Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Распространение грибов - продуцентов микотоксинов в разных геоэкологических зонах 10
1.2. Микобиота в антропогенно загрязненных регионах 18
1.3. Микотоксины и иммунитет 23
1.4. Смешанные (сочетанные) микотоксикозы 29
1.5. Средства, повышающие устойчивость животных к микотоксинам 33
2. Собственные исследования 35
2.1. Материалы и методы исследования 35
2.2. Изучение микобиоты почвы в регионах РТ 41
2.3. Изучение микофлоры кормов в регионах РТ 50
2.4. Изучение клинических, гематологических и биохимических показателей при экспериментальном микотоксикозе 60
2.5. Содержание Т -, и В - лимфоцитов у овец при экспериментальном микотоксикозе 65
2.6. Фагоцитарная активность лейкоцитов, лизоцимная активность
сыворотки крови у овец при экспериментальном микотоксикозе 67
2.7. Изучение клинических, гематологических, биохимических показателей при экспериментальном сочетанном микотоксикозе 69
2.8. Содержание Т -, и В - лимфоцитов у овец при экспериментальном сочетанном микотоксикозе 76
2.9. Фагоцитарная активность лейкоцитов, лизоцимная активность сыворотки крови у овец при экспериментальном сочетанном микотоксикозе 78
2.10. Изучение гематологических показателей и факторов неспецифической резистентности у овец при экспериментальном микотоксикозе на фоне применения ксимедона 80
2.10.1.Изучение гематологических показателей у овец при экспериментальном микотоксикозе 81
2.10.2.Содержание Т -, и В - лимфоцитов у овец при экспериментальном микотоксикозе 84
2.10.3.Изучение фагоцитарной активности лейкоцитов, лизоцимной активности сыворотки крови у овец в динамике
экспериментального микотоксикоза 87
3. Обсуждение результатов 91
4. Выводы 99
5. Практические предложения 100
6. Список литературы
- Микобиота в антропогенно загрязненных регионах
- Смешанные (сочетанные) микотоксикозы
- Изучение клинических, гематологических и биохимических показателей при экспериментальном микотоксикозе
- Содержание Т -, и В - лимфоцитов у овец при экспериментальном сочетанном микотоксикозе
Микобиота в антропогенно загрязненных регионах
Контаминация посевов сельскохозяйственных культурь токси-нообразующими грибами и повышение их токсигенности привели за последние десятилетия к снижению урожайности сортов злаковых и бобовых культур на 40-50%, а также загрязнению их микотоксинами, опасными для животных и человека. Стоимость ежегодных потерь урожая злаковых и бобовых культур вследствие заражения токсинообразующими грибами и загрязнения зерна микотоксинами, а также в результате снижения продуктивности и падежа сельскохозяйственных животных, потребляющих загрязненное зерно и продукты его переработки, в США составляет более 2 мрд. долларов в год. В России этот ущерб оценивается в среднем в 400 млн. рублей, а в годы массового распространения в посевах зерновых культур токсигенных грибов он может составлять 1,0-1,2 мрд. руб. (76).
В настоящее время известно около 250 видов токсигенных грибов, которые образуют более 200 микотоксинов.
Основным источником распространения грибов, поражающих корма является почва. Частицы почвы, попадая на сено, солому и другие виды растительности во время их уборки, являются носителями спор многочисленных грибов и обрывков их мицелия, которые при наличии благоприятных условий прорастают и поражают эти корма. Поэтому на влажных кормах встречаются также многие виды грибов тех почв, на которых произрастали данные кормовые растения до их уборки (84,96).
Токсические вещества, образуемые грибами, поступают в растения из почвы, накапливаются в определенных ее частях и влияют на качество (87). Важная роль в распространении грибов в кормах принадлежит воздушным течениям. Заболевание зерновых культур фузариозом колоса в отдельные годы способно охватывать обширные территории и приобретать характер эпифитотий. Следствием таких эпифитотий являются значительные потери в урожайности, ухудшение семенных достоинств, товарных и пищевых качеств зерна, контаминация его микотоксинами (46).
На посевах злаковых культур и в агроценозах всех зерносеющих стран мира распространены следующие виды рода Fusarium: F. graminearum, F. culmorum, F. sporotrichioides, F. moniliforme, F. nivale, F. poae, F. avenaceum, F. tricinctum, F. equiseti, F. oxysporum. Растения злаковых культур могут одновременно колонизовать грибы нескольких видов рода Fusarium, при этом один из них является доминирующим. Каждый из этих видов при колонизации соцветий и зерна способен синтезировать одновременно ДОН и Ф-2 или Т-2 и Ф-2 токсин (74,75).
