Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Биологические особенности спортивных лошадей 11
1.2 Значение биологически активных продуктов пчеловодства прополиса и цветочной пыльцы в медицине и ветеринарии 19
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы и методы исследований 39
2.2 Результаты собственных исследований
2.2.1 Иммунный статус и его коррекция продуктами пчеловодства у спортивных лошадей
2.2.1.1 Влияние прополиса и цветочной пыльцы в композиции с медом на состояние естественной резистентности спортив ных лошадей
2.2.1.1.1 Динамика лизоцимной активности сыворотки крови 47
2.2.1.1.2 Динамика бактерицидной активности сыворотки крови 50
2.2.1.2 Фагоцитоз, его коррекция прополисом и цветочной пыльцой в композиции с медом у спортивных лошадей 53
2.2.1.3 Влияние прополиса и цветочной пыльцы в композиции с медом на показатели Т- и В-систем иммунитета спортивных лошадей
2.2.1.3.1 Динамика содержания Т-Е-РОК-лимфоцитов, Т-
хелперов и Т-супрессоров в крови 56
2.2.1.3.2 Динамика содержания В-ЕАС-лимфоцитов в крови 64
2.2.2 Микробиоценоз кишечника и его коррекция у спортивных ло-
шадей
2.2.2.1 Динамика бифидобактерий и лактобацилл 67
2.2.2.2 Динамика содержания условно-патогенных микроорганизмов 73
2.2.3 Минеральный обмен и его коррекция у спортивных лошадей
2.2.3.1 Динамика содержания общего кальция в крови 85
2.2.3.2 Динамика содержания железа в крови 88
2.2.3.3 Динамика содержания цинка в крови 90
2.2.3.4 Динамика содержания меди в крови 93
2.2.3.5 Динамика содержания марганца в крови 96
2.2.4 Коррекция ферментативных обменных процессов у спортивных лошадей
2.2.4.1 Динамика содержания глюкозы в крови 99
2.2.4.2 Динамика содержания общего белка в крови 102 3
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 106
ВЫВОДЫ 120
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 122
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 123
ПРИЛОЖЕНИЕ 156
- Биологические особенности спортивных лошадей
- Иммунный статус и его коррекция продуктами пчеловодства у спортивных лошадей
- Динамика содержания общего кальция в крови
Введение к работе
Актуальность работы. В условиях научно-технического прогресса народнохозяйственное значение лошади определяется четырьмя основными направлениями: племенное (коннозаводство), рабочепользовательное, продуктивное и спортивное коневодство.
Спортивное коневодство включает выращивание и подготовку лошадей для классических видов конного спорта, конно-спортивных игр и состязаний, конного туризма и проката, соревнований, олимпийских игр. Интенсификация спортивного направления возможна за счёт совершенствования существующих, создания новых типов и пород лошадей (украинской верховой, англо-кабардинской и др.), разработки и внедрения прогрессивных технологий выращивания лошадей для разных видов спорта, создания специальных центров по подготовке лошадей к международным и олимпийски играм, подготовки квалифицированных кадров.
Развитию конного спорта в Башкортостане стали уделять особое внимание в последние годы. Во многом этому способствовало принятие в 2000 году специального постановления Кабинета Министров РБ, программы развития коневодства в Республике Башкортостан на 2001-2005 годы и создание в 2003 году Координационного совета по коневодству. Все это позволило привлечь к спортивному коневодству максимальное количество коневодческих хозяйств, коневладельцев и спортивных школ.
Организм лошади может проявлять максимальные селекционно-обусловленные признаки работоспособности, в том числе свой резвостный потенциал, при стабильных выступлениях в условиях соревнований и иппо-дромных испытаний лишь при наличии соответствующих условий для их реализации. Изучение иммунологической реактивности при различных состояниях
организма лошадей является одной из основных задач ветеринарной науки.
Конноспортивные состязания и подготовка к ним связаны с огромными физическими нагрузками на лошадь на фоне быстро меняющихся условий окружающей среды, принуждения, психоэмоциональных воздействий. Степень и глубина стрессовых «возмущений» в организме спортивных лошадей, их своеобразная «устойчивость» в период соревнований к различным факторам во многом зависит от рациональной системы тренинга, регулярного ветеринарного контроля за состоянием здоровья, кормления и содержания животных. Недостаточно подготовленные троеборные лошади, как правило, снимаются при ветконтроле или плохо выступают в конкурных соревнованиях и надолго выбывают из строя, так как требуется значительное время (недели, месяцы) для восстановления спортивных (рабочих) кондиций (ВограликМВ., Послов Г.А., 1981, 1985).
Как показал анализ отечественной и зарубежной литературы, неправильный режим эксплуатации различных видов животных, в т.ч. и спортивных лошадей, оказывает стрессовые воздействия, последствия которых становятся одной из причин или условий возникновения заболеваний многих органов и систем. При этом, как отмечают исследователи, нарушаются механизмы иммунного гомеостаза, связанного со специфическими и неспецифическими факторами защиты животного организма (Балакин О.А., 1982; Ласков А.А., Пушкарева С.А., 1984; Фролов Б.А., 1984).
В настоящее время назрела необходимость изыскания и внедрения способов коррекции естественной резистентности спортивных лошадей, способствующих подавлению последствий нервных и эндокринных механизмов различных стрессов в коневодстве (транспортный, тренинговый и т.д.).
Одними из ключевых проблем коневодства являются управление метаболическими процессами в организме спортивных лошадей, обеспечи 6 вающее эффективное потребление энергии за счет нетрадиционных кормовых средств, оптимизация полноценности рациона кормления лошадей разных половозрастных групп и направлений использования с помощью биологически активных веществ (БАВ). Особый интерес представляют препараты, изготовленные из природного, легко доступного сырья. К таковым можно отнести препараты пчеловодства - мед, прополис и цветочную пыльцу, обладающих разносторонней биологической активностью.
Большое количество научных исследований посвящено изучению биологических свойств прополиса (В.П.Кивалкина, 1948-1991; З.Х.Каримова с соавт., 1973, 1980; Н.В.Панкратов, 1979; Т.А.Шуб, 1982; П.Лави, 1985; А.А.Барсков с соавт., 1990; Н.С.Асфандиярова с соавт., 1993; С.ПЛриходько с соавт., 1993; Ш.М.Омаров, 1987, 1997; Р.Т.Маннапова с соавт. 1988- 2001; С.О.Шилов, 2000; П.Я.Гущин с соавт., 2001; А.Ф.Загретдинов, 2000, 2001; З.З.Ильясова, 2001 и др.).
Следует отметить, что вопросы влияния продуктов пчеловодства на неспецифические факторы иммунитета спортивных лошадей в доступной литературе освещены недостаточно.
В последние годы появилось достаточное количество работ показывающих, что можно с успехом управлять иммунным ответом и при снижении функции иммунитета стимулировать его. Поэтому одной из важных проблем медико-биологической и ветеринарной науки и практики является изыскание мер и средств, направленных на снижение действия неблагоприятных факторов на гомеостаз организма и профилактику развития иммуно-дефицитных состояний.
С другой стороны, отмечаются значительные отклонения в аутофлоре животных, вызванные такими явлениями, как нарушения условий содержания и кормления животных, постоянные стрессовые воздействия различной этиологии, широкое и бесконтрольное применение антибактериальных препаратов и другие факторы, способствующие негативным сдвигам бифидофлоры. На фоне дефицита бифидофлоры нарушаются нормальные соотношения между облигатными микроорганизмами кишечника. Отмечается снижение количества или полная элиминация латобацилл, увеличение или снижение кишечных палочек и повышение ассоциации условно-патогенных бактерий.
