Содержание к диссертации
1. Введение 6
2. Обзор литературы 14
2.1. Общие сведения о ящуре 14
2.2. Эпизоотическая ситуация по ящуру 15
2.3. Вирус ящура 16
2.4. Биологические особенности вируса ящура типа Азия-1. 18
2.5. Антигенная вариабельность и родство вируса ящура. 19
2.6. Основные методы лабораторной диагностики ящура. 25
2.7. Профилактика. 37
2.8. Заключение по обзору литературы. 41
3. Собственные исследования 44
3.1. Материалы и методы 44
3.1.1. Материалы 44
3.1.1.1. Вирусный материал 44
3.1.1.2. Вакцина 44
3.1.1.3. Подопытные животные 44
3.1.1.4. Культуры клеток и питательные среды 45
3.1.1.5. Сыворотки крови 46
3.1.1 .б.Оборудование, химические реактивы, растворы 46
3.2. Методы исследования 48
3.2.1. Выделение вируса ящура 48
3.2.2. Культивирование вируса ящура в клеточных культурах 48
3.2.3. Серологические реакции 49
3.2.4. Титрование вируса ящура 50
3.2.5. Подготовка контрольных штаммов вируса ящура для определения иммуногенной активности противоящурной вакцины на морских свинках 50
3.2.6. Определение иммуногенной активности противоящурных вакцин 52
3.2.7. Получение штаммоспецифических препаратов. 52
3.2.8. Статистическая обработка результатов. 54
4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 55
4.1. Изучение иммунобиологческих свойств штамма вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 55
4.1.1. Выделение и идентификация вируса ящура из патологического материала. 57
4.1.2. Выделение вируса ящура в культурах клеток. 59
4.1.3. Биологические свойства вируса ящура штамма Азия-1 №1987/Амурский/2005. 59
4.1.3.1. Адаптация и культивирование вируса ящура клеточных культурах. 59
4.1.3.2. Адаптация и титрование вируса ящура на морских свинках. 62
4.1.4. Получение штаммоспецифических диагностических компонентов для РСК. 64
4.1.5. Получение диагностических компонентов для ИФА. 67
4.1.6. Изучение антигенного родства штамма вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005. 68
4.1.6.1. Изучение антигенного родства с помощью РСК. 68
4.1.6.2. Изучение одностороннего антигенного родства в РМНиИФА. 70
4.1.7. Сравнительная оценка иммуногенной активности противоящурных вакцин. 74
4.1.8. Результаты изучения иммуногенной активности вакцины противящура сорбированной трехвалентной типов А, О, Азия-1. 77
4.2. Разработка метода выявления антигена вируса ящура в ИФА. 80
4.2.1. Получение специфических реагентов для ИФА. 82
4.2.2 Оптимизация условий постановки ИФА. 87
4.2.3 Непрямой сэндвич вариант. 90
4.2.4 Сравнительная оценка сэндвич-варианта ИФА и РСК. 92
4.2.5 Испытания набора для выявления антигена вируса ящура иммуноферментным анализом. 93
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИСЛЕДОВАНИИ 95
6. ВЫВОДЫ 107
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 109
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 110
ПРИЛОЖЕНИЯ 127
Введение к работе
Актуальность темы. Эпизоотии ящура, вызванные вирусом типа Азия-1, наблюдались в странах Азии, Европы, Среднего и Ближнего Востока. Вирус этого типа и в настоящее время представляет угрозу для этих регионов, так как вспышки ящура периодически возникают в различных государствах, в том числе и граничащих с нашей страной. Следовательно, угроза возникновения болезни в России существует постоянно, в особенности в регионах на границе с Китаем, Монголией, странами Средней Азии и Закавказья (27, 28 ,63, 88, 106, 119,128).
Принимая во внимание опасность возникновения ящура в нашей стране и возможность больших экономических потерь, особое значение приобретает проблема профилактики этой болезни. Согласно Международному ветеринарно-санитарному кодексу, ящур относится к особо опасным инфекционным болезням (43). Поэтому защита государства от ящура и разработка мер быстрой диагностики, ликвидации и профилактики является первостепенной задачей.
Возбудитель ящура по своим биологическим свойствам отличается высокой контагиозностью, широком кругом восприимчивых животных множеством типов и подтипов, длительной сохраняемостью в организме переболевших естественно восприимчивых животных и во внешней среде (8, 92, 130).
Вирус ящура обладает высокой антигенной вариабельностью. Такой уровень генетической вариабельности вируса в пределах одного генотипа приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура (7, 45, 65, 76,96,98, 112).
