Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
2.1. Иммунитет и иммунная система 9
2.2. Этиология и классификация иммунодефицитов 13
2.3. Диагностика иммунодефицитов 22
2.4. Профилактика и коррекция иммунодефицитов 25
2.5. Препараты селена — иммуномодуляторы 39
2.6. Анализ данных литературы 44
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 45
3.1. Материалы и методы исследований 45
3.2. Влияние антиоксиданта селедант на показатели естественной резистентности у стельных коров 48
3.3. Влияние селеданта на гуморальный иммунитет у стельных коров при специфической профилактике колибактериоза, парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита) 59
3.4. Влияние селеданта на гематологический и биохимический статус и клиническое состояние коров при специфической профилактике колибактериоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита 62
3.4.1. Биохимические качества и показатели иммунной защиты молозива первого удоя под влиянием селеданта 66
3.5. Формирование иммунного статуса у телят, полученных от иммунизированных коров, вакцинами в отдельности и в сочетании с селедантом 68
3.5.1. Влияние вакцинации коров в сочетании с селедантом на гематологический и биохимический статус телят 80
3.6. Производственная апробация мероприятий по профилактике желудочно - кишечных и респираторных болезней телят с применением специфических средств в отдельности и в сочетании с селедантом 89
3.6.1. Расчет экономической эффективности применения препарата селедант в сочетании с иммунизацией коров против колибактериоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита
и вакцинации телят против ПГ-3 и ИРТ 96
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 100
5. ВЫВОДЫ 106
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 108
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 109
ПРИЛОЖЕНИЯ
Введение к работе
Актуальность темы. Наиболее острой проблемой современного животноводства являются болезни молодняка. По данным ФГУ «Центр ветеринарии» Департамента ветеринарии Минсельхоза РФ в 2007 году заболело 3166,3 тыс. телят, что составило 77,8% к приплоду, из них на долю болезней органов пищеварения приходится 52,4 и респираторных заболеваний 35,1%, падеж от них составил соответственно 53,6 и 38,5%. Одной из главных причин широкого распространения и неблагоприятного течения болезней телят различной этиологии является низкий уровень естественной резистентности и иммунодефицит у новорожденных, обусловленные недостаточным морфологическим развитием и ослаблением функциональной активности органов и тканей, формирз^ощие заш,итные системы (Е.С. Воронин, 1994; А.Г. Шахов с соавт., 1997; В.Н. Денисенко, 1999; В.Т. Самохин с соавт., 2000).
Одной из причин, приводящих к супрессии факторов неспецифической иммунологической резистентности организма, является накопление в нем высокоактивных продуктов свободнорадикального окисления липидов (М.И. Рецкий с соавт., 2003, А.Г. Шахов, 2004).
В комплексе оздоровительных мероприятий при наиболее распространенных желудочно-кишечных и респираторных болезнях телят важное место принадлежит специфической профилактике. Однако иммунизация коров и телят на фоне нарушений обменных процессов организма, угнетения иммунной системы приводит к значительному снижению эффективности вакцин (М.С. Жаков с соавт., 2004).
В связи с этим для повышения эффективности иммунизации наряду с
ул)^шением кормления и содержания животных, важным моментом является повышение естественной резистентности и стимуляция поствакцинального иммунитета с помощью средств, обладающих иммуномодулирующими и антиоксидантными свойствами. К таким препаратам относятся соединения селена.
Селен регулирует окислительно - восстановительные процессы на клеточном уровне (обмен глюкозы, цикл Кребса, калиево - натриево — кальциевый обмен и др.) (Е.В. Крапивина, 2000; А.Г. Евреинов, 2001). В последнее время накапливается все больше информации об участии селена в иммунных реакциях в составе селенопротеинов, обмене тиреоидных гормонов, что позволяет использовать препараты этого микроэлемента в качестве иммуностимуляторов (Л.П. Никитина, 1995; В.Ф. Васильев с соавт., 2001).