Низкое содержание бифидобактерий и лактофлоры оказывает неблагоприятное влияние на секреторную функцию кишечника, процессы всасывания, некоторые показатели белкового, липидного и минерального обменов, вита-минсинтезирующую и ферментативную функции. Аномально размножающиеся микроорганизмы продуцируют нежелательные продукты метаболизма и создают условия для дисбактериоза (Г.И.Гончарова с соавт., 1989; В.А.Антипов, 1990, 1991; Т.Н.Грязнева с соавт., 1991; А.А.Воробьев с соавт., 1995; Н.И.Малик с соавт., 2001). Поэтому необходимы исследования в направлении поиска средств, оказывающих благоприятное воздействие не только на иммуногенез, но и нормализацию микробиоценоза кишечника, путем создания в нем благоприятного физиологического и биохимического режимов.
В связи с вышесказанным целью нашей работы явилось: изучить состояние иммунного статуса, естественного микробиоценоза кишечника и минерального обмена спортивных лошадей на фоне активных физических нагрузок и разработать эффективные методы их коррекции медовыми композициями с прополисом и цветочной пыльцой.
В задачи исследования входило:
1. Изучить влияние медовых композиций с прополисом и цветочной пыльцой на состояние естественной резистентности и фагоцитоза спортивных лошадей со сравнительной оценкой:
а) динамики активности лизоцима сыворотки крови;
б) динамики бактерицидной активности сыворотки крови;
в) динамики фагоцитарной активности нейтрофилов крови. 2. Определить влияние медовых композиций с прополисом и цветочной
пыльцой на показатели Т- и В-систем иммунитета спортивных лошадей с учетом:
а) динамики содержания Т-Е-РОК-лимфоцитов, Т-хелперов и Т- супрессоров в крови;
б) динамики содержания В-ЕАС-лимфоцитов в крови.
3. Установить влияние медовых композиций с прополисом и цветочной пыльцой на показатели естественного микробиоценоза кишечника спортивных лошадей:
а) динамику количества бифидобактерий и лактобацилл;
б) динамику количества условно-патогенных микроорганизмов.
4. Разработать эффективные методы коррекции минерального обмена в организме спортивных лошадей с применением меда, прополиса и цветочной пыльцы с учетом:
а) динамики общего кальция в сыворотке крови;
б) динамики микроэлементов в сыворотке крови (железа, цинка, меди и марганца).
5. Изучить влияние прополиса, меда в комплексе с прополисом и меда с цветочной пыльцой на некоторые биохимические показатели спортивных лошадей:
а) динамику содержания глюкозы в сыворотке крови;
б) динамику содержания общего белка в сыворотке крови.
Научная новизна исследований состоит в том, что впервые проведено изучение влияния медовых композиций с прополисом и цветочной пыльцой на показатели естественной резистентности, фагоцитоза, Т- и В-системы иммунитета, минеральный обмен, биохимические реакции и микробиоценоз кишечника спортивных лошадей на фоне интенсивной тренинговой нагрузки. Практическая значимость работы. На основании показателей естественной резистентности, фагоцитоза, параметров Т- и В-систем иммунитета, состояния минерального обмена, биохимических реакций, микробноценоза кишечника, с учетом влияния на организм меда и биологически активных продуктов пчеловодства - прополиса и цветочной пыльцы, теоретически и практически обоснована необходимость применения в спортивном коневодстве медовых композиций, как препаратов, обладающих хорошими иммунокорре-гирующими и иммуностимулирующими свойствами, способствующих созданию в организме животных иммунного баланса, восстановлению минерального обмена и микробиоценоза кишечника. Полученные данные позволяют рекомендовать их спортивному коневодству как эффективные средства. Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Состояние естественной резистентности, фагоцитоза, Т- и В-систем иммунитета у спортивных лошадей, их коррекция медом в комплексе с прополисом и цветочной пыльцой,
2. Оценка естественного микробиоценоза кишечника (нормофлоры и условно-патогенных микроорганизмов) и пути его коррекции медовыми композициями с прополисом и цветочной пыльцой.
3. Состояние минерального обмена у спортивных лошадей при высокой интенсивности тренинговых нагрузок и пути его коррекции биологически активными продуктами пчеловодства.
