %) уровень лимфоцитов. Подозрительными по заболеванию по показателям крови оказались 23 головы (10 %), и 52 головы (22 %) были признаны здоровыми, но имеющими антитела к вирусу лейкоза крупного рогатого скота.
В результате четырехкратного исследования в течение 2-летнего наблюдения показатели крови снизились до физиологической нормы у 4 животных (1,6 %) из группы подозрительных и перешли 15 животных (6 %) из группы здоровых в группу больных лейкозом.
В таблице 4 приведены данные показателей крови 141 животного гематологически больных лейкозом (1 группа) и 23 подозрительных в заболевании (2 группа). Контролем служили 70 животных молочного комплекса «Наумовское», свободные от вируса лейкоза с нормальными гематологическими показателями.
Как видно из таблицы 4, при первом гематологическом исследовании количество лейкоцитов в 1 мм3 крови в первой и второй группах было равным и на 6,92±0,24 тыс. х109/л больше, чем в группе контрольных животных. Однако по содержанию других видов клеток уже при первом исследовании наблюдали отличия. Так, в первой группе коров относительное и абсолютное число лимфоцитов составило 73,07±0,94 % и 9,35±0,2 тыс. х109/л в то время как у животных, признанных в дальнейшем здоровыми 53,1±2,23 % и 6,5±0,2 тыс. х10 /л соответственно. Если в первой группе животных увеличение количества лейкоцитов крови было вызвано увеличением числа лимфоцитов в среднем на 16,37±0,6 % больше, чем у контрольных животных (Р 0,01), то во второй группе за счет увеличения относительного числа палочкоядерных нейтрофилов, которых в среднем было на 11/7±0,8 % больше, чем в группе контрольных животных. Дальнейшие исследования крови животных в динамике развития лейкозного процесса показали, что у животных второй группы количество лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов в течение 6 месяцев становится равным физиологической норме. У животных на ранней стадий заболевания лейкозом происходит медленное или быстрое (характерно для молодняка) прогрессивное увеличение количества лейкоцитов, относительного и абсолютного числа лимфоцитов, а содержание других видов клеток снижается. В крови этих животных также отмечено увеличение числа молодых, малодифференцированных клеток в среднем до 4,9±0,03 %.
Инфицированность телят родившихся от родителей, больных вирусом лейкоза крупного рогатого скота
Работа посвящена изучению инфицированности вирусом лейкоза крупного рогатого скота телят, родившихся при сочетании пар больных лейкозами - бык и больная корова. Гематологический (на лимфоцитоз) и серологический контроль методом РИД и РДСК (на наличие антител к антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота) проводили через каждые 3 месяца в течении двух лет на базе ГУСП «Стерлитамакское» Республики Башкортостан.
Общепризнано, что лейкозы крупного рогатого скота ассоциированы с онкогенным РНК-содержащим вирусом. Разработаны методы культивирования вируса, изучены его морфология и биохимические, антигенные свойства, разработаны серологические методы выявления антител к антигену вируса. Исследования, проведенные с помощью этих специфических высокочувствительных серологических методов, показали взаимосвязь между содержанием в сыворотке крови животных антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота, персистентным лимфоцитозом и опухолевой формой лейкоза. При экспериментальном заражении овец вируссодержащим материалом развиваются опухолевые формы лейкоза.
С разработкой серологических методов выявления животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, начались интенсивные сероэпизоотологические исследования, целью которых являлось изучение степени инфицированности животных и путей передачи его от больных животных к здоровым. Имеется одно сообщение о передаче вируса лейкоза крупного рогатого скота от инфицированной матери потомству в плодный период в 15-20 % случаях. Основным путем распространения вируса считают горизонтальную передачу. Показано отсутствие вируса лейкоза в сперме инфицированных быков и их минимальная роль в распространении инфекции.
В опыт были взяты 21 корова в возрасте 3-10 лет и один бык-производитель в возрасте трех лет. Одна корова была гематологически подозрительна, 14 коров и бык были гематологически положительны на лейкоз и инфицированы вирусом лейкоза крупного рогатого скота и 6 коров имели нормальные показатели крови. Методом вольной случки коровы были осеменены больным быком-производителем. Животных содержали на привязи и только летом без привязи на выгульной площадке.
Ежеквартально проводили клинико-гематологические и серологические исследования животных. Телята, в количестве 21 голова, родившиеся от этих коров, содержались совместно с матерями в этом же коровнике, но в отдельном боксе, до 4-х месячного возраста, выпуская четыре раза в сутки для скармливания им молозива и молока матерей подсосным методом. У новорожденных телят в возрасте 5 дней исследовали количество лейкоцитов в крови общепринятым в гематологии методом. Одновременно в сыворотке определяли антитела к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота реакцией иммунодиффузии (РИД) согласно методических рекомендаций и комплементсвязывающие антитела - реакцией длительного связывания комплемента (РДСК). Для постановки РИД и РДСК использовали антиген Курской биофабрики и набор диагностикумов из Германии. В опыт были отобраны животные, сыворотки которых не обладали антикомплементарными свойствами в РДСК. Сыворотка крови животного по РДСК считалась положительной в титре 1:4 и выше.
Для постановки РИД и РДСК использовали антиген Курской биофабрики и набор диагностикумов из Германии. Для биопробы выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота в крови телят ставили на овцах 8-12 - месячного возраста с нормальными гематологическими показателями крови и в сыворотке крови которых не было-антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. В опыт было взято 14 овец, которых содержали в отдельном, изолированном от коров помещении. От каждого теленка в возрасте 20 - 60 дней брали по 5 мл крови и вводили внутрибрюшинно одной овце, четыре овцы были интактными (контроль). Исследования овец методами РИД и РДСК проводили в первые два месяца, после введения им крови телят, через каждые две недели, в последующем через один месяц до 6 — месячного возраста.
В опыт были отобраны животные, сыворотки которых не обладали антикомплементарными свойствами в РДСК. Сыворотка крови животного по РДСК считалась положительной в титре 1:4 и выше.
Коровы и бык-производитель по показателям лимфоцитов крови, определенным по средним результатам трехкратных ежеквартальных исследований, были распределены по лейкозному ключу на три группы:
