Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Пробиотики, их роль в биологии, медицине и в ветеринарии 7
1.2. Роль макро и микроэлементов в животноводстве 17
2. Собственные исследования 36
2.1. Материал и методы исследований 36
2.2. Результаты собственных исследований 41
2.2.1. Иммунитет и его коррекция с целью профилактики отечной болезни поросят
2.2.1.1. Состояние естественной резистентности и ее коррекция для профилактики отечной болезни поросят
2.2.1.1.1. Динамика изменения комплементарной активности сыворотки крови 41
2.2.1.1.2 Динамика изменения бактерицидной активности сыворотки крови 45
2.2.1.2. Состояние Т - и -В- систем иммунитета и их коррекция для профилактики отечной болезни поросят 49
2.2.1.2.1. Динамика Т-Е-РОК- лимфоцитов, Т- хелперов и Т- супрессоров в крови поросят
2.2.1.2.2. Динамика В-ЕАС - лимфоцитов в крови поросят 59
2.2.2. Состояние микробиоценоза кишечника и его коррекция для профилактики отечной болезни поросят 64
2.2.2.1. Нормофлора кишечника и ее коррекция с целью профилактики отечной болезни поросят 64
2.2.2.2. Условно-патогенные микроорганизмы и их коррекция с целью профилактики отечной болезни поросят 71
2.2.2.3. Микроскопические грибы из родов Candida, Penicillium, Aspergillus и их коррекция с целью профилактики отечной болезни поросят 82
2.2.3. Состояние минерального обмена и его коррекция для профилактики отечной болезни поросят 93
2.2.3.1. Динамика изменения содержания кальция в крови и сыворотке крови поросят 93
2.2.3.2. Динамика изменения содержания калия в крови и сыворотке крови поросят 100
2.2.3.3. Динамика изменения содержания натрия в крови и сыворотке крови поросят 107
2.2.3.4. Динамика изменения содержания магния в крови и сыворотке крови поросят 114
2.2.3.5. Динамика изменения содержания неорганического фосфора в крови и сыворотке крови поросят 117
3 Экономическая эффективность проводимых мероприятий 121
4 Обсуждение результатов исследований 123
Выводы 132
Практические предложения 134
Библиография 135
Приложение 156
- Пробиотики, их роль в биологии, медицине и в ветеринарии
- Материал и методы исследований
- Экономическая эффективность проводимых мероприятий
Введение к работе
Отечная болезнь поросят (ОБП, колиэнтеротоксемия) - остропроте-кающая болезнь поросят отъемного возраста, характеризующаяся серозными отеками тканей, гастроэнтеритом и летальным исходом. Предрасполагающий фактор болезни - ранний отъем, резкие изменения условий содержания и кормления, ведущие к стрессу. Данное обстоятельство ведет к изменению состава кишечной микрофлоры. Токсические бета - гемолитические колибакте-рии вытесняют непатогенные штаммы кишечной палочки. Поступающие из кишечника токсины в значительной степени подавляют защитные функции организма и поражают нервную систему (С.Г. Братчик, 1983; М.К.Ступак, 1984, 1985; П.С. Матюшев, 1985, 1994; Ф.Ф. Порохов, 1984; Р.А. Сетдеков, 2002; А.А. Коломыцев, 2005). Однако, работ по исследованию у стресспози-тивных линий поросят до отъема показателей иммунного статуса, естественного микробиоценоза кишечника и минерального обмена мы не встретили.
В этой связи целью работы явилось: изучить состояние иммунного статуса, естественного микробиоценоза, минерального обмена и разработать эффективные методы их коррекции с целью профилактики отечной болезни у поросят.