Фирмой «Селекор» синтезировано органическое соединение- диметилдипирозолилселенид - селедант (торговое название).
Действие его во многом основано на антиоксидантных свойствах селена.
Другой компонент препарата пиразол также участвует в антирадикальной заприте (Л.В. Шабуневич, 2004).
1.2. Цель и задачи исследований. Целью настояш,их исследований являлось изучение возможности коррекции иммунного статуса у коров и телят селедантом при специфической профилактике колибактериоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита.
Для ее достижения были поставлены задачи:
1. Изучить влияние препарата селедант на метаболический статус и показатели естественной резистентности у стельных коров.
2. Изз^чить влияние селеданта на гуморальный иммунитет у стельных коров при специфической профилактике наиболее распространенных болезней (колибактериоз, парагрипп-3, инфекционный ринотрахеит).
3. Изучить формирование иммунного статуса у телят, полученных от коров, иммунизированных вакцинами в отдельности и в сочетании с селедантом.
4. Провести производственнз^з апробацию мероприятий по профилактике желудочно-кишечных и респираторных болезней телят с применением специфических средств в отдельности и в сочетании с селедантом.
5. Определить экономическую эффективность применения вакцин в отдельности и в сочетании с селедантом.
1.3. Научная новизна работы. Впервые изучена возможность использования для коррекции иммунного статуса у коров и телят селенорганического препарата селедант при специфической профилактике колибактериоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита.
Установлено нормализующее влияние селеданта на метаболический статус коров и полученных от них телят, обеспечивающее поддержание на более низком уровне процессов свободнорадикального окисления липидов и модулирующее действие на иммунный статус животных, проявляющееся повышением неспецифической резистентности организма и уровня специфического иммунитета.
Определена профилактическая и экономическая эффективность применения вакцин в отдельности и в сочетании с препаратом.
1.4. Практическая значимость исследований: Разработаны показания к применению селеданта с целью коррекции иммунного статуса у коров и полученных от них телят при специфической профилактике колибактериоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита.
Материалы диссертации вошли в одобренные секцией «Патология, фармакология и терапия» Россельхозакадемии «Методические рекомендации по оценке и коррекции неспецифической резистентности животных» (протокол № 2 от 8 июня 2005 года) и «Методические рекомендации по оценке и коррекции иммунного статуса животных» (протокол № 3 от 21 сентября 2005
года), нормативно-техническую документацию на препарат селедант (СТО 10590965-0005-2007) и инструкцию по его применению, утвержденную заместителем руководителя Россельхознадзора (Регистрационный № ПВР-2-
1.7/01895 от 3 апреля 2007г.).
1.5. Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 7 научных статьях, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
1.6. Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены и получили положительную оценку на 1-ой Международной научнопрактической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патологии, фармакологии и терапии» (Воронеж, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РСФСР, доктора ветеринарных наук, профессора, академика ВАСХНИЛ Я.Р. Коваленко (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» (Воронеж, 2008), а также на ежегодных отчетных сессиях ВНИВРШФиТ в 2003-2008г.г.
1.7. Основные положения, выносимые на защиту:
• Влияние селеданта на метаболический статус, показатели естественной резистентности, гуморальный иммунитет и клиническое состояние коров при вакцинации их против колибактериоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита;
• Влияние вакцинации коров в сочетании с селедантом на иммунный статус телят и заболеваемость их желудочно-кишечными болезнями;
• Коррекция иммунного статуса у телят селедантом при вакцинации против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.
1.8. Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами и 16 рисунками. Список использованной литературы содержит 370 источников, из них 267 отечественных и 103 иностранных.
