Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Характеристика возбудителя бешенства и его молекулярно-биологические свойства 10
2.2. Эпизоотологические данные и ситуация по бешенству в России и в мире 18
2.3. Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения при бешенстве 24
2.4. Лабораторная диагностика бешенства 27
2.5. Лабораторные, вакцинные штаммы вируса бешенства и антирабические вакцины 35
2.6. Заключение по обзору литературы 44
3. Собственные исследования 47
3.1. Материалы и методы исследований 47
3.2. Результаты собственных исследований 63
3.2.1. Разработка и испытание набора препаратов для диагностики бешенства в РИФ 63
3.2.2. Изучение полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса бешенства с использованием моноклональных антител 72
3.2.3. Выявление генома вируса бешенства в ПЦР 80
3.2.4. Нуклеотидное секвенирование и филогенетический анализ 83
3.2.5. Испытание иммуногенности и безвредности оральной антирабической вакцины "Синраб". 95
4. Обсуждение результатов 101
5. Выводы 112
6. Практические предложения 113
7. Список литературы 114
- Эпизоотологические данные и ситуация по бешенству в России и в мире
- Лабораторные, вакцинные штаммы вируса бешенства и антирабические вакцины
- Разработка и испытание набора препаратов для диагностики бешенства в РИФ
- Испытание иммуногенности и безвредности оральной антирабической вакцины "Синраб".
Введение к работе
Актуальность темы. Бешенство - это широко распространенное инфекционное заболевание теплокровных животных и человека, которое проявляется расстройствами функции центральной нервной системы, параличами и энцефаломиелитом. Оно регистрируется на территории более 80 стран мира, в большинстве из которых, в том числе и в России, в последние годы отмечается постоянный рост количества случаев этой болезни (А.В. Зайковская и др., 2004; Rabies bulletin Europe, 2003, 2004).
Вирус бешенства принадлежит к порядку Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae, которое включает, по крайней мере, три рода вирусов животных: Lyssavirus, Ephemeroviras и Vesiculovirus (N. Tordo et al., 1988).
Бешенство входит в пятёрку инфекционных болезней, общих для человека и животных, наносящих наибольший экономический ущерб, который складывается из потерь в результате падежа животных, затрат на проведение карантинных и профилактических мероприятий, на отлов бродячих собак и кошек, регулирование численности диких хищников, а также на проведение диагностических исследований (И.П. Арутюнова, 2000). Большие средства расходуются на постэкспозиционное лечение людей, имевших контакт с больными животными.
По данным ВОЗ, ежегодно в мире от бешенства умирает от 35000 до 50000 человек (Rabies bulletin Europe, 1999). В связи с тем, что бешенство является летальной инфекцией, и имеет важное социальное значение, необходима точная и своевременная диагностика этой болезни, особенно в случае опасности передачи бешенства человеку. В России для диагностики бешенства используются методы, которые имеют некоторые недостатки. В частности, постановка биопробы на мышах может занимать до 30 дней.
Для борьбы с бешенством в дикой природе разработаны и применяются оральные антирабические вирусвакцины (К.Н. Груздев и В.В. Недосеков 2001; А.З. Равилов и др., 2000; В.И. Жестерев ц- О.Г-_Лаптева, 2004). Однако,
І-ОС. НАЦИОг!,,'., < 6КБЛМОТСКА С Петербург , >
од у»ХшгтЗ> і
2 некоторые авторы высказывают опасения, связанные с наличием остаточной патогенности аттенуированных вакцинных штаммов вируса бешенства (Р. Pastoret et al., 1999; A. Wandeler, 2000; B.C. Иванов, 2000). В связи с этим, немаловажным является изучение молекулярно-биологических характеристик вакцинных штаммов вируса бешенства и полевых изолятов, циркулирующих на территории России, с целью разработки методов, позволяющих дифференцировать полевые изоляты и вакцинные штаммы вируса бешенства. Для этих целей могут быть использованы ПЦР, нуклеотидное секвенирование и моноклональные антитела (МКА). С помощью указанных методов можно проводить генотипирование полевых изолятов вируса бешенства, идентифицировать различные антигенные варианты и дифференцировать их от вакцинных штаммов (N. Tordo et al., 1988, 1996; J. Cox et al., 1992; S. Nadin-Davis et al., 2000; B.B. Недосеков и др., 2002). Благодаря использованию нуклеотидного секвенирования, было выявлено несколько новых генотипов вируса бешенства (Y. Arai et al., 2003; A. Botvinkin et al., 2003).