В задачи исследований входило:
1. Изучить состояние иммунитета и возможности его коррекции прополисом на фоне седативного лечения настойкой валерианы и пустырника, а также цеолито- и пробиотикотерапии, иммунизации вакциной Коли-вак с сравнительной оценкой:
а) естественной резистентности (динамики комплементарной и
бактерицидной активности сыворотки крови)
б) параметров Т-и В систем иммунитета (динамики Т-Е-РОК лимфоцитов, Т-хелперов, Т-супрессоров и В-ЕАС-лимфоцитов в крови)
2. Установить влияние иммуностимуляции прополисом стресспозитив ных поросят, на фоне седативно - цеолито - пробиотикотерапии и иммуниза 5 ции вакциной Коли-вак, с целью профилактики ОБП, на состояние микробиоценоза кишечника с учетом:
а) динамики нормофлоры (бифидобактерий и лактобацилл)
б) динамики условно-патогенных микроорганизмов (клостридий, ста филококков, псевдомонов)
в) динамики микроскопических грибов из родов Candida, Penicillium, Aspergillus.
3. Определить изменения минерального обмена у стресспозитивных поросят с целью профилактики отечной болезни, под влиянием иммуности-муляции прополисом, на фоне седативно-цеолито-пробиотикотерапии и иммунизации вакциной Коли - вак с оценкой динамики содержания в крови и сыворотке крови кальция, калия, натрия, магния и неорганического фосфора.
Научная новизна исследований заключается в следующем: впервые изучено состояние иммунного статуса, естественного микробиоценоза кишечника, минерального обмена у стресспозитивных поросят. С целью профилактики отечной болезни поросят предложено за месяц до отъема иммуно-стимуляция прополисом на фоне седативного лечения настойкой валерианы и пустырника, пробиотикотерапии лактобифидом, цеолитотерапии и иммунизации вакциной Коли-вак.
Практическая значимость работы. Проведение за месяц до отъема стресспозитивных поросят мероприятий по иммуностимуляции прополисом на фоне седативного лечения настойкой валерианы и пустырника, цеолито - и пробиотикотерапии, иммунизации вакциной Коли-вак, способствующих созданию в организме животных прочного иммунного баланса, оптимального микробиоценоза, восстановлению минерального обмена и предупреждению ОБП позволяют рекомендовать их как эффективные средства производству.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Традиционные условия содержания и кормления стресспозитивных поросят приводят к развитию в организме животных вторичных иммунодефицитов и дисбактериозов, нарушению показателей минерального обмена, способствующих развитию отечной болезни.
2. Прополис, пробиотик лактобифид, цеолиты, настойка валерианы и пустырника, в различных композиционных формах, в различной степени активности, восстанавливают иммунный статус, естественный микробиоценоз, минеральный обмен, оказывают общее седативное действие и способствуют профилактике в период отъема отечной болезни поросят.
3. Наиболее положительное влияние для профилактики ОБП оказывает комплексная терапия: настойка валерианы и пустырника + прополисное молочко + лактобифид + цеолиты на фоне иммунизации вакциной Коли - вак .
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на международной научно-практической конференции «Современные проблемы иммуногенеза, теории и практики борьбы с паразитарными и инфекционными болезнями сельскохозяйственных животных» (Москва-Уфа, 2004), на научно-практической конференции БГАУ 2004, на расширенном заседании кафедры паразитологии, микробиологии и вирусологии БГАУ, (Уфа, июль 2005).
Публикации результатов исследования. Основные положения дис- " сертационной работы опубликованы в 3 научных статьях.
Объем и структура диссертации изложены на 156 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 24 рисунками в форме графиков. Библиографический список включает 200 работ, в т. ч. 32 иностранных авторов.
Пробиотики, их роль в биологии, медицине и в ветеринарии
Общепризнано участие иммуномикроэкологической системы в поддержании здоровья и снижения риска возникновения заболеваний. Нарушения в иммунном и микроэкологическом статусе имеют существенное, а порой и определяющее значение при традиционных инфекционных заболеваниях.