В различных географических зонах возделывания злаковых культур сложились определенные патологические комплексы видов рода Fusarium (63,93,163,183,216). Анализ распространенности различных видов этого рода грибов на посевах зерновых культур показывает, что все перечисленные виды являются возбудителями фузариоза колоса и поражают все основные злаковые культуры во всех зерносеющих странах мира. При этом наиболее распространены F. graminearum, F. poae, F. moniliforme, F. culmorum, F. sporotrichioides, F. avenaceum; доминирующим видом является F. graminearum (29,65,74).
В течение последних 10 лет на посевах злаковых быстро распространяются представители F. oxysporum, F. equiseti и F. tricinctum. Характерной особенностью этого периода можно считать так же нарастающую интенсивность поражения посевов кукурузы F. moniliforme и загрязнение зерна фумонизинами (77).
Все районированные сорта злаковых культур поражаются грибами рода Fusarium. Эпифитотий фузариоза колоса регулярно отмечаются во всех зерносеющих странах мира с начала XX века, причем эти грибы поражают посевы примерно в одни и те же годы (1914, 1932, 1946, 1958, 1963, 1970, 1985, 1988, 1993, 1995), что свидетельствует о пандемичном характере заболевания. В годы эпифитотии фузариоза колоса в основных зерносеющих регионах России (Северный Кавказ, Центрально - Черноземный район) поражение колоса штаммами - суперпродуцентами достигает 100% (в среднем за последние 8 лет - около 65%) (76).
В различных регионах России зерно пшеницы поражается 12-17 видами фузариев, среди которых наиболее распространены виды Fusarium graminearum, F. avenaceum, F. sambicinum, виды секции Sporotrichiella (40).
Массовые микотоксикозы, вызываемые токсигенными грибами F. sporotrichiella наблюдались в СССР еще в 30-50 годы, когда в пищу и в корм были использованы перезимовавшие под снегом зерновые (90).
Неблагоприятной зоной по фузариозу зерновых является Южный регион европейской части России. Особенно усилилось поражение фузариумом в середине 80 годов, когда развитие болезни приняло прогрессирующий характер (63).
При исследовании видового состава фузариев в очаге распространения заболевания на Северном Кавказе были выделены разнообразные по видовому составу популяции фузариев. Преобладали Fusarium graminearum (63% штаммов), F. gillosum (12%), встречались F. avenaceum, F. herbarum (8%), F. sporotrichiella, F. semitecticum и другие (99).
По данным ФАО ежегодно не менее 25% производимого в мире зерна продовольственного назначения подвергается загрязнению микотоксинами. Наиболее часто обнаруживаемыми являются токсины, продуцируемые грибами рода Fusarium. Имеются данные о высокой частоте (до 40-50%) случаев обнаружения Т-2 токсина в отдельные годы в зерне пшеницы, ячменя и овса в ряде Европейских стран - Польше, Финляндии (212).
Смешанные (сочетанные) микотоксикозы
По данным сотрудников ВНИВИ, проводивших исследования в различных регионах Республики Татарстан с целью определения экологически «благополучных районов», почва и сельскохозяйственная продукция в Балтасинском, Арском, Кукморском районах менее загрязнена экотоксикантами различной природы (П.К. Сметов и соавт., 1995), в то время как Альметьевский, Лениногорский, Бугульминский и некоторые другие районы находятся в зоне повышенного техногенного воздействия. Поэтому микологические исследования были проведены в двух зонах с различной техногенной нагрузкой.
Исследованию было подвергнуто 240 образцов проб почвы, отобранных в ряде хозяйств Кукморского и Альметьевского районов за период 2000 -2001 гг. Отбор образцов проб из анализируемых районов проводили при одинаковых природно-климатических условиях.
Исследованиями установлено, что почва в Альметьевском районе преимущественно была контаминирована грибами рода Aspergillus (A. flavus, A. fumigatus, A.niger)- 50% проб были загрязнены представителями этого рода (таблицаї). В меньшей степени выявлялись Fusarium (F. sporotrichiella, F. graminearum, F. moniliforme, F. avenaceum)- 40% и Penicillium- 45%. Наряду с вышеназванными грибами выявлялись также микромицеты родов Monilia, Mucor, Rhizopus, Trichoderma, Trichotecium, Cladosporium, Altemaria, однако встречаемость этих микромицетов была на порядок ниже.