4. Изменение некоторых биохимических показателей крови (общего белка и глюкозы) при применении прополиса, меда и цветочной пыльцы в различных сочетаниях.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на республиканской научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов (Уфа, 2003), на научно-практической конференции БГАУ (Уфа, 2004), международной научно-практической конференции «Современные проблемы иммуногенеза, теории и практики борьбы с паразитарными и инфекционными болезнями сельскохозяйственных животных» (Москва-Уфа, 2004), на международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбио-тики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004).
Публикация результатов исследований. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 10 научных статьях.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах компьютерного текста, включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и практические предложения. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 21 рисунком. Список литературы включает 256 наименований, в том числе 73 иностранных авторов.
Биологические особенности спортивных лошадей
С развитием индустрии конного спорта остро встала проблема поиска наиболее эффективных способов лечения и профилактики различных заболеваний лошадей. При интенсивных физических нагрузках организм лошади испытывает стрессовое состояние, снижается естественная резистентность и может возникнуть заболевание той или иной системы.
Литературные материалы, посвященные исследованиям состояния естественной резистентности организма сельскохозяйственных животных, свидетельствуют о том, что специфическая и неспецифическая реактивность определяется различными, довольно динамичными показателями, которые определяются как генетическими особенностями организма, так и воздействием различных факторов внешней среды. Изменением силы и продолжительности воздействия того или иного фактора можно направленно влиять на формирование и проявление защитных сил организма (Санжаров В.А. с соавт., 1981; ПушкареваС.А., 1985).
Умеренное действие различных нагрузок на организм животного тренирует системы защитных сил, расширяет их функциональные возможности, что в целом благоприятно сказывается не только на состоянии здоровья, но и на продуктивности (Сиротин Н.Н., 1981; Ширванян Т.А., 1981; Федоров ЮЛ. с соавт., 1982; Карпуть И.М,, 1983, Коромыслов П.Е., 1983).
Биологическая сущность тренинга спортивных лошадей заключается в выработке полезных рефлексов, синхронности ритмов дыхания и движения и приспособлении мышечной, дыхательной и сердечно-сосудистой систем к выполнению необходимых функций при определенных физических нагрузках. Тренинг, систематически проводимый из поколения в поколение, — это не только один из видов направленного воздействия на организм отдельной лошади, но и путь к совершенствованию всей породы. Правильно организованный тренинг ведет к всестороннему физиологическому развитию всех систем организма и созданию желательного типа лошади.
Процессы активации неспецифических факторов защиты и иммунологической реактивности под влиянием различных нагрузок, не выходящих за рамки «физиологического стресса» были зарегистрированы у спортивных лошадей в период тренировок (Осидзе Д.Ф., 1983).
Однако также установлено, что длительное непрерывное действие каких-либо неблагоприятных факторов (транспортировка, недостаточное и неполноценное кормление, нарушение способа и технологии содержания, несоответствующие зоогигиеническим нормам параметры микроклимата и т.д.) приводит к срыву адаптационных механизмов, снижению естественной резистентности, повышению восприимчивости животных к различным заболеваниям и уменьшению продуктивности.
Исследователи пришли к выводу, что воздействие повышенных тренировочных (мышечных) нагрузок вызывает характерные для стресса изменения в активности симпатоадреналовой и гипофизарно-надпочечниковой систем. Подобные изменения наблюдали в организме лошадей при введении им АКТГ (Slone D.E., 1983). Кроме того, после мышечной работы в крови лошадей были выявлены характерные для стрессовой реакции изменения в морфологическом составе лейкоцитов: нейтрофильный лейкоцитоз, эозино-пения и лимфопения (Burquer Р., 1983).
В результате опытов было установлено, что различные виды тренинго-вых нагрузок вызывают в крови лошадей концентрации катехоламинов, глюкокортикоидов, инсулина (Show D. et al.5 1981; Turner V. et al., 1989; KerrD., 1992). При высоком уровне тренинга скаковых лошадей (интенсивная мышечная работа, работа под седлом, на корде, выступление в призу) были выявлены изменения в крови концентрации различных микроэлементов. Так, Со-dazza D (1984), установил, что в условиях неправильного режима тренировочных нагрузок наиболее значительно уменьшается содержание калия - на 19,4 %, магния - на 7,8 %, меди — на 8,0 %; выявлено достоверное падение содержания цинка в сыворотке крови.