Основоположнику микробиологии И.И. Мечникову принадлежит идея целенаправленного изменения состава симбиотической микрофлоры желудочно-кишечного тракта (J.J. Metchnikoff, 1908). Предложенный им метод энтерального введения живых культур молочнокислых бактерий в качестве антагонистов гнилостных микробов явился началом современных исследований в области бактериотерапии и профилактики различных патологических состояний, связанных с нарушением состава нормальной микрофлоры. Эта научная предпосылка получила широкое развитие в нашей стране и за рубежом (Япония, США, Германия). Термин «пробиотики» был предложен в 1977 году Ричардом и Паркером. Под пробиотиками принято понимать микроорганизмы и продукты их ферментации, обладающие антагонистической активностью к патогенной микрофлоре. Микроорганизмы, используемые как пробиотики для животных, классифицируют на 4 группы: аэробы - спорооб-разующие бактерии рода Bacillus; анаэробы - спорообразующие бактерии рода Clostridium; бактерии, продуцирующие молочную кислоту (Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, не спорообразующие); дрожжи - используются в качестве сырья при изготовлении пробиотиков.
При выборе способа борьбы с инфекционными болезнями специалисты основное внимание уделяют патогенным микроорганизмам - возбудителям заболевания и нередко забывают о так называемой сопутствующей микрофлоре желудочно-кишечного тракта. Но в ряде случаев именно эта обычная микрофлора играет большую роль в возникновении или развитии болезни, способствуя либо препятствуя ее проявлению. В настоящее время одним из перспективных направлений в области лечения и профилактики болезней молодняка животных и птицы, вызываемых условно-патогенной микрофлорой, является использование пробиотиков. В состав пробиотиков чаще всего входят микроорганизмы, относящиеся к родам Lactobacillus и Streptococcus и являющиеся как раз представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных. Пробиотики обладают ростостимулирующим эффектом, нормализуют микрофлору кишечника, стимулируют иммунную систему и благотворно влияют на жизнеспособность животных и птиц, предотвращая тем самым распространение в организме патогенных бактерий (Б.Бессарабов, А. Крыканов, И. Мельников, Д.Джозеф, 1996; Е.В.Зинченко, А.Н.Панин, 2000; М.А.Сидоров, В.В.Субботин, Н.В.Данилевская, 2000; Б.В.Тараканов, 2000; В.А. Белявская с соавт., 2001; Г.Ф. Бовкун, 2003;И.П. Кондрахин, 2003).
В настоящее время считается бесспорным факт того, что дисбактерио-зы сельскохозяйственных животных и птиц приобретают широкое распространение, так как при отсутствии своевременной коррекции нарушений нормомикрофлоры весьма высока вероятность развития у них тяжелых рецидивирующих инфекционных заболеваний, иммунодефицитов и других болезней. (М.Ш. Алиев, A.M. Алимов, 2000; Н.И. Косяев с соавт., 2000; Е.В. Зинченко с соавт., 2000; В.И. Моргунова с соавт. 2003; А.С. Овод, 2003; Р.Т. Сафиуллин, И.Е.Тнорин, 2004).
Нормальная микрофлора (прежде всего кишечника) оказывает выраженное детоксикационное действие в отношении соединений, попадающих извне и образующихся в организме хозяина. Процесс детоксикации с ее участием идет по нескольким направлениям: биотрансформация с образованием нетоксичных конечных продуктов; микробная трансформация, сопровождающаяся образованием метаболитов, подвергающихся быстрому разрушению в печени; изменение полярности соединений, приводящей к ускорению их эвакуации во внешнею среду или к снижению их транслокации из кишечника в кровяное русло (Б.А. Шендеров, 1987).
Изучение особенностей в формировании дисбиоза стрессовых состояний позволило выявить причастность к дисбиотической перестройке микрофлоры кишечника ряда экстремальных факторов. Накопленный в литературе научный материал позволяет считать, что микробный ответ в кишечнике при стрессовой ситуации складывается из реакции бифидобактерий и лактоба-цилл, включая их видовую перестройку, нарушения экологического барьера и колонизации условно- патогенной флорой.