Иммунитет и иммунная система
Иммунная система сформировалась в процессе эволюции позвоночных для защиты от инфекций, обеспечения индивидуальности и целостности организма, элиминации чужеродных агентов как экзогенной, так и эндогенной природы. Эти функции осуществляются специализированными клетками -лимфоцитами, макрофагами и их продуктами, многочисленными добавочными клетками, широко распространенными по организму с преимущественной локализацией в лимфоидных органах, включая костный мозг, тимус, лимфатические узлы, селезенку, пейеровы бляшки в стенке тонкого кишечника и др. (Л.И. Ефанова с соавт., 2004; И.А. Доми, 2006 и др.).
В последние годы накапливается все больше фактов, свидетельствующих о том, что иммунная система оказывает регуляторное влияние на другие системы организма. Растворимые продукты иммунной системы (иммуноцитокины) являются мощными регуляторными факторами, действующими на функцию органов кроветворения, на нервную, эндокринную системы и др. Вместе с тем, сама иммунная система находится под сложным влиянием нервных, эндокринных и медиаторных воздействий, что обеспечивает гармоничное функционирование всего организма (Ю.Н. Федоров с соавт., 1996). Таким образом, все изменения иммунного статуса должны рассматриваться в единой взаимосвязанной реакции нервной и эндокринной систем, метаболического статуса, а не как изолированный дисбаланс только одной иммунной системы (В.В. Абрамов с соавт., 1996; Dantzer, 1997; Z. Cui, 2005; G.B. Patel et al., 2005).
Иммунитет - защита организма от генетически чужеродных агентов экзогенного (возбудителей инфекций) и эндогенного (поврежденных, состарившихся и генетически измененных клеток и молекул собственного организма) происхождения, направленная на сохранение и поддержание генетического гомеостаза организма, его структурной, функциональной, биохимической целостности и антигенной индивидуальности (Н.Ю. Басова с соавт., 2005; J.L. Salak-Johnson et al., 2006 и др.).
Иммунитет является одной из важнейших характеристик для всех живых организмов, созданных в процессе эволюции. Принцип работы защитных механизмов состоит в распознавании, переработке и элиминации чужеродных структур. Защита осуществляется с помощью двух систем — генетически унаследованных неспецифических факторов естественной резистентности и специфического (приобретенного) иммунитета (A. Mena et al., 2003).
Эти две системы представляют собой две стадии единого процесса защиты организма. Неспецифический иммунитет выступает как первая линия защиты и как заключительная ее стадия, а система приобретенного иммунитета выполняет промежуточные функции специфического распознавания и запоминания чужеродного агента и подключения средств врожденного иммунитета на заключительном этапе процесса иммунной защиты (А.В. Караулов, 2002; JJ. Geene, 1986).
Система врожденного иммунитета действует на основе воспаления и фагоцитоза, а также защитных белков (комплемент, интерфероны, фибронектин, лизоцим, лактоферрин, пропердин и др.). Эта система реагирует только на корпускулярные агенты (микроорганизмы, чужеродные клетки и др.) и токсические вещества, разрушающие клетки и ткани, вернее, на корпускулярные продукты этого разрушения (У. Пол, 1987; I. Rosenkrands et al., 2005).
Вторая и наиболее сложная система — приобретенного иммунитета — основана на специфических функциях лимфоцитов, клеток крови, распознающих чужеродные макромолекулы и реагирующих на них либо непосредственно (цитотоксические Т- лимфоциты), либо выработкой защитных белковых молекул (антител).
Органы иммунной системы подразделяются на первичные (центральные) и вторичные (периферические). К первичным (центральным) органам относится вилочковая железа (тимус) и сумка Фабрициуса, обнаруженная только у птиц.
У млекопитающих роль сумки Фабрициуса выполняет костный мозг, поставляющий стволовые клетки - предшественники лимфоцитов. Оба центральных органа иммунной системы являются местами дифференцировки популяций лимфоцитов. Тимус является источником Т — лимфоцитов (тимусзависимые лимфоциты), в костном мозге образуются В - лимфоциты (Л. Йегер, 1986).
