Введение к работе
Актуальность тамі;!. Исследования, направленные" на соеершекствование и удешевление производства средств специфической противоящурней -роФи.гшики (s частности, резервных .вакцин против экзотических типов вируса) язг.яегсй еажней задачей прикладной-ветеринарной вирусологии.
Пооиесс и<*готеелеи::я вакцины «ключает з " сєОй j>«n ос^ігСіньік эгапор таж. как: ,быОор антигена, его наработка, составление препарата и испытание на нммуногениос.ть. При этом выбор перспективного производственного штамма виру--са, оценка вирусного сырья на любом из перечисленных этапов и оценка конечного продукта представляют собой достаточно сложную научную- задачу, которая предполагает моделирование основных производственных процессов и методологическое обоснование надранных подучйос. Обидно, что :яа;;!ым принш-.лом. научнкх гшрагусток такого ролл яггпрст-.)?. создание достаточно надежных и йкоюмичзсхи с^фф^гиь-<ъя. лаоое-згерчых метссои, 3 связи с зтим 'фоолег-а ллбера-;срной оценки производственной пригодности штаммов вируса ящура является актуальной.
Обоснс '-а.чиє направлення исследований. Опыт мс-и-едозательсиой рабош(П\еуегпагпи М.М еї al„ 1973; Pay T.W.F., ,і<;5;Thaimann 6, ela[„ .1987) показывает, что конкретный соусный материал, в -аспекте-произзодстзениоа-пригодности, чежет быть охарактеризован со следующих позиций: . ~
;5. Стабильность структурного состояния-антигена (соответствие структуры капсида завершенному вириону-и сохра-кімг, ее.целостности при еоздейстекк различных &ИЗИК0-ХИ-^ч-.-к'их факторов, обусловленных технологией производст-
?.. ОФфект"яе;<осто иммунного воздействия единицы анти-гі'м г;е,ін-::4на гомологичной иммунной, реакции организма ливоткого на единицу массы антигена).
2 ''.-
3. Эффективность гетерологичных иммунных реакций сну гри данного таксономического типа вируса (свойство антигена индуцировать возможно более широкий спектр гете-ролсгичньіх иммунных ответов).
Главным условием реализации перечисленных требований была бы разработка надежных лабораторных методов, позволяющих' получать достоверные опосредованные оценки, где могут Сыть выделены следующие основные направления: а) оценка антиген-ооусловлеиных факторов, влияющих на иммучныи ответ; б) выбор параметров иммунных реакций организма, доступных к количественной регистрации.
По сесему морфологическому составу вирусная популяция неоднородна (Сооко А.И. и др., 1974; Hardy М.М. el а!., 1901; Doe! T.R. fit а!., 1982). Наиболее иммуногениыми яв-ляются вирусные частицы завершенной структуры (Криво-ва Т.С., 1972; OoelT-iR. el ai., 1982).
Широко известными . методами оценки концентрации й' структурного состояния антигена являются: проточная спектро-фотометрия, количественная РСК и электронная микроскопия. При этом последний представляется менее трудоемким и более перспективным.
Учитывая зависимость иммунного отпета от структурной целостности антигена {Brown F., 1978), исследования, направленные на оценку устойчивости вируса к воздействию физико-химических факторов, обусловленных технологическим процессом изготовления вакцин {оценки термерезисгентности, резистентности к эмульгированию и сохраняемости зарезервированного вируса), являются важными (Anderson Ь.С. ei al„ 1982; Михалишин В.В. и пр., ІШЙ.
Установлено, что для создания определенного уровня гомологичного иммунитета в отношении различных типов вируса требовались .неодинаковые дозы -соотеететьующих антигенов (Ефимов Н.И., ШТ; Uebermsnn Н. el a!.. 1388; Pay T.W.F. el a!., 1983). Возможно, что различия величин удельной иммуноген-носги сакци«', в им числе и сну гри таксономического типа
вируса, могут бытьобусловлены - свойствами конкретних -штаммов""(Pay"T.W.F., 1985; Esterchuysen JJ. е! al„ №Щ. Поэтому исследование иммунной, индукции однотиповыу штаммов в сравнительном аспекте представляется актуальным.
Опосредованные оценки защищенности животных, основанные на нейтрализующей способности аитиоыворотки, считзютсй наиболее важными (Amadori М. ei al., 1984; Thalmann G. el al., 1987) и в некоторых странах выступают в качестве референтного показателя иммунного статуса вакцинированных животных (Capsiick Р.В., 1931; Thalmann G. et al., 1337).
В связи с стим представляют практический интерес исследования, направленные на изучение сравнительной эффективности иммунного воздействия одинаковых ДОЗ ОДНОТИПОБЫХ антигенов как на стадии первичной клеточной реакции (тест бласттрансформации лимфоцитов), так и на стадии развитого гуморального иммунитета (тесты иммуноферменгный я сс-рорепукиии бляшкэорразсзаний).
'Весьма перспективным представляется использование оценки величины нейтрализующего действия цельной антисыворотки, которая может быть вычислена на основании регрессионной модели реакции серорепукции вирусных' б ля-. шек (Кулаков В.Ю., 1987) и позволяет прогнозировать развитие инфекционного процесса в иммунном организме (Гнева-шевВ.М. идр.,1991).
В рамках перечисленных общих положений была поставлена : цель исследований и Сформулированы конкретные задачи.