Таким образом, актуальной задачей является усовершенствование существующих методов лабораторной диагностики, а также разработка современных методов, на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и нуклеотидного секвенирования, позволяющих выявлять и дифференцировать полевые изоляты и вакцинные штаммы вируса бешенства. Существенным моментом в борьбе и профилактике бешенства является необходимость совершенствования методов выявления антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных животных с целью постоянного контроля эффективности и безопасности антирабических вакцин.
Цель и задачи исследований. Основной целью работы являлось сравнительное изучение молекулярно-биологических характеристик полевых изолятов и аттенуированных штаммов вируса бешенства и оценка оральных антирабических вирусвакцин, приготовленных из штаммов РВ-97 и SAD В19.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Получить антирабический флюоресцирующий глобулин, пригодный для первичного отбора изолятов вируса, с целью создания их коллекции и разработки набора для диагностики бешенства методом иммунофлюоресценции.
-
Изучить в сравнительном аспекте антигенные свойства полевых изолятов и вакцинных штаммов (РВ-97, SAD В19, "Овечий") вируса бешенства с использованием панели моноклональных антител.
-
Провести анализ последовательностей нуклеотидов фрагментов N-, G-гена и vjz-региона полевых изолятов вируса бешенства, выделенных на территории России, Финляндии и Эстонии, и G-гена вакцинного штамма РВ-97 вируса бешенства.
-
Создать банк данных нуклеотидных последовательностей генома полевых изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории России.
-
Сравнить на лисицах иммуногенность и безвредность оральных антирабических вакцин, приготовленных из штамма РВ-97 (вирусвакцина для оральной иммунизации диких плотоядных животных против бешенства "Синраб", Россия) и из штамма SAD В19 (живая антирабическая вакцина "Фуксорал" для оральной иммунизации диких животных, Германия).
Научная новизна работы. Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований:
Изучена генетическая гетерогенность и антигенность изолятов и вакцинных штаммов вируса бешенства с помощью ПЦР, нуклеотидного секвенирования и моноклональных антител.
Впервые определена нуклеотидная последовательность фрагментов N-, G-генов и у-региона 24 полевых изолятов вируса бешенства,
4 выделенных на территории России в 2001-2004 гг., и 2 вакцинных штаммов вируса бешенства, а также проведено сравнение полученных последовательностей с опубликованными в EMBL данными по первичной структуре различных изолятов и штаммов вируса бешенства.
Впервые определена нуклеотидная последовательность G-гена и аминокислотная последовательность гликопротеина вакцинного штамма РВ-97 вируса бешенства.
Дана экспериментальная оценка иммуногенности и безвредности для лисиц оральных антирабических вирусвакцин, приготовленных из штамма РВ-97 ("Синраб", Россия) и штамма SAD В19 ("Фуксорал", Германия).
Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований использованы при разработке следующих нормативно-технических документов:
«Методические указания по отбору проб мозга для диагностики бешенства и сывороток крови с целью определения титра антител», утвержденные руководителем Департамента ветеринарии Минсельхоза России 03.04.2001.
Комплект нормативно-технической документации на набор для диагностики бешенства методом иммунофлюоресценции: ТУ, временная инструкция, методические рекомендации, утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» 20.11.2004;
«Методические указания по применению реакции подавления иммунофлюоресценции (РГТИФ) для выявления антител к вирусу бешенства», утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» 10.01.2003.
Кроме того, создан банк данных нуклеотидных последовательностей фрагментов N-гена, G-гена и \|/-региона 24 изолятов вируса бешенства, выделенных на территории России, Финляндии и Эстонии, который
5 используется для идентификации и дифференциации вновь выделяемых изолятов вируса бешенства. Нуклеотидная последовательность G-гена штамма РВ-97 используется для сравнения ее с другими вакцинными штаммами и полевыми изолятами вируса бешенства.
Показана иммуногенность и безвредность для лисиц оральной антирабической вирусвакцины "Синраб", производящейся в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» из штамма РВ-97.
Публикации научных работ. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ.
Апробация работы. Результаты, полученные в ходе подготовки диссертации, доложены и опубликованы в материалах научных конференций: "Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия КРС. Крейтцфельда-Якоба и другие прионные болезни, листериоз, болезнь Ауески. болезнь Тешена" (г. Покров, ВНИИВВиМ, 2001); "Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей" (г. Покров, ВНИИВВиМ, 2002 г.): "Актуальные проблемы инфекционной патологии животных" (г. Владимир. ФГУ ВНИИЗЖ, 2003 г.); "Профилактика бешенства животных и заразных болезней рыб в Северо-Западном регионе России и Северных провинциях Баренцрегиона" (г. Мурманск, 2003 г.); на республиканской научно-практической конференции ветеринарных врачей (Карелия, г. Петрозаводск. 2003 г.); на Американо-Российском семинаре "Проблемы контроля бешенства и методы производства и применения оральных вакцин для бродячих собак, кошек и диких плотоядных" (г. Покров, Покровский завод биопрепаратов, 2004 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2002-2004 гг.