Т - система обеспечивает иммунокомпетентность лимфоидных клеток и регулирует функции В - системы. Т - лимфоциты участвуют в реакции клеточного иммунитета — гиперчувствительности замедленного типа, отторжения трансплантанта, аутоиммунных болезнях, иммунной защите при некоторых инфекционных и инвазионных болезнях. В - лимфоциты, превращаясь в плазматические клетки, синтезирующие антитела, обусловливают гуморальный иммунный ответ и защиту организма при различных инфекциях, особенно бактериальных (W. Drochner, 2004).
Линии Т- и В - лимфоцитов действуют совместно, составляя более трети всех лейкоцитов крови организма, мигрируют из крови в ткани, из тканей в лимфатические протоки и снова в кровь. Все чужеродное или изменившиеся лимфоциты немедленно распознаются и организуют иммунный ответ (K.S. Stacey et al., 2003).
Т - клетки возникают из костномозговых при их миграции в тимус, где они дифференцируются и превращаются в иммунологические компоненты антигенреактивной клетки, способные связываться с определенным антигеном. Т- клетки - хелперы - хранители иммунологической памяти об антигене, влияют на дифференцировку В- лимфоцитов, способствуя их превращению в плазматические антителообразующие клетки. Т - киллеры участвуют в разрушении чужеродных клеток в реакции клеточного иммунитета (трансплантантов, мутивированных клеток и т.д.). Т — супрессоры блокируют антителообразование В- лимфоцитами. Особая роль принадлежит популяции Т-лимфоцитов, способных продуцировать медиаторы клеточного иммунитета (В.П. Радченков с соавт., 2005; J.A. Roth et al., 2002).
Материалы и методы исследований
Работа выполнена в 2003-2008 г.г. в отделе микробиологии, вирусологии и иммунологии в соответствии с планом НИР ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН по заданию 04.02.01. «Изучить системные иммунодефициты в возникновении массовых желудочно-кишечных и респираторных болезней молодняка сельскохозяйственных животных и разработать средства и способы их коррекции для профилактики и терапии» (№ гос. регистрации 01.200.117019).
Научно-производственные опыты и апробация полученных результатов проведены на базе ОАО «Воронежпищепродукт» Новоусманского района, Воронежской области на 130 коровах и 130 телятах симментальской породы совместно с сотрудниками отдела клинической биохимии и отдела физико-химических методов исследований.
В качестве иммуномодулирующего средства использовано органическое соединение- диметилдипирозолилселенид - селедант (торговое название).
Бактерицидную активность сыворотки крови определяли по О.В. Смирновой и Т.А. Кузьминой (1966). Принцип метода основан на свойстве сыворотки крови оказывать бактерицидное и бактериостатическое действие на микроорганизм. Уровень бактерицидной активности определяли по степени задержки роста суточной культуры эшерихии в жидкой питательной среде под влиянием исследуемой сыворотки крови.
Лизоцимную активность сыворотки крови определяли по К.А. Каграмановой и З.В. Ермольевой (1966). Метод основан на способности лизоцима сыворотки крови вызывать лизис бактерий Micrococcus lisodeicticus.
Определение комплементарной активности сыворотки крови проводили по методу по Г.Ф. Вагнера (1963). Метод основан на способности комплемента в присутствии гемолитической сыворотки вызывать лизис эритроцитов барана.
Фагоцитарную активность лейкоцитов определяли по B.C. Гостеву (1950). Принцип метода основан на способности лейкоцитов захватывать и разрушать микробные клетки.
Фагоцитарную активность выражали процентным отношением активных, участвовавших в фагоцитозе, лейкоцитов к общему числу подсчитанных нейтрофильных лейкоцитов.
Фагоцитарный индекс определяли средним числом фагоцитированных микробов, приходящихся на один активный лейкоцит.