Не вызывает сомнения, что снижение уровня микроэлементов в крови лошадей при стрессах может стать фактором, лимитирующим работоспособность животного и стать причиной различных заболеваний.
На основании сравнительных исследований по влиянию на организм лошади тренировочных нагрузок различной интенсивности многими авторами сделан вывод об однонаправленных реакциях исследуемых физиологических систем. Степень изменения концентрации различных ферментов и аминокислот в крови лошадей свидетельствует о значительной активации их организма на клеточном уровне. Причиной высокой ферментации может быть только напряженная мышечная работа или высокая степень утомления (Пушкарева С.А., 1985).
Небольшие по силе или длительности нагрузки оказывают благоприятное действие на весь организм в целом и на иммунную систему в частности. При этом отмечают активизацию фагоцитоза, повышение продукции антител и т.д., что положительно сказывается на противоинфекционной защите и утилизации токсических продуктов обмена веществ. При увеличении длительности тренинга наблюдается угнетение общей иммунореактивности организма лошади (Яковлев И.Н., 1984).
Стрессы различной природы, как и продолжительность и интенсивность их действия, могут усиливать или ослаблять факторы неспецифической резистентности (лизоцим, бактерицидная активность сыворотки крови, фаго 14 цитоз и др.), а также и специфический гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ. Так, по данным Послова ГА. (1999) транспортировка жеребят на расстояние 300 км снижала бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови лошадей при низкой наружной температуре, соответственно на 25 и 21 %? а в летнее время - почти в 1,5 раза. Также обнаруживалось снижение фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов.
Исследованиями многих авторов установлено, что низкие гематологические показатели наблюдаются у быстроаллюрных лошадей как при недостаточной их тренированности, так и при чрезмерных нагрузках.
А А. Ласков с соавт. (1982) отмечают, что особое значение приобретают исследования функционального состояния лошади при перетренированности, которая по многим причинам имеет сходство с патологией. Основная причина перетренированности - нервно-психические воздействия. Перетренированность наступает тогда, когда пытаются повысить результаты путем нерационального увеличения напряжения в тренировке. Она, как правило, наступает в период соревнований при чрезмерном применении резвых работ, нарушении чередования отдыха и работы, неполноценном кормлении и т.п.
Снижение показателей работоспособности в скачке или на резвых галопах хотя и является хорошо распознаваемым признаком перетренированности, но по существу это уже запоздалый симптом. Поэтому важна более ранняя диагностика этого состояния, что предотвращает снижение работоспособности и появление признаков хронического переутомления. При этом особое внимание, как замечает ряд авторов (Анке М.5 1984; Зенкович Е.И., 1993; Дорофеев В.Н., 1995) следует уделять двухлетним лошадям, организм которых еще недостаточно окреп.
Многолетние наблюдения показывают (Милн Д.В., 1982; Ласков А.А., Пушкарева С.А., 1984; Неустрокев М.П., Малышева В.И., 1995; Allen В. et al., 1984), что выдающиеся скакуны имеют те или иные отклонения в сер 15 дечно-сосудистой, иммунной системах. Опасность заключается в том, что порой незначительные отклонения в состоянии здоровья при больших нагрузках могут привести к серьезным нарушениям патологического характера, возникновению перетренированности и перенапряжению, снижают работоспособность.
Ветеринарно-врачебный контроль за гематологическими и иммунными показателями необходим не только для проведения профилактических и лечебных мероприятий, но и для помощи тренеру в рациональном планировании тренинга спортивных лошадей.