Опасность, которую представляет ящур, диктует необходимость постоянного усовершенствования методов и средств его диагностики, глубокого изучения свойств вновь выделенных в полевых условиях штаммов возбудителя, определения их эпизоотической опасности и степени соответствия производственным и ранее выделенным штаммам (111, 117). В настоящее время одним из основных методов профилактики ящура в нашей стране является систематическая иммунизация сельскохозяйственных животных инактивированными моно- и поливалентными вакцинами в зонах, угрожаемых по данной болезни (пограничные районы, регионы, где в последние годы регистрировали вспышки ящура, территории вокруг биопредприятий), а, в случае вспышки ящура - экстренная вакцинация всех восприимчивых к ящуру животных в неблагополучном очаге и в угрожаемой зоне (13,17, 18, 19).
Особую опасность представляют эпизоотии ящура, вызванные вирусом, отличающимся в антигеном отношении от производственных штаммов. Этот факт может свести на нет, или значительно снизить эффективность профилактических прививок моно - и поливалентными противоящурными препаратами (54, 79, 83, 89).
Непременным условием противоэпизоотической эффективности противоящурных вакцин является соответствие антигенных свойств производственного (вакцинного) штамма вируса ящура эпизоотическому.
Следует отметить, что при отборе производственных штаммов вируса ящура учитывается широта их антигенного спектра (способность защищать привитых животных от заражения гетерологичными штаммами вируса того же типа), но не все производственные штаммы вируса ящура создают достаточно напряженный иммунитет против других вариантов того же типа (42, 50, 54, 72, 93,311,).
В особенности это относится к вирусу типа Азия-1. Вакцина, изготовленная из вируса производственного штамма Азия-1 №48, оказалась недостаточно эффективной при ее использовании против эпизоотических штаммов вируса ящура этого типа (14,52,89),
Это обуславливает необходимость постоянного изучения свойств выделенных штаммов вирусов.
Систематическое изучение эпизоотических штаммов необходимо не только для классификации вирусов, что имеет важное теоретическое значение, но и в плане сравнительного исследования антигенных свойств эпизоотических и производственных штаммов, из которых готовятся вакцины.
Систематическая угроза заноса и распространение ящура на территории Российской Федерации заставляют внимательно следить за эпизоотической обстановкой по ящуру в мире, а также своевременно проводить диагностику и изучение иммунобиологических свойств штаммов для выбора лучших, при изготовлении специфических препаратов (15, 41,42, 72, 102, 133).
Традиционными методами идентификации вируса ящура долгие годы были реакции связывания комплемента (7, 12, 34, 48, 77) и вируснейтрализации (77). В качестве биологического метода использовали выделение вируса на лабораторных тест-системах (34, 77). Включение этих методов в схему лабораторной диагностики ящура было обусловлено рядом важных преимуществ. Так РСК, при наличии соответствующих по специфичности диагностикумов, возможно в течение 1,5-2,5 часов идентификацию не только типовой, но и вариантной принадлежности возбудителей, вызывающих болезни, протекающие с везикулярным синдромом (ящур, везикулярный стоматит, везикулярная экзантема и везикулярная болезнь свиней) (8, 92). Однако на специфичность этой реакции могут оказывать влияние многие факторы. В этом отношении более специфичной можно считать реакцию нейтрализации, с помощью которой можно определять антитела, ответственные за иммунитет. Но для ее выполнения необходимы особые условия ветеринарно-санитарного порядка, наличие биологической тест-системы, а для получения информации требуется от 3 до 10 дней . Кроме того, имеются данные о том, что не всегда результаты серологических методов соответствуют биологическим. На этом основании предпринимались попытки разработать другие более объективные иммунохимические реакции. Однако большинство из этих методов оказались менее пригодны для лабораторной диагностики ящура из-за недостаточной чувствительности (реакция диффузной преципитации), или не способности дифференцирования типов возбудителя (метод флюоресцирующих антител, радиоиммунный анализ) (38, 92) и его вариантов (реакция пассивной гемагглютинации) (7).
В этом отношении совершенно уникальными возможностями обладают некоторые новые методы, такие как, иммуноферментный анализ (22, 34, 35, 98, 116, 117, 140). Для него характерна высокая чувствительность, простота постановки и быстрота получения результата. По специфичности его результаты коррелируют с общепринятыми вирусологическими и серологическими методами, а по чувствительности имеют явные преимущества. Они позволяют получить больше информации об антигенной структуре и происхождении вирусов по сравнению с традиционными серологическими реакциями. Недостаточная типоспецифичность ИФА на начальном этапе использования успешно преодолевается с помощью двойного сандвич-варианта (152). Благодаря этому открылись перспективы совершенствования схемы лабораторной диагностики ящура за счет применения ИФА не только для типирования, но и субтипирования эпизоотических штаммов возбудителя (102, 110).