Фагоцитарное число вычисляли путем деления числа фагоцитированных бактерий на общее количество подсчитанных лейкоцитов
Для выделения лимфоцитов из крови применяли метод, основанный на принципе различной скорости седиментации их в градиенте плотности.
Т-лимфоциты идентифицировали методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК). Принцип метода основан на том, что Т-лимфоциты имеют рецепторы на поверхности мембраны, способные образовывать иммунную связь с поверхностными антигенами гетерологичных эритроцитов. При этом эритроциты располагаются по окружности лимфоцита и образуют розетку. Абсолютное количество Т-лимфоцитов рассчитывали по формуле: Т-лимфоциты=ахбхв/10000, где а — количество лейкоцитов в 1л крови, б — процент лимфоцитов в крови, в — процент розеткообразующих Т-лимфоцитов.
В-лимфоциты идентифицировали по выявлению рецепторов к третьему компоненту комплемента (ЕАС-РОК). Определение комплемент-рецептора является одним из тестов при идентификации В-лимфоцитов, для чего соединяют лимфоциты с эритроцитами барана, нагруженными комплексом антитело+комплемент.
Содержание иммуноглобулинов G, М и А- классов в сыворотке крови устанавливали методом простой радиальной иммунодиф фузии по G. Manchini (1965). Принцип метода основан на измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка.
В крови определяли число эритроцитов и лейкоцитов на счетчике (Культер-Каунтер), гемоглобин - гемоглобинцианидным методом, гематокрит — с помощью микроцентрифуги МЦГ - 8, глюкозу ортотолуидиновым методом Гультмана в модификации Хиваринена - Никкила (О.Д. Кушмарова, 1983). В сыворотке крови определяли содержание: общего белка рефрактометрическим методом; белковые фракции - электрофорезом в агаровом геле (О.Д. Кушмарова, 1983); общих липидов - по цветной реакции с сульфофосфованилиновым реактивом (Кнайт с соавт., 1972); содержание мочевины по цветной реакции Фирона в модификации В.Г. Колб (1976) с диацетилмонооксимом, общий кальций комплексометрическим способом по Уилкинсону (И.П. Кондрахин, 1985). В безбелковом фильтрате крови определяли неорганический фосфор с ванадат — молибденовым реактивом по Пул су в модификации В.П. Коромыслова и Л. А. Кудрявцевой (И.П. Кондрахин, 1985); содержание меди, цинка, марганца, железа, магния, натрия — на атомно-абсорбционном спектрофотометре фирмы Perkin Elmer, модель 703.
Обсуждение результатов исследований
Массовые желудочно-кишечные и респираторные болезни новорожденных животных и молодняка остаются одной из основных проблем современного животноводства. Эти заболевания, как правило, полиэтиологичны, возбудителями их чаще всего являются ассоциации вирусов и бактерий, которые проявляют патогенное действие на фоне иммунодефицитов, снижения общей резистентности организма. Специфическая профилактика многих инфекций молодняка сельскохозяйственных животных на указанном фоне является не достаточно эффективной. Кроме того, вакцинация вызывает не только индукцию специфического иммунитета, но и развитие разнообразных реакций организма, суть которых сводится к компенсации этого вмешательства и проявляются в виде стресса и, в частности, активацией процессов перекисного окисления липидов (А.П. Старчеус с соавт., 2002; 2004; Л.В. Коваленко, 2006 и др.). Поэтому требуется коррекция состояния иммуно-биохимического статуса маточного поголовья и полученного от него молодняка.
Изменения иммунного статуса в настоящее время рассматриваются не как изолированный дисбаланс только одной иммунной системы (В.В. Абрамов с соавт., 1996; A.M. Земсков с соавт., 1999 и др.), а в единой взаимосвязанной реакции нервной и эндокринной систем (A.M. Василенко с соавт., 2000; А.Д. Ноздрачев с соавт., 2000 и др.) и метаболического статуса. При таком подходе могут быть разработаны эффективные способы профилактики возникновения иммунодефицитного состояния, в частности, у новорожденных животных.