Иммунный статус и его коррекция продуктами пчеловодства у спортивных лошадей
Опыты по изучению иммунного статуса и возможности его коррекции у спортивных лошадей проведены на 20 жеребцах 5-6 летнего возраста, которые по принципу аналогов были разделены на четыре группы по пять животных в каждой: первая группа - контрольная, содержащиеся на обычном рационе; со второй по четвертую - опытные, в рацион которым вводили различные продукты пчеловодства: во второй группе - лошадям добавляли настойку прополиса в виде про-полисного молочка; в третьей группе - лошадям задавали мед в композиции с настойкой прополиса в виде прополисного молочка; четвертой группе - мед в комплексе с цветочной пыльцой (таблица 1). Все указанный биологически активные продукты пчеловодства лошадям задавали один раз в день перед кормлением в течение 10 дней в дозах: прополисное молочко — по 100-150 мл на голову, мед - по 150 г на животное, цветочную пыльцу - по 40 г на животное.
Животные содержались в индивидуальных денниках; рацион включал разнотравное сено, травяную муку, концентраты (овес, ячмень), овощи и фрукты (морковь, яблоки). Рацион был сбалансирован по основным питательным веществам, макро-, микроэлементам, витаминам. Тренинговые нагрузки у всех опытных жеребцов были одинаковыми, средней степени интенсивности.
Основной (20%-ный) спиртовой экстракт прополиса (настойка прополиса) готовили настаиванием 20 г мелкоизмельченного в виде стружки и освобожденного от примесей (кусочков вощины, трупов пчел и др.) прополиса, отвечающего требованиям ГОСТ-28886-90, в 100 мл 96% этилового спирта при комнатной температуре в течение 24 часов при периодическом перемешивании. Затем отстаивали в прохладном месте (при +10+12С) в течение двух суток и фильтровали через бумажный фильтр. Спиртовой экстракт прополиса представляет собой прозрачную, темно-коричневого цвета жидкость, В готовом экстракте содержится от 10 до 15 % АДВ. Настойку хранят в хорошо закупоренных склянках из темного стекла при комнатной температуре. Срок хранения - до двух лет.
Прополисное молочко готовили из расчета 5 мл 20%-ного спиртового экстракта прополиса на 500 мл кипяченой и охлажденной воды. Доза составила 150 мл на голову. Выпаивание прополисного молочка проводили в указанной дозе один раз в день перед кормлением в течение десяти дней.
Цветочная пыльца, применяемая в исследованиях соответствовал ГОСТ 28887-90 «Пыльца цветочная (обножка)».
До начала опыта, а затем на 10, 20, 30 и 60-й дни проводили взятие крови и каловых масс для иммунологических и микробиологических исследований.
Лизоцимную активность сыворотки крови устанавливали по В.Г.Дорофейчуку (1981). В качестве индикатора активности лизоцима применяли суточную культуру Micrococcus lysodecticus, выращенную на косом МПА по общепринятой методике. Из суточной агаровой Micrococcus lyso-decticus готовили взвесь на физиологическом растворе (рН 7,2-7,4) и стандартизировали на ФЭК при зеленом светофильтре в кюветах № 2 (толщина стенки 3 мм). Оптическая плотность взвеси должна быть в пределах 0,46-0,50. Затем в обычные микробиологические пробирки наливали 1,47 мл приготовленной стандартной микробной взвеси Micrococcus lysodeicticus и добавляли 0,03 мл исследуемой сыворотки, пробирку встряхивали, полученную смесь выливали в стерильную кювету и определяли оптическу плотность - До- После этого содержимое кюветы переливали в пробирку и ставили в термостат на 1 час при 37С, после чего вновь определяли оптическую плотность - Д. По таблице, предложенной О.В.Бухариным (1981), вычисляли количество лизоцима в сыворотке крови в ед/мл.