Выделенные микромицеты в значительной степени обладали токсическими свойствами (таблица 2). Так, из данных таблицы видно, что из грибов, изолированных в 2000г. около 25,6% из рода Fusarium, 24,5- Aspergillus, 14,7%-Penicillium были токсичными при исследовании их на простейших -Paramecium caudatum, тогда как в пробах почвы в 2001 г выявляли 35, 25 и 10% токсических грибов Fusarium, Aspergillus и Penicillium соответственно. Преобладали токсические штаммы Fusarium sporotrichiella- 40, F. graminearum- 27, Aspergillus flavus- 27,6, A. fumigatus- 25, A. niger- 27, Mucor-10,Rhizopus- 10%.
Количество грибных зачатков на 1г сухой почвы составило 97500 КОЕ. Данные исследования микобиоты почвы, отобранной в ряде хозяйств Кукморского района представлены в таблице 3.
При исследовании 120 образцов почвы, отобранных из этого района, почти во всех пробах выделялись грибы родов Candida, Cephalosporium, Alternaria, Fusarium (F. sporotrichiella, F. moniliforme, F. graminearum), Cladosporium (C. Hnicola, C. elegantulum), Aspergilus (A, flavus, A. fumigatus, A. candidus, A. niger). Часто выявлялись Trichotecium (Т. roseum), Trichoderma (T. lignorum, T. viridae).
Исследованиями установлено, что около 30% образцов почвы загрязнялись грибами рода Fusarium, 40%- Aspergilus, 41,6%-Penicillium.
Среди выделенных микромицетов встречались токсические штаммы (таблица 4). В среднем, из грибов рода Fusarium-20, Aspergilus-15, Penicillium-10%, выявленных из почвы в 2000г обладали токсическими свойствами, в то время как в 2001г этот показатель составил 22,5, 17,8 и 10% соответственно.
Преобладали токсические штаммы F. sporotrichiella-30, F. graminearum-25, A.flavus-25, A.fumigatus-20, A.niger- 30, Mucor-5, Rhizopus-5% соответственно. Реже встречались штаммы Aspergilus versicolor-8%, выделялись грибы рода Trichoderma-70%. Количество грибных зачатков на 1г сухой почвы составило 56160 КОЕ.
Из данных таблиц видно, что загрязненность почвы в Альметьевском районе наиболее опасными грибами (Fusarium, Aspergilus и Penicillium) достоверновыше, чем в Кукморском. Наряду с этим также отмечено, что представленность сапрофитных форм микромицетов в почвах Альметьевского района менее разнообразна, т. е. почва в Кукморском районе более богата сапрофитами.
Микобиота почвы Альметьевского района (данные за 2000- 2001 гг) Наименованиехозяйства,(СХП) Кол-во проб Процент проб, загрязненных микромицетами, род грибов Fusar ium Asper gillus Penici Ilium Alter naria Helminthosporium Cladosporium Tricho Имелись и особенности в токсических свойствах выделенных в этих регионах почвенных микромицетов: изолированные в Альметьевском районе микроскопические грибы (Fusarium, Aspergilus и Penicillium) были более токсичными, в то время как в Кукморском районе этот показатель был существенно ниже.
Полученные результаты позволяют констатировать, что микобиота в антропогенно загрязненном регионе менее представлена сапрофитными формами и больше - токсичными микромицетами, чем в почвах регионов с умеренной техногенной нагрузкой.
Изучение микофлоры кормов в регионах РТ В течение 2000-2001гг. в Альметьевском и Кукморском районах РТ одновременно с микологическими исследованиями почвы проводили анализ кормов на степень их загрязнения микроскопическими грибами и микотоксинами, а так же изучали токсические свойства выделенных микромицетов. Результаты исследования представлены в таблицах 5, 7.
Из данных таблиц видно, что корма в хозяйствах загрязнялись микроскопическими грибами. Характер грибов и выделяемых ими микотоксинов, а так же их токсические свойства зависели от сезона исследования, климатических и погодных условий года. Микроскопическими исследованиями установлено, что в зерне и других кормах в исследуемых районах содержались микроскопические грибы до 20 наименований. Преимущественное контаминирование было грибами родов Fusarium, Aspergillus, Penicillium и др. По нашим данным, из кормов стабильно выделялись грибы рода Fusarium, которые считают наиболее опасными для населения и животных, так как среди них часто встречаются токсичные штаммы.