Структура и объем диссертации. Исследования по диссертационной работе проводились в 2000-2004гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Диссертация изложена на 151 странице и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования,
Эпизоотологические данные и ситуация по бешенству в России и в мире
Бешенство (Rabies) - это вирусная болезнь животных и человека, проявляющаяся признаками поражения центральной нервной системы и практически неизбежной летальностью.
Экономический ущерб, наносимый этой инфекцией довольно высок и складывается из затрат на проведение антирабической вакцинации, регулирования численности диких животных, отлова бродячих животных и затрат на диагностические исследования.
Современные особенности эпизоотологии и эпидемиологии бешенства начали формироваться в период после второй мировой войны, который ознаменовался возникновением и распространением бешенства в Европе.
Несмотря на принимаемые усилия, в течение последних десятилетий интенсивность эпизоотии бешенства продолжает нарастать [14].
Установлено, что к бешенству восприимчивы все виды домашних и диких теплокровных животных. Повышенной восприимчивостью отличаются дикие представители семейства собачьих (лисица, волк, шакал, енотовидная собака) и куньих, а также грызуны многих видов и домашняя кошка. Менее восприимчивы человек, собака, рогатый скот, лошадь, очень слабо восприимчивы птицы [15].
С учётом характера резервуара возбудителя различают эпизоотии природного типа, когда болезнь распространяют дикие плотоядные, и городского типа, когда источниками вируса и распространителями болезни являются бродячие собаки и кошки, численность которых определяет масштабы эпизоотии. Рыжие лисицы являются главным распространи!елем бешенства и наиболее восприимчивым видом в Европейских странах [39, 120].
По данным Американских исследователей, лисицы в 100 раз более восприимчивы к бешенству, чем скунсы [159]. В Канаде болеют, главным образом, лисицы, в США - еноты и скунсы [189]. Летучие мыши также часто являются переносчиками бешенства [124]. Несмотря на то, что их роль в распространении бешенства изучена, многие вопросы, связанные с внезапным возникновением бешенства среди летучих мышей в ранее благополучных колониях зоопарков, остаются неразрешенными [155, 178].
Наибольшее число случаев бешенства у людей возникает вследствие иокуса собаками. Особенно сложная в этом отношении ситуация сложилась ни Африканском континенте и в некоторых азиатских странах [150]. Гак, в Индии более 97% случаев бешенства среди людей возникает по причине нокусои собаками [57]. Популяция собак во всём мире насчитывает более 500 миллионов особей. Ни один другой вид плотоядных животных не имеет СТОЛЬ широкого распространения и плотности популяции. Домашние собаки присутствуют на всех континентах и практически на всех островах, освоенных людьми. Соотношение собак и людей обычно варьирует от 1:1 0 до 1:6, хотя существуют территории, где численность популяции собак превышает численность популяции людей [184].
Ряд работ посвящен изучению роли мелких грызунов в качестве резервуара вируса бешенства. К. Kulonen et al. (1996) изучали возможность циркуляции вируса бешенства в эпизоотических очагах среди грызунов в Эстонии, при этом было исследовано более 500 проб головного мозга полёвок и мышей, все с отрицательным результатом. Аналогичная работа была проведена в Таиланде W. Kantakamalakul et al. в 2003 г. Авторы исследовали более 500 проб головного мозга различных видов грызунов-комменсалов и землероек, отловленных в районе Бангкока, положительных на бешенство среди них выявить не удалось.
Для бешенства характерно циклическое течение заболевания [32]. В природных условиях для развития эпизоотии бешенства необходим контакт между больными и восприимчивыми животными, при этом каждое больное животное должно инфицировать более чем одно восприимчивое животное. Если складывается такая ситуация, то инцидентность болезни будет увеличиваться. Если же каждое больное животное контактирует и заражает менее чем одно восприимчивое животное, инцидентность болезни будет уменьшаться. В реальных условиях такие изменения не остаются постоянными долгое время, так как число восприимчивых животных становится ограниченным и, следовательно, интенсивность контактов между животными снижается, ввиду того, что многие восприимчивые животные уже погибли.
Таким образом, в результате периодического снижения численности лисиц из-за возникновения вспышки бешенства и восполнения численности популяции инцидентность бешенства колеблется с небольшой амплитудой в течение года и с бблее значительной в период от 3 до 5 лет. При этом определённое влияние оказывает численность лисиц, плотность их популяции, интенсивность контактов, вирулентность возбудителя, инкубационный период инфекции и Т.Д. [41].