С учетом этого, нами были проведены комплексные исследования по изучению влияния нормализации метаболического и повышения иммунного статуса коров на формирование иммунного статуса телят, а также взаимосвязи характера изменения метаболического статуса новорожденных с интенсивностью накопления в сыворотке крови у них колостральных иммуноглобулинов, низкий уровень которых в первые дни жизни следует рассматривать, как иммунодефицитное состояние, и изыскание иммуномодулирующего средства для коррекции иммунного статуса.
Из иммуномодуляторов все чаще находят применение препараты, содержащие микроэлементы, как наиболее дешевые и эффективные средства, среди которых значительное место занимает селен (Н.Е. Горковенко с соавт., 2001; В.А. Медведский с соавт., 2002; Л.В. Валова, 2006; DJ. Biodgett et al., 1986; J. Bires, 1988).
Мы для нормализации метаболического статуса коров и телят, повышения общей резистентности и специфического иммунитета использовали селеноорганический препарат селедант, разработанный во ВНИВИПФиТ, НПО «Агрофарм» и фирме «Селекор».
Применение препарата коровам оказывает положительное влияние на параметры окислительно-восстановительных процессов в печени, что проявляется снижением активности АлАТ на 18,9%, щелочной фосфатазы на 16,4%, а также функционального состояния почек. У них же отмечено достоверное увеличение содержания общего белка и Р - глобулинов, количества лейкоцитов на 22,5%, по сравнению с аналогичными показателями у коров контрольной группы.
Повышение уровня меди, железа в крови стельных коров после введения селеданта, показывает, что препарат, имея в своем составе пиразолиновое кольцо, косвенно влияет на систему ферментов (церрулоплазмин, трансферрин, посттрансферрин, кокарбоксилазу и т.д.), контролирующих процесс образования данных микроэлементов и обмен веществ — окислительное фосфорилирование, гемопоэз, тканевое дыхание. Полученные нами данные согласуются с результатами исследований В.И. Шушлебина (1988), Д.В. Дегтярева (2004) и мнением Л. В. Шабуневича (2001).
Применение селеданта сухостойным коровам на фоне иммунизации положительно влияет на показатели неспецифической резистентности и иммунитета. У животных отмечено незначительное, но стабильное повышение лизоцимной, комплементарной и бактерицидной активности сыворотки крови как до, так и после отела.
Аналогичное влияние селедант оказал и на клеточное звено неспецифической защиты. Фагоцитарная активность нейтрофилов значительно повышалась у коров, которым вакцины вводили в сочетании с препаратом. У них достоверно увеличивалось и содержание Т-лимфоцитов, в то время как введение только вакцины этот показатель практически не изменялся во все сроки исследований.
Одновременное применение вакцины и селеданта сухостойным коровам оказало положительное влияние на содержание в крови В-лимфоцитов и иммуноглобулинов класса G. У них же титры антител к антигенам эшерихий и возбудителей парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота были выше, чем у животных, которым вакцины вводили без препарата.
Применение селеданта в сочетании с вакцинами оказало благоприятное влияние на состояние здоровья коров после родов, проявившееся снижением заболеваемости животных, задержанием последа, острой субинволюцией матки, послеродовым эндометритом, т.е. способствовало нормализации инволюционных процессов в половых органах и предупреждало развитие в них воспалительного процесса.
Все это повлекло за собой улучшение биологических свойств молозива под влиянием селеданта, в нем обнаружено более высокое содержание белка, казеина, иммунных глобулинов.
При изучении формирования иммунного статуса у новорожденных телят получены данные о накоплении колостральных иммуноглобулинов у животных, которые соответствуют существующим представлениям о динамике накопления их у новорожденного и роли молозивных иммуноглобулинов в обеспечении иммунной защиты в первые дни жизни.