Бактерицидную активность сыворотки крови определяли по ПА.Емельяненко (1980). С этой целью в обычные микробиологические пробирки разливали по 4,5 мл бульона Хоттингера. В опытные пробирки добавляли по 1 мл исследуемой сыворотки, а в контрольные - бульон Хоттингера в таком же количестве. Во все пробирки вносили по 0,1 мл 2,5 млрд. взвеси тест-микроба (Staphylococcus aureus). После внесения всех компонентов реакции пробирки встряхивали и из каждой, стерильной пипеткой, отбирали по 2 мл содержимого для измерения оптической плотности на ФЭК-Н (Ді-) Измерения проводили в кюветах с толщиной 5 мм при зеленом светофильтре против дистиллированной воды. Пробирки с оставшимся содержимым закрывали пробками и помещали в термостат на 2 часа 15 минут. Затем вновь определяли оптическую плотность, т.е. находили Д2. Бактерицидная активность исследуемой сыворотки выражали в процентах, вычисляя по формуле (1): Ю0.Д2опьіта Діопьітах100 2 контр. "Мконтр. где: Ді0пыта -оптическая плотность опытной пробирки до инкубации; Д2 опыта -то же самое, после инкубации; Ді контр - оптическая плотность контрольной пробы до инкубации; Да кошр, - то же самое после инкубации.
В расчетах использовали средние арифметические значения Ді и Да контроля, полученные во всех параллельных пробирках.
Для определения фагоцитарной активности нейтрофилов использовали гепаринизированную кровь. Объектом фагоцитоза служили суточные культуры Staphylococcus aureus, выращенные на агаре Хоттингера. В пробирки вносили по два объема гепаринизированной крови и один объем (500 млн./мл) взвеси суточной микробной культуры в 0,85% растворе натрия хлорида. Пробирки с содержимым после перемешивания инкубировали в термостате при 37С в течение 30 минут, потом помещали в чашки с проточной водой на пять минут. Затем готовили мазки, фиксировали их и окрашивали по Романовскому-Гимза. В каждом мазке подсчитывали процент фагоцитоза - количество фагоцитирующих нейтрофилов при подсчете 200 клеток (А.А.Тотолян, И.С. Фрейдлин, 2000).
Для получения лимфоцитов пробы крови брали из яремной вены в пробирки с предварительным добавлением гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл крови. Лимфоциты выделяли разделением в градиенте плотности фиколл-верографин (плотность 1,007 г/мл). Градиент готовили следующим образом: к 100 мл 9% фиколла (Pharmacia, Uppsala) добавляли 42 мл 36,17% раствора верографина, плотность доводили до 1,007 г/мл водой, измеряя денситометром. Кровь в объеме 2 мл, разведенную в два раза сбалансированным раствором Хенкса, наслаивали на 8-10 мл градиента и подвергали центрифугированию. После этого лимфоциты тщательно собирали из интерфазы пастеровской пипеткой, отмывали дважды средой №199 путем центрифугирования при 1000 об./мин в течение 5 минут. Осадок клеток ресуспендировали в ОД мл среды №199, подсчитывали в камере Горяева концентрацию лимфоцитов и доводили его средой до 2x106 в 1 мл.
Выделение В-лимфоцитов проводили с эритроцитами быка. Антисыворотку против эритроцитов получали от кроликов, иммунизированных дважды внутривенно с двухдневным интервалом с 25, 50 и с 75% осадком эритроцитов. У кроликов, через неделю после последней иммунизации, брали кровь, получали антисыворотку и определяли титр. Антисыворотку хранили в холодильнике при 4С. Для получения комплекса (эритроциты-антисыворотка-комплемент) 2,5% взвесь эритроцитов в среде №199 смешивали с антисывороткой в субагглютинирующем разведении. Смесь инкуб ировали 30 минут при 37С. Затем отмывали дважды средой №199 при 1000 об./мин в течение 10 минут и к осадку добавляли 2 мл среды №199 и 2 мл комплемента в нужном разведении (0,2 мл мышиной сыворотки + 1,8 мл среды №199) и инкубировали при 37С 30 минут. Нагруженные антисывороткой и комплементом эритроциты трижды отмывали средой №199 (при 1000 об./мин, 10 минут). Готовили 0,5% концентрацию эритроцитов. Затем к ОД мл этой суспензии добавляли 0,1 мл лимфоцитов крови, инкубировали в термостате при температуре 37 С в течение 5 минут и центрифугировали 5 минут при 1000 об./мин. Приготовленную таким образом смесь оставляли при комнатной температуре на 1 час, затем ресуспендировали в среде №199 и в камере Горяева подсчитывали количество розеткообразующих клеток. За В-лимфоциты принимали клетки, присоединившие 3 и более сенсибилизированных эритроцитов.