В большинстве регионов России эпизоотическая ситуация по бешенству чрезвычайно сложна - резко активизировались природные очаги этой болезни, увеличилось число случаев заболевания среди диких плотоядных, домашних и сельскохозяйственных животных [24].
Бешенство входит в пятёрку инфекционных болезней, общих для человека и животных, наносящих наибольший экономический ущерб, который, прежде всего, зависит от объёма проводимых профилактических мероприятий [2, 3]. В настоящее время бешенство регистрируется на территории более 80 стран мира [11]. Классическое бешенство не регистрируется в Новой Зеландии, на Гавайях, а также в Австралии и Антарктике [59, 77]. Динамика изменения числа случаев бешенства в России за последние пять лет представлена на рисунке 4.
Данные, представленные на рисунке 4, свидетельствую! о резком увеличении числа случаев бешенства, регистрируемых на территории России в течение последних трех лет. Несмотря на то, что в 2000 году был отмечен некоторый спад инцидентности бешенства, в 2001 и 2002 гг. было отмечено существенное увеличение числа случаев этого заболевания. В 2003 году число случаев бешенства среди животных в Российской Федерации продолжало расти и составило 108,6% к предыдущему году.
Анализ структуры заболеваемости бешенством животных позволяет судить о том, какие виды животных заболевают бешенством чаще и за счет какого вида животных происходит рост или снижение числа случаен бешенства за определенный период времени в том или ином регионе. Структура заболеваемости бешенством по видам животных в России за последние 5 лет представлена на рисунке 5.
Из данных, представленных на рисунке 5, видно, что наибольшее число случаев бешенства ежегодно регистрируется среди диких животных. Обращает на себя внимание увеличение доли заболеваемости диких животных от общего числа случаев бешенства. Так, за период с 1999 по 2002 гг. этот показатель варьировал в пределах 36,3-38,4%, а в 2003 г. составил 44,2%. Доля случаев бешенства сельскохозяйственных и домашних животных изменялась незначительно (сельскохозяйственные животные 28-34,3%, домашние животные 27,3-33%), однако, в 2003 году отмечено заметное уменьшение доли случаев бешенства, зарегистрированных среди этих видов животных по отношению к общему показателю.
Следует отметить, что в большинстве стран мира бешенство также регистрируется среди диких животных. Например, в США в 2002 году было отмечено 7970 случаев бешенства, в том числе 7375 среди различных видов диких животных [107].
В Европе на бешенство диких животных приходится большинство случаев, но поскольку в России суммарное число случаев бешенства среди домашних и сельскохозяйственных животных (2395 или 55,8%) существенно превосходит число случаев бешенства среди диких животных (1894 или 44,2%), эта цифра в целом по Европе несколько ниже. Если исключить данные по бешенству в Европейской части России из общеевропейских, картина будет следующая: среди домашних и сельскохозяйственных животных в 2003 году в Европе зарегистрировано 2091 случаев бешенства, то есть около 30%, и 4869 случаев бешенства среди диких животных, то есть около 70% [145]. Динамика изменения числа случаев бешенства в Европе (включая Европейскую часть России) представлена на рисунке 6.
Лабораторные, вакцинные штаммы вируса бешенства и антирабические вакцины
Существует широкий ряд фиксированных штаммов вируса бешенства, которые, в свою очередь, подразделяются на лабораторные и вакцинные штаммы.
Лабораторные штаммы представлены двумя близкородственными штаммами CVS и PMPV, полученными из Пастеровского штамма вируса бешенства [162]. Штамм CVS имеет несколько вариантов. Так, адаптированный к мышам штамм CVS-24 имеет два стабильных варианта CVS-B2c и CVS-N2c, различающихся в патогенности для нормальных здоровых мышей и способности поражать нейронные клетки [127]. Лабораторные штаммы используются в различных диагностических реакциях, таких как РН, РПИФ, ПЦР, а также при проверке эффективности антирабических вакцин путем заражения вакцинированных животных.
Вакцинные штаммы. Для производства антирабических вакцин применяется аттенуированные штаммы вируса бешенства. Одним из первых был получен Пастеровский штамм PV, выделенный от больной бешенством коровы в 1882 г. и аттенуированный путем многократных пассажей на кроликах. Он показывает более близкую нуклеотидную гомологию со штаммами SAD/ERA, чем к лабораторным штаммам CVS/PMPV [162]. Штамм PV адаптирован к головному мозгу кролика, а также к клеткам ВНК-21 и Veto. SAD (Street-Alabama-Dufferin) - выделен от больной бешенством собаки в Алабаме (США) в 1935 году. Адаптирован к головному мозгу мышей и клеткам ВНК-21. Из него в последствии был получен штамм ERA (Evelyn Rokitniki Abelseth), а также Внуково-32, адаптированный к культивированию в культуре клеток сирийского хомяка. Существует несколько вариантов штамма SAD, в том числе SAD-Berne, SAD В19, SAD-P5/88, а также авирулентные мутанты SAG-1 и SAG-2.