В связи с появлением на территории России вируса ящура типа Азия-1, возникла необходимость изучения свойств данного вируса.
Цель и задачи исследований. Главной целью наших исследований было изучение иммунобиологических свойств вируса ящура Азчя-1 №1987/Амурский/2005 и усовершенствование диагностического набора для выявления и идентификации вируса ящура методом иммуноферментного анализа.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- изучить иммунобиологические свойства штамма вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005, выделенного на территории Российской Федерации в 2005 г.;
- подготовить предложения по использованию штамма вируса ящура №1987/Амурский/2005 для изготовления диагностических и вакцинных препаратов;
- получить диагностические препараты на актуальные эпизоотические штаммы вируса ящура для иммуноферментного анализа;
- усовершенствовать набор для идентификации в ИФА производственных и эпизоотических штаммов вируса ящура типов А, О, Азия-1.
Научная новизна.
Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований:
Изучены иммунобиологические свойства штамма вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005, выделенного на территории Российской Федерации г 2005 году, который отличается от вакцинных и ранее изученных эпизоотических штаммов вируса ящура типа Азия-1 (R% от 13 до 42);
Изучены основные биологические свойства антигена вируса ящура типа Азия-1 №1987/Амурский/2005, используемого для изготовления экспериментальной вакцины;
Показаны антигенные взаимоотношения между производственными и эпизоотическими штаммами вируса ящура типа Азия-1;
Получены штаммоспецифические компоненты для иммуноферментного анализа и реакции связывания комплемента на штамм вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005;
Усовершенствован диагностический набор для определения антигена вируса ящура типов А, О, Азия-1;
Определены оптимальные варианты постановки ИФА при выявлении и идентификации штаммов вируса ящура;
Практическая ценность работы. Изученный штамм вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» и рекомендован для изготовления диагностических препаратов и противоящурнои вакцины против этого типа вируса ящура.
Получены диагностические препараты на основании изученного штамма Азия-1 №1987/Амурский/2005.
Усовершенствован и внедрен в производство набор для выявления антигена вируса ящура иммуноферментным анализом, ТУ 9388-138-00495527-2005 от 30.06.2006 г.
Основные положения, выносимые на защиту.
- Адаптационные свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа Азия-1 №1987/Амурский/2005.
- Результаты комплексного изучения антигенного родства штамма вируса ящура Азия-1 №1987 /Амурский/2005.
- Получение штаммоспецифических диагностических препаратов на основе штамма Азия-1 №1987 /Амурский/2005.
- Результаты практического применения эпизоотического штамма вируса ящура типа Азия-1 №1987 /Амурский/2005.
- Диагностический набор для определения антигена вируса ящура методом иммуноферментного анализа и его практическое применение.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 1 работа в издании, рекомендованной ВАК РФ для публикации материалов кандидатской диссертации.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации апробированы на научных конференциях: «Золотое кольцо России» - региональной конференции посвященной проблеме профилактики и лечения домашних животных и птицы. - Владимир, 2001; международной научной конференции, посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» г. Владимир, 2003г.; 2-й международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы зоотехнническои науки и практики, как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных», г. Ставрополь, 2003г.; 6-ом международном конгрессе ветеринарной вирусологии «Эволюция и персистенция вируса» прошедшем в Сант-Мало, Франция в 2003 году; международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» г. Владимир, 2004.
«Набор для выявления антигена вируса ящура в пробах материала иммуноферментным анализом» был представлен на выставке продукции ФГУ ВНИИЗЖ, при проведении Всероссийского научно-практического семинара-совещания ветеринарных специалистов «Эпизоотологический мониторинг, профилактика и меры борьбы с болезнями КРС и свиней» 26-30 сентября 2005г., г. Владимир.
Основные положения диссертации были изложены на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах, включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, список использованной литературы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 156 источников, из них 63 источника иностранных авторов. Работа иллюстрирована 20 таблицами, 3 рисунками. В приложении к диссертации имеется 4 документа, подтверждающих результаты исследований и их внедрение.
Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории «Ящура и везикулярных болезней», лаборатории «Биотехнологии», лаборатории «Диагностики особо опасных болезней животных», Отделу биологического и технологического контроля, научной библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» за практическую помощь и методические советы при выполнении и оформлении диссертации.