Определение популяции Т-лимфоцитов в крови коров проводили методом спонтанного розеткообразования лимфоцитов коров с эритроцитами кролика. Для постановки этой реакции готовили взвесь лимфоцитов и суспензии индикаторных эритроцитов. Для этой цели кровь кролика в соотношении 1:1 помещали в консервирующий раствор Олсвера. Концентрированными эритроцитами при 4С в холодильнике, пользовались в течение двух-трех недель. Перед каждой постановкой реакции эритроциты тщательно отмывали физиологическим раствором. Из осадка готовили 1% взвесь эритроцитов в среде №199. В небольшие пробирки наливали 0,2 мл суспензии лимфоцитов (2x106 /мл). Затем добавляли к лимфоцитам коров 0,4 мл взвеси эритроцитов и 0,2 мл среды №199. Смесь инкубировали 30 минут при температуре 37С, затем центрифугировали при 1000 об./мин в течение одной минуты и пробирки помещали в холодильник при 4С на 1-1,5 часа. Подсчет розеткообразующих клеток проводили в камере Горяева. За Т-клетки принимали лимфоциты, присоединившие три и более соответствующих эритроцитов. Оценку субпопуляций Т-лимфоцитов проводили в реакции розеткообразования с теофиллином (Г.Фримель, 1987).
Динамика содержания общего кальция в крови
Содержание общего кальция (таблица 16, рисунок 15) в крови спортивных лошадей первой контрольной группы колебалось на протяжении опыта в пределах от 3,18±0,05 до 3,34±0,07 ммоль/л.
У животных второй-четвертой опытных групп содержание в крови общего кальция увеличивалось с разной интенсивностью по срокам опыта.
Так, у лошадей второй группы описываемый показатель на протяжении опыта умеренно повышался в пределах от 3,19±0,04 до 4,15+0,09 ммоль/л. На 10-й день опыта он был выше фонового значения в 1,09 раза (на 0,30 ммоль/л), на 20-й день - в 1,21 раза (на 0,68 ммоль/л), на 390-й день - в 1,30 раза (на 0,96 ммоль/л) и на 60-й день - в 1,24 раза (на 0,75 ммоль/л).
В крови животных третьей и четвертой опытных групп содержание общего кальция изменялось более интенсивно по срокам опыта. К 10, 20, 30 и 60-му дням исследований уровень общего кальция в крови лошадей указанных групп увеличился, по сравнению с фоновыми значениями по группам, соответственно, в 1,09 и 1 ДО раза (на 0,30 и 0,33 ммоль/л), в 1,19 и 1,21 раза (на 0,62 и 0,69 ммоль/л), в 1,31 и 1,33 раза (на 1,04 и 1,05 ммоль/л), в 1,29 и 1,26 раза (на 0,95 и 0,85 ммоль/л).
Результаты определения в крови спортивных лошадей содержания цинка представлены в таблице 18, на рисунке 17.
У лошадей первой контрольной группы, которые содержались на обычном рационе, содержание цинка в крови находилось на протяжении исследований (60 дней) на уровне 24,4±0,69 - 26,7±0,28 мкмоль/л.
Мед, настойка прополиса и цветочная пыльца в различных сочетаниях способствовали увеличению количества данного микроэлемента в крови спортивных лошадей.
Изменения содержания цинка в крови лошадей, рацион которых был дополнен настойкой прополиса, происходили следующим образом. На 10-й день исследований наблюдалось некоторое увеличение данного показателя, в сравнении с фоновым значением по группе - в 1,16 раза (на 4,0 мкмоль/л), на 20-й день — в 1,19 раза (на 4,6 мкмоль/л). На 30-й день количество цинка в крови достигло максимума по группе, превысив фон в 1,23 раза (на 5,8 мкмоль/л), несколько снизившись к концу опыта (60-й день), но продолжая быть больше первоначального значения в 1,20 раза.