РМ (Pitman-Moore) получен из штамма PV, адаптирован к головному мозгу кролика, первичным клеткам почки собаки, клеткам Vero и Nil-2. Данный штамм используется для приготовления инактивированной очищенной вакцины на утиных эмбрионах.
Nishigahara - штамм, полученный из штамма PV в Японии. Адаптирован к культуре клеток головного мозга морских свинок и к головному мозгу кроликов. Из него получен вакцинный штамм RC-HL [93].
Kelev - выделен от больной бешенством собаки в Израиле в 1950 году, прошел 100 пассажей в культуре клеток куриных эмбрионов. Адаптирован к клеткам головного мозга мышей.
Flury - выделен от человека в Джорджии (США) в 1939 году, адаптирован к культуре клеток куриных эмбрионов. Из него путем 40-50 пассажей был получен штамм LEP-Flury (Flury Low Egg Passage), адаптированный к культуре клеток ВНК-21, а также Flury-HEP (Flury High Egg Passage), прошедший более 180 пассажей в куриных эмбрионах и адаптированный к первичным клеткам куриного эмбриона [147].
В различных странах мира используются и другие штаммы и варианты перечисленных выше штаммов вируса бешенства (Fuenzalida S-51 и S-91, Ni-Сс, SRV9 и многие другие).
В России в прошлом для производства инактивированных мозговых вакцин ветеринарного назначения использовался штамм "Овечий". Используя методы селекции, из него были получены фиксированные штаммы "Щелково-51", "0-73 Уз-ВГНКИ", "РБ-71", "Краснопресненский-85", а в последствии штаммы "ВНИИЗЖ" и РВ-97. Для производства вакцин медицинского назначения используется штамм Внуково-32 - дериват штамма SAD [10].
В борьбе с большинством инфекционных заболеваний главное место должна занимать быстрая и точная диагностика, а также специфическая профилактика, т.е. применение тех или иных вакцинных препаратов. Бешенство, в этом случае, не является исключением. По мнению ряда авторов, для успешной борьбы с бешенством, необходимо его искоренение в природных очагах, а, следовательно, необходима разработка мер борьбы и профилактики бешенства диких плотоядных. При решении этой проблемы возникает много трудностей, связанных с тем, что регулирование численности диких плотоядных не всегда дает желаемый эффект. Кроме того, для реализации таких мероприятий необходимо провести исследования по выявлению главного резервуара инфекции. В связи с эти встал вопрос о необходимости вакцинации диких животных против бешенства. Опыт многих стран мира убедительно доказывает возможность контроля эпизоотии бешенства городского типа. Однако для полной ликвидации бешенства необходимо искоренение природных очагов этой инфекции. Уменьшение численности диких плотоядных животных имеет лишь ограниченный успех [29, 30].
Первую попытку подлинной экспериментальной профилактики бешенства предпринял Eusebio Valli в Италии (18 век), который сообщил об успехе "вакцинации" людей и инфицированных животных слюной больной бешенством собаки, предварительно обработанной желудочным соком лягушек. Такая обработка могла сильно снижать вирулентность слюны, и, таким образом, можно утверждать, что это была первая антирабическая вакцина [47]. Однако, главную роль в создании антирабической вакцины для людей, безусловно, сыграл великий французский ученый Луи Пастер, являющийся родоначальником профилактики и терапии бешенства.
В настоящее время существует целый ряд антирабических вакцин ветеринарного и медицинского назначения. Их можно разделить на три большие группы, первая из которых включает вакцины, созданные на основе убитого, вторая - на основе живого вируса, а последняя, третья группа включает вакцины, созданные на основе генетически модифицированного вируса и рекомбинантные вакцины.
Инактивированные антирабические вакцины созданы на основе убитого вируса бешенства. Для их создания в прошлом применялось культивирование предварительно аттенуированного вируса бешенства в головном мозгу восприимчивых животных, прежде всего овец. Однако из-за наличия в таких вакцинах большого количества балластных веществ, которые приводят к поствакцинальным осложнениями, в настоящее время вакцинный вирус культивируют в куриных эмбрионах или в перевиваемых культурах клеток.