Наибольшее значение с точки зрения регуляции кишечной микрофлоры имеют стрессовые изменения в пищеварительном и иммунологическом статусе (Н. Н. Лизько, 1989), количество и качество пищеварительных секретов определяют состав химуса, т.е культуральную среду для микрофлоры желу-дочно - кишечного тракта. С ее изменением, по видимому, и связано снижение бифидобактерий и лактобацилл (Н.Н. Лизько, 1989; В.М. Бондаренко, 1992; Б.А. Шендеров, 1992; A. Naukkarinen, 1986).
В то же время важнейшим фактором колонизации является адгезия, при этом стрессовая ситуация создает условия к изменению как адгезивных свойств бактерий, так и адгезивности клеток макроорганизма (К.В.Смирнов, A.M. Уголев, 1981; Н.Н. Лизько, 1989; R.Fuller, 1986; I. Kok,G.Venema, 1988; R. Roth, W.D. James, 1988; D.C. Savade, 1989; L.T. Axselsson et al., 1989; G. Perdigon et al., 1990). Снижение иммунологической резистентности существенным образом может сказаться и на топографическом распределении отдельных групп микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте. Следует отметить, что при стресс-реакции отмечаются отклонения со стороны практически всех видов обмена. Таким образом, ответ микрофлоры кишечника на стрессовые воздействия вносит известную квоту в общую реакцию организма (R.Roth, 1988; Е. Domanski et al., 1972; J.Clemmesen, 1989; M.A. Daeschel, 1989; E.M. Deitch, E. Specian, 1990; M.T. Leon, 1992). Роль бифидобактерий и лактобацилл, как в осуществлении барьерной функции кишечника, так и жизнедеятельности макроорганизма, а также значение их дефицита в дисбио-тическом сдвиге микрофлоры пищеварительного тракта обусловили поиск средств и способов восстановления бифидо- и лактофлоры.
Материал и методы исследований
Работа выполнялась с 2000 г. в условиях лаборатории микробиологии и иммунологии Башкирского государственного аграрного университета, в Башкирской научно - производственной ветеринарной лаборатории и в условиях НПХ «Максимовское» Уфимского района.
В производственных опытах использовано 120 голов поросят с 30 дневного возраста.
Животные 1 группы были контрольные. Они содержались в одинаковых условиях кормления и содержания с поросятами опытных групп и никакие дополнительные манипуляции с ними не проводились.
Животным 2 группы 1 раз в день, ежедневно в течение 30 дней, с водой выпаивали по 10 мл настойки валерианы и пустырника и задавали с кормом цеолиты Сибайского месторождения в дозе 20 г/гол.
Поросятам 3 группы 1 раз в день, ежедневно в течение 30 дней, выпаивали прополисное молочко в дозе 10 мл/гол, добавляя в качестве кормовой добавки цеолиты.
В рацион поросят 4 группы вносили настойку валерианы и пустырника в комплексе с прополисным молочком и цеолитами.
Животные 5 группы получали те же препараты, что и в 4 группе на фоне пробиотикотерапии. Лактобифид задавали по 1 дозе (препарат представляет собой таблетку белого цвета, средней массой 0,1- 0,25 г- одна доза) в течение 7 дней.
До начала опытов (30 дневные), а затем через 10, 20, 30, 45 и 60 дней от начала опытов проводились взятие крови и фекалий для иммунологических и микробиологических исследований.