Цель исследований. Обоснование лабораторных методов, позволяющих произвести предварительный отбор штаммов вируса ящура для использования их в производстве ннактивированных вакцин. - *
Задачи:
1. Провести сравнительное исследование нескольких штам-' мов по сохраняемости вируса в составе зарезервированных ра'сплодок, терморезистёктяости и-резистентности, к процедуре эмульгирования.
-
Усовершенствовать методику оценки концентрации вириоиоз с помощью электронной микросколии для более точного определения . массы иммунизирующего антигена (структурного белка вируса) в единице объема,
-
Произвести* сравнительную оценку иммунного ответа лабораторных животных на *'одинаковые дозы исследуемых антигенов.
3.1. Срг:21»ит.ь гомологичную антиген-зависимую степень активации сллеиоцитов мыши по количеству ассимилированное 3|Н]-тимидин Сй-метки в тесте бласттраисформации,
3,8. Провести сравнительную оценку гуморального иммунного отеета морских свинок е серологических тестах.
3.2.J, Сравнить гомологичную антиген-ассоциативную, эф
фективность антисывороток . в иммуноферментиом тесте.
* Обосновать принцип оценивания теста. .
-
Сравнить гомологичную нейтрализующую эффективность антисывороток в тесте сероредукции вирусных бляшек. 8 качестве результирующей оценки использовать показатель ожидаемой эффективности реакции цельной антисыворотки.
-
Определить'корреляцию результатов, полученных в тестах БТ,"ИФ и СБ.;,' * -"'..-
-
Сравнить гетеро логичную ^ нейтрализующую эффективность-, антисывороток в тесте сероредукции вирусных бляшек, Ооосновать "показатель антигенного спектра, штамма как-статистическую оценку контраста соответствующих гомо- и гетерологичных реакции?
-
Изучить возможность применения сообщенного показателя (формулы); отражающего.антигенные двойства штамма с учетом ожидаемого гетерояогичмого эффекта' внутри данного таксономического типа вируса.
-
На основании проведенных исследовании произвести предварительный' отбор наиболее перспективного штамма вируса _ и ^екомендоьзть .его для использования а произ-еодйтее резервных инесшированных вакцин против ящура типа SAT-1.
5_ ..
-1 Няучигя -jiocircftarB "сразите'ггьном аспекте были изу
чены- антигенные я' некоторые физико-химические своЛстьа
семи штаммов вируса ящура типа SAT-1, . ' "
'. В процессе исследований оыл модифицирован ряд известных и разработаны новые метопы:
-
Хсорершенство&ан мої од оиенки кснцекграї;^ г.ир^о-ноз средствами. элехтро«нои микроскопии, позволяющий рассчитать удельную массу антигена.'
-
Предложен способ оценки резистентности DHpyca к процедуре эмульгирования. Целостность вирионов в'эмульгированных пробах может быть точно измерена по остзтояной бляшкообразующеи способности еируса,
-
Предложена процедура обработки результатов титрования антисыворотки в непрямом твердофазном иммунофермент-. ном тесте с иммобилизованным антигеном (регрессионная модель реакции).
-
При известной иммунизирующей лозе в тесте сероре-дукции вир у сі,1 мх бляшек установлена оценка гомологично-; нейтрализующей зффективностк цельной л:тисывор'о!КИ. которая може г быть использована в качестве показателя относительной антигенности штамма.
5. Предложен комплексный показатель "минимальной"
ожидаемой эффективности гетерологичной реакции, включаю
щий . сценки * относительной, антигенности и широты' антиген
ного спектра, который- может быть использован в качестве
знутритиповой характеристики антигенных свойств штамма.
Практическая значимость. Отобран и рекомендован . для использования в .производстве инактивированных вакцин штамм вируса ящура SAT-1-SR-2/58.. .
\ Лабораторный метод- комплексной оценки производсгвен-
ноя пригодности штаммов вируса ящура позволяет отбирать
наиболее перспективный производственный штамм и может
быть рекомендован к использованию ' в научно-исследоза-..
тельских учреждениях и' на биопредприятиях, занимающихся
; изготовлением противоящурных инактивированных вакцин. .;„.«
Усовершенствованная методика оценки концснтарации ви-рионов и структурного белка вируса.средствами злектронной микроскопия позволяет достаточно точно определить концентрацию вирусных частиц и рассчитать массу структурного белка в единице объема.
Кроме этого данный метод представляется менее трудоемким л более оперативным.
Регрессионная модель реакции в ИФ-тесте имеет достаточную адекватность и может быть рекомендована как для практических. T-'-v и научно-исследовательских работ, сея-'jtirtHtix с несОхидимостью количественной оценки активности иммунных ct>:eoporc;-. по отношению к различным антигенам.
Л!1,):>1};и:ля работы. Основные материалы диссертации доложены.' на научно-теоретической конференции молодых .ученых ВгіИЯН (г.Владимир, 1990) и на научной конференции ВНИИВВиМ (г.Покро?. Ші).
Публикация. Материалы диссертации изложены в 4 научных работах, опубликованных в 1990-1992 годах.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из зведення, оОзора литературы,, собственны)? исследовании, обсуждения результатов, еыводоз и практических предложений, иллюст-рироьаи-з 10'таблицами и 7 рисунками. Список ислользобйн-нои литературы включает 176 наименований, из них 50 источников m русском языке и 128 работ зарубежных аБторов. D приложении представлены: таблицы, дополняющие -результаты оідегійіімх эксперимент се; краткий обзор эпизоотологии ри-руса яшура типа SAT-1; 2 методики, обоснование штамма
Похожие диссертации на Лабораторная оценка производственной пригодности штаммов вируса ящера (на примере семи штаммов типа SAT-1)