Инактивированные антирабические вакцины были разработаны довольно давно и с успехом применяются в настоящее время для вакцинации сельскохозяйственных, домашних животных и людей. Широкое использование инактивированных антирабических вакцин стало возможно благодаря успехам биотехнологии, в частности крупномасштабному культивированию вируса бешенства в первичных и перевиваемых культурах клеток [20]. Следует отметить, что широкомасштабное применение инактивированных антирабических вакцин для иммунизации диких животных технически невозможно, так как такие вакцины требуют парентерального введения, а их оральное применение не эффективно [54].
Попытки контроля бешенства диких животных с использованием вакцин, предназначенных для домашних животных, были начаты с парентерального их применения. Животных отлавливали в дикой природе, вакцинировали и затем отпускали. Схема "отлов-вакцинация-освобождение" работала довольно хорошо, однако, большую часть животных не удавалось иммунизировать. Поэтому описанный выше подход к вакцинации диких животных нашел лишь ограниченное применение [185J. Другой пуп, предусматривал использование различных механизмов (вакцинных капканов), снабженных рычагом, на котором крепится шприц с вакциной. Рычаг приводится в движение пружиной, когда животное наступает на педаль спускового механизма. Однако, такие устройства также не нашли широкого применения и в настоящее время не используются [194].
Идея о том, что массовая вакцинация диких животных, являющихся резервуарами бешенства, может оказаться более эффективной, чем отлов, возникла независимо в Северной Америке и Европе. В начале 60-х годов прошлого века G. Ваег обнаружил, что лисицы могут быть иммунизированы посредством орального применения живого аттенуированного штамма ERA. Однако это открытие не привлекло особого внимания до 1970 года [40], пока другие исследователи не подтвердили такую возможность [46].
Испытание оральных антирабических вакцин было начато в середине 70-х годов прошлого века. Однако для начала их использования необходимо было решить проблемы остаточной патогенности, возможности реверсии вирулентности аттенуированного вакцинного вируса, а также возможности отбора антигенных вариантов в иммунной популяции [58, 182].
Разработка и испытание набора препаратов для диагностики бешенства в РИФ
Иммуноглобулин, полученный путем гипериммунизации кроликов очищенным препаратом ВБ, коньюгировали с флюоресцеинизотиоцианатом. Полученный коньюгат очищали от несвязавшегося ФИТЦ, разливали но ампулам и лиофилизовали. Для оценки полученного ФИТЦ-глобулина "ВНИИЗЖ" было проведено сравнительное исследование положительных проб головного мозга и сывороток крови с использованием поликлонального диагностических антирабического ФИТЦ-глобулина "Bio-Rad" и моноклонального ФИТЦ-глобулина "Centocor". Сравнительные испытания проводились в прямом варианте РИФ с микропрепаратами головного мозга, при выделении вируса бешенства в культурах клеток ВНК-21 и MNA, а также в РПИФ в культуре клеток ВНК-21. Целью данного этапа работы было изучение возможности использования ФИТЦ-глобулина "ВНИИЗЖ" для диагностики бешенства в прямом варианте РИФ, а также для определения уровня антирабических антител в РПИФ.
На первом этапе указанные выше диагностические препараты изучали в сравнительном аспекте с использованием образцов головного мозга животных, собранных для изучения молекулярно-биологических характеристик полевых изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории России, Финляндии и Эстонии. Указанные изоляты принадлежали к 5 различным антигенным вариантам.
Фиксированные мазки-отпечатки окрашивали в соответствии с общепринятой методикой РИФ с использованием упомянутых выше ФИТЦ-глобулинов. После промывки и высушивания препараты исследовали с использованием люминесцентного микроскопа. Результаты сравни гелі,мого изучения трех диагностических ФИТЦ-глобулинов в РИФ представлены в таблице 6.
В соответствии с данными, приведёнными в таблице 6, ФИТЦ-глобулин "ВНИИЗЖ" по активности и специфичности не уступает ФИТЦ-глобулинам "Bio-Rad" и "Centocor" и позволяет диагностировать все четыре антигенных варианта вируса бешенства, выделенных на территории России. Результаты сравнительного изучения ФИТЦ-глобулинов с различными антигенными вариантами уличного вируса бешенства и фиксированными штаммами ВБ, выделенными в культурах клеток MNA и ВНК-21, представлены в таблице 7.
Данные, представленные в таблице 7, свидетельствуют о высокой активности и специфичности ФИТЦ-глобулина "ВНИИЗЖ" и о возможности его использования для детекции полевых изолятов ВБ, принадлежащих к пяти различным антигенным вариантам, и фиксированных штаммов, выделенных в культуре клеток MNA, а также фиксированных штаммов ВБ, выделенных в культурах клеток ВНК-21 и MNA. ФИТЦ-глобулин "ВНИИЗЖ" не обладает способностью неспецифически связываться при окрашивании нативных культур клеток MNA и ВНК-21.