Бактерицидную активность сыворотки определяли по П.А. Емельянен-ко (1980). С этой целью в обычные микробиологические пробирки разливали по 4,5 мл бульона Хоттингера. В опытные пробирки добавляли по 1 мл исследуемой сыворотки, а в контрольные - бульон Хоттингера в таком же количестве. Во все пробирки вносили по 1,0 мл 2,5 млрд. взвеси тестмикроба (Staphylococcus aureus). После внесения компонентов реакции пробирки встряхивали и из каждой стерильной пипеткой отбирали по 2 мл содержимого для измерения оптической плотности на ФЭК - М, то есть определения Д 1. Измерения проводили в кюветах с рабочей длиной 5 мм при зеленом светофильтре против дистиллированной воды. Пробирки с оставшимся содержимым закрывали пробками и помещали в термостат на 2 часа 15 минут. Затем вновь определяли оптическую плотность, то есть находили Дг. Бактерицидную активность исследуемой сыворотки выражали в процентах, вычисляя по формуле:
В расчете использовали средние арифметические значения Д) и Дг контроля, полученные во всех параллельных пробирках.
Активность комплемента в сыворотке крови устанавливали титрованием в гемолитической системе, в объеме 0,5 мл эритроциты барана дважды отмывали в растворе Хенкса центрифугированием в течение 10 минут при 1000 об ./мин. Готовили 2,5% взвесь эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида. К взвеси эритроцитов добавляли равный объем гемолизина в рабочем титре. Сенсибилизацию проводили в термостате при температуре 37 С в течение 30 минут. К последовательным разведениям сыворотки в объеме 0,3 мл добавляли 0,2 мл сенсибилизированных эритроцитов. Реакцию ставили на плексиглазовых пластинках. В контрольные луночки приливали по 0,3 мл изотонического раствора натрия хлорида и по 0,2 мл сенсибилизированных эритроцитов. Учет реакции проводили после 45-минутного выдерживания в термостате по 100% гемолизу эритроцитов.
Выделение В - лимфоцитов у поросят проводили с эритроцитами быка. Антисыворотку против эритроцитов быка получали от кроликов, иммунизированных внутривенно с двухдневным интервалом с 25, 50 и дважды с 75% осадком эритроцитов. У кроликов через неделю после последней иммунизации, брали кровь, получали антисыворотку и определяли титр. Антисыворотку хранили в холодильнике при 4 С. Для получения комплекса (эритроциты, антисыворотка, комплемент) 2,5% взвесь эритроцитов быка в среде 199 смешивали с антисывороткой в субагглютинирующем разведении. Смесь инкубировали 30 минут при 37С. Затем отмывали дважды средой 199 при 1000 об/мин. в течение 10 мин. и к осадку добавляли 2 мл среды 199 и 2 мл комплемента в нужном разведении (0,2 мл мышиной сыворотки + 1,8 мл среды 199) и инкубировали при 37С 30 минут. Нагруженные антисывороткой и комплементом эритроциты трижды отмывали средой 199 (при 1000 об/мин., Ю 1 Готовили 0,5% концентрацию эритроцитов. Затем к 0,1 мл этой суспензии добавляли 0,1 мл лимфоцитов крови, инкубировали в термостате при температуре 37С в течение 5 минут и центрифугировали 5 минут при 1000 об/мин. Приготовленную таким образом смесь оставляли при комнатной температуре на 1 час, затем ресуспендировали в среде 199 и в камере Горяе-ва, подсчитывали количество розеткообразующих клеток. За В-лимфоциты поросят принимали клетки, присоединившие 3 и более эритроцитов.
Определение субпопуляций Т-лимфоцитов проводили в реакции спонтанного розеткообразования с теофиллином (Т-хелперы-теофиллин-резистентные, Т-супрессоры-теофиллинчувствительные-S.Limtibui et al., 1978).