С целью изучения возможности использования ФИТЦ-глобулина "ВНИИЗЖ" для определения уровня антирабических ВНА в РПИФ было проведено сравнительное испытание заведомо положительных (№№ 1648, 1650, 14, 15, 16) и отрицательных (1, 2, 3, 4, 5) сывороток крови животных. В качестве референтного ФИТЦ-глобулина использовали диагностический антирабический ФИТЦ-глобулин "Centocor" (США). Результаты данного эксперимента представлены в таблице 8.
Данные, представленные в таблице 8, указывают па возможность применения ФИТЦ-глобулина "ВНИИЗЖ" для определения уровня ВНА в сыворотках крови различных видов животных с использованием РПИФ.
Для получения контрольных препаратов в качестве биологической модели нами были выбраны кролики, так как использование более мелких животных, таких как белые мыши, не целесообразно из-за небольшой массы головного мозга, привлечение же более крупных животных приводит к увеличению экономических затрат, а также сопряжено с трудностями заражения и содержания инфицированных бешенством животных.
Кроликов заражали интрацеребрально штаммом CVS вируса бешенства. Клинические признаки заболевания бешенством проявлялись обычно на пятый день после заражения. Животных убивали в агональном состоянии и извлекали головной мозг. Головной мозг исследовали в РИФ. Затем готовили 20% суспензию, тщательно ее гомогенизировали.
В связи с тем, что контрольные препараты должны быть безопасны для исследователя, возникла необходимость разработки процедуры инактивации вируса в полученной суспензии без потери активности препарата в РИФ. В качестве инактивантов испытывали димер этиленимина (1 способ) и [V иропиолактон (2 способ):
1 способ: К 6 мл 20% суспензии мозга добавляли 19 мкл 16% димера этиленимина, рН 7,0, инкубировали при 37С 24 часа. Добавляли 120 мкл 1% азида натрия.
2 способ; К 6 мл суспензии добавляли 3 мкл Р-пропиолактона, инкубировали при 37С 2 часа. Добавляли 120 мкл 1% азида натрия.
По окончании указанных процедур отбирали по 100 мкл каждого вида суспензии, наносили на предметное стекло, высушивали, фиксировали в ацетоне и исследовали в РИФ. Затем суспензии разливали по ампулам, подвергали лиофилизации, разбавляли и вновь исследовали в РИФ при использовании различных разведений ФИТЦ-глобулина "ВНИИЗЖ", а также антирабического ФИТЦ-глобулина производства ВНИВИ (г. Казань). Результаты данного эксперимента представлены в таблице 9.
Испытание иммуногенности и безвредности оральной антирабической вакцины "Синраб".
Для проведения опыта по сравнительному изучению иммуногенности и безвредности живых аттенуированных оральных антирабических вакцин "Синраб" и "Фуксорал" в отдельный шед было отсажено 77 серебристо-черных лисиц. Отбор животных проводили по принципу аналогов, при этом подбирали животных одной породы (серебристо-черные лисицы), пола (самцы), возраста (8 месяцев), однородных по размеру, телосложению и массе (около 5 кг).
Животных содержали в индивидуальных металлических клетках. Кормление и поение животных осуществляли в соответствии с нормами, принятыми в зверохозяйстве. Для кормления и ухода за животными был выделен постоянный персонал. Перед началом опыта животные были клинически осмотрены и выдержаны на 24-часовой голодной диете. Для проведения опыта животных разделили на 5 групп, из них две группы - для изучения иммуногенности, две группы - для изучения безвредности и одна контрольная группа (таблица 22).
В соответствии с планом опыта вакцинные приманки "Синраб" (группа №1) и "Фуксорал" (группа №2) были разложены на кормовые столики в клетки (одна приманка на каждое животное). При этом была отмечена 100% поедаемость приманок обоих вакцин в течение 1-15 минут, но вакцинные приманки "Фуксорал" поедались животными быстрее.
В группах №№ 3 и 4, в связи с невозможностью скормить 10 вакцинных приманок каждому животному, в индивидуальные кормовые чашки с готовой кормовой смесью выливали содержимое 10 пластиковых капсул, извлеченных из вакцинных приманок "Синраб" и "Фуксорал". Кормовая смесь, содержащая 10-кратную дозу антирабических вакцин, была съедена полностью.
В ходе опыта проводили отбор проб крови с целью определения уровней антирабических антител и изучения динамики их изменений. Для изучения возможности выделения испытуемых вакцинных вирусов со слюной и накопления их в головном мозгу, проводили отбор проб слюны и головною мозга. Периодичность отбора проб крови и слюны представлена в таблице 23.
Число проб; н.о. - пробы не отбирались.
Пробы головного мозга отбирали от всех павших во время эксперимента животных. Кроме того, на 30 день после вакцинации в группах 1 и 2 (таблица 23) было убито по 3 животных. Головной мозг этих животных, а также всех животных, убитых по окончании опыта, также исследовали в РИФ.
Определение уровня антирабических ВНА в сыворотках крови осуществляли в РПИФ с использованием референтной международной сыворотки (WHO/OIE referense standart), при этом, в соответствии с международными требованиями, для нейтрализации использовался вирус бешенства штамма CVS [136а].
Динамика изменения уровня антирабических вируснейтрализующих антител в зависимости от срока, прошедшего после вакцинации, представлена на рисунках 17 и 18.
Из, данных представленных на рисунке 17, следует, что при ммунизации животных одной дозой вакцины "Синраб" самый высокий уровень антител отмечался на 30 день после вакцинации, который затем незначительно снижался. На протяжении всего опыта уровень антител у большинства животных не превышал 5 МЕ/мл.
Как видно на рисунке 18, при иммунизации животных вакциной "Фуксорал" нарастание уровня ВНА продолжалось до 60-го дня после вакцинации, а затем он снижался. При этом уровень антител у большинства животных на протяжении всего опыта не превышал 17 МЕ/мл.
В соответствии с международными стандартами [136а] уровень ВНА, достаточный для защиты вакцинированных животных от инфицирования бешенством, должен составлять 0,5 МЕ/мл. Процентное соотношение числа животных, содержащих достаточный для защиты уровень ВНА в зависимости от срока, прошедшего после вакцинации, вида и дозировки вакцины, представлено в таблице 24.
Как видно из таблицы 24, при иммунизации животных одной дозой вакцины "Синраб" на 15 день после иммунизации достаточный для защиты уровень ВНА был выявлен у 63 % животных. На 30 день после иммунизации этот показатель в данной группе животных составил 91% и к 90 дню снизился до 79%. При вакцинации животных 10-ю дозами вакцины "Синраб" достаточный для защиты от заражения бешенством уровень антирабических ВНА был достигнут к 30 дню после вакцинации, а к 90 дню снизился и составил около 80%.
При иммунизации животных одной дозой вакцины "Фуксорал" на 15 день после иммунизации 85% животных выработали достаточный для защиты уровень ВНА. Начиная с 30 дня, и на всем протяжении опыта необходимый для защиты от заражения бешенством уровень ВНА был выявлен у 100% животных этой группы. Вакцинация животных 10-ю дозами вакцины "Фуксорал" привела к образованию достаточного для защиты уровня антирабических ВНА у 100% животных на 15 день после иммунизации. Этот уровень сохранялся на протяжении всего опыта.
Исследование проб слюны проводилось посредством биопробы в культуре клеток MNA. Наличие вируса бешенства в слюне иммунизированных животных подтвердить не удалось. Все исследованные в РИФ пробы головного мозга вакцинированных животных показали отрицательный результат. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что вирусы бешенства штаммов РВ-97 и SAD В19 не имеют тенденции к персистенции в головном мозгу и выделению со слюной у лисиц, вакцинированных одной и 10-ю дозами.
Моделирование заражения вакцинированных животных бешенством проводилось на базе Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВиМ, г. Покров) при участии кандидатов ветеринарных наук И. Сливко и А. Борисова. С этой целью использовали изолят вируса бешенства R.dog-190, выделенный от енотовидной собаки на территории Владимирской области и прошедший 1 пассаж на лисицах.
В пределах срока наблюдения (30 дней) гибели среди вакцинированных животных отмечено не было. На 20 день после заражения погибло одно животное в контрольной группе. Для подтверждения специфичности гибели было проведено исследование головного мозга погибшего животного в РИФ.
Исследование показало положительный результат, что свидетельствует о специфичности его гибели от бешенства. Через 30 дней после заражения все оставшиеся животные были убиты и уничтожены.
При проведении испытаний антирабических живых вакцин орального применения удалось установить, что обе антирабические вакцины ("Синраб" и "Фуксорал") являются эффективными и безопасными средствами профилактики бешенства. В ходе данного испытания не удалось обнаружить остаточную патогенность испытуемых вакцин для лисиц, а также выделить вирус бешенства в слюне.
При проведении испытаний установлены различия в сроках образования ВНА и иммуногенности, и что обе вакцины, не смотря на это, являются эффективными и безопасными средствами профилактики бешенства.
Похожие диссертации на Молекулярно-биологические характеристики полевых изолятов и аттенуированных штаммов вируса бешенства