Экономическая эффективность проводимых мероприятий
Определение ущерба от снижения продуктивности животных вследствие заболеваемости: У=Мз х (Вз-Вб) х Т х Ц, где У - ущерб от снижения продуктивности вследствие заболеваемости; Мз - количество заболевших животных, гол.; Вз - среднесуточный прирост живой массы от больных, но подвергаемых лечению, животных, кг; Вб -среднесуточный прирост живой массы от больных, не подвергаемых лечению, животных, кг; Т - средняя продолжительность наблюдения за изменением продуктивности животных; Ц - цена реализации единицы продукции, руб.;
2. Определяем предотвращенный ущерб
У, где, Пу - предотвращенный экономический ущерб; Мо - общее поголовье животных в опыте; Кз - коэффициент возможной заболеваемости животных; Кп - коэффициент потерь основной продукции в расчете на одно заболевшее животное; Ц - цена реализации единицы продукции, руб.; У - фактический экономический ущерб
Отечная болезнь поросят наносит значительный экономический ущерб свиноводству. Решающая роль в этиологии ОБП принадлежит бактериальной интоксикации из кишечника. Одни авторы считают ее специфическим возбудителем бета-гемолитические штаммы кишечной палочки разных серотипов, особенно 08, 0138, 0139, 0141 и 0149, другие кишечный - вибрион, третьи -кокковую микрофлору, четвертые утверждают, что это кормовая аллергия, возникающая у поросят в период интенсивного обмена веществ и усиленного роста. Некоторые относят отечную болезнь в группу авитаминозов В (С.Г. Братчик с соавт. 1983; П.С.Матюшев, 1982, 1985; М.К. Ступак, 1982, 1984, 1985, 1987; B.C. Бузлама соавт., 1984; Д.М. Голбан, 1985;). Отсутствие единой точки зрения на этиологию болезни затрудняет разработку эффективных мер борьбы с ней. В частности попытки создать вакцину остались безуспешными. При этом следует отметить, что интерес к этой болезни у ученых был в период с 1982 по 1985 г.г. В последующие годы сведения об отечной болезни встречаются очень незначительно, хотя проблема этого заболевания, напротив имеет тенденцию к активизации (Р.А.Сетдеков, 2002; А.А. Коломыцев, 2005).
Нашими исследованиями установлено, что отечная болезнь возникает на фоне вторичных иммунодефицитов, дисбактериозов и нарушений минерального обмена в период отъема поросят. У стресспозитивных линий животных отъем вызывал понижение факторов естественной резистентности: комплементарной активности сыворотки крови в 1,22 раза (на 5,2 ед), бактерицидной активности - в 1,19 раза (на 7,1 %), а также показателей клеточного и гуморального звена иммунитета. Уровень Т-Е-РОК- лимфоцитов в крови понизился в 1,04 раза (на 1,7 %), Т-хелперов в 1,17 раза (на 2,9%), В-ЕАС-лимфоцитов в 1,03 раза (на 0,5%), при активизации в организме супрессор-ных реакций.
Понижение иммунного статуса поросят после отъема объясняется по -видимому рядом причин, и в первую очередь, стрессом. Стрессовый фактор сопровождается повышением активности гипоталамо- аденогипофиз- корти-косупраренальной и симпатико-адреналовой систем. Это, в свою очередь, приводит параллельно к нарушению баланса кишечной микрофлоры: затормаживанию активности бифидобактерий в 1,9 раза (на 3,9 lg КОЕ/г), лакто-бацилл в 1,59 раза (на 3,1 lg КОЕ/г), при повышении размножения условно-патогенных клостридий в 1,19 раза (на 1,5 lg КОЕ/г), стафилококков в 1,32 раза (на 2,5 lg КОЕ/г), псевдомонов в 1,19 раза (на 1,5 lg КОЕ/г). Эти данные являются дополнением к имеющимся в литературе сведениям об активизации гемолитических эшерихий, стафилококков (П.С. Матюшев, 1976, 1982) при отечной болезни поросят. В этой связи следует учесть, что патогенные микробы обеспечивают свое вегетирование в организме животного лишь в том случае, если они обладают способностью нарушить его естественные защитные приспособления. Ослабление или подавление защитных приспособлений организма при инфекционной болезни обусловлено воздействием сложной системы ферментов, токсических веществ возбудителя и продуктов тканевого распада.