Изучение клинических, гематологических и биохимических показателей при экспериментальном микотоксикозе
Результаты данного опыта представлены в таблице 20. Как видно из таблицы, в первой группе овец (животные получали Т-2 токсин и ксимедон) содержание Т -, и В - лимфоцитов изменялось следующим образом: количество Т- клеток на 5 сутки увеличивалось на 4,1%. Далее этот показатель снижался и, на 15 и 30 сутки составил 5,7 и 6,7% ниже исходных данных, однако, он на 8,6% был выше по сравнению с контрольной группой, где животным задавали только Т-2 токсин. Содержание В - лимфоцитов через 5 суток увеличивалось на 2,6%, но через 15 суток произошло снижение данного показателя на 7,3, а через 30 суток - на 5,3% ниже фона, в то же время эти данные были выше контрольных значений на 6,3%.
Во второй группе овец, которым задавали афлатоксин В1 и ксимедон регистрировали снижение количества Т- лимфоцитов на 5, 15 и 30 сутки соответственно на 4,2, 6,0 и 3,8% ниже фона, что на 5,8% было выше, чем в группе биологического контроля. Содержание В - клеток уменьшалось через 5 суток на 2,7, через 15- на 6,8, через 30 суток незначительно увеличивалось и составило 3,5% ниже первоначальных данных, однако, на 4,9% выше контроля.
У животных третьей группы (получали охратоксин А и ксимедон) количество Т- лимфоцитов на 5 сутки опыта почти не изменялось (уменьшилось на 0,8%). На 15 и 30 сутки отмечали снижение этого показателя на 2,1 и 3,6% соответственно. Содержание В - лимфоцитов на 5 сутки увеличивалось на 3,8%, в дальнейшем имело тенденцию к снижению и, на 15 и 30 сутки составило 1,7 и 3,3% ниже фона. По сравнению с контролем, где овцам задавали охратоксин А без применения ксимедона, количество Т -, и В -лимфоцитов к концу эксперимента в третьей опытной группе на 3,7 и 3,8% соответственно было выше.
В четвертой группе овец, получавших афлатоксин В1, охратоксин А и ксимедон происходило снижение Т - лимфоцитов на 5 сутки на 6,3, на 15- на 9,7, на 30- на 11,7% соответственно. Содержание В - клеток в динамике наблюдения на 5 сутки возрастало на 13,5%, тогда как на 15 и 30 сутки опыта оно закономерно уменьшалось на 6,3 и 8,7% соответственно ниже исхода, однако, по сравнению с контрольными данными содержание Т-, и В-лимфоцитов в данной группе было на 5,6 и 5,8% выше.
В пятой группе животных, которым задавали Т-2 токсин, афлатоксин В 1, охратоксин А и ксимедон количество Т- клеток достоверно снижалось через 5 суток на 10,1, через 15- на 17,8, через 30- на 21,3% ниже фона и на 26,5% выше контрольных данных. Количество В - лимфоцитов на 5 сутки возросло на 4,5%, однако на 15 и 30 сутки было отмечено резкое снижение на 21,5 и 24,6% соответственно ниже фона, что, однако, было выше контроля на 33,4%.
Из данных таблицы следует, что в первой группе животных, получавших Т-2 токсин и ксимедон через 5 суток после начала опыта фагоцитарная активность (ФА) увеличилась на 2,8, через 15 и ЗОсуток - понижалась на 4,7 и 6,2% соответственно ниже фона, что на 10,0% было выше контрольных данных. В такой же последовательности изменялось и фагоцитарное число (ФЧ). Так, на 5 сутки оно увеличивалось на 3,3, а на 15 и 30 сутки - уменьшалось на 3,4 и 5% соответственно ниже первоначальных данных, однако этот показатель был на 6,6% выше таковой в контрольной группе. Лизоцимная активность сыворотки крови на 5, 15 и 30 сутки снижалась на 3,0, 6,7 и 5,8% ниже исходных величин, что по сравнению с показателями в группе биологического контроля было на 2,8% выше.
Во второй группе овец, которым задавали афлатоксин В1 и ксимедон изменения выражались в следующем: через 5 суток ФА и ФЧ понижались на 4,2 и 3,0, через 15- на 6,3 и 7,2, через 30- на 3,2 и 4,3% соответственно. Лизоцимная активность после незначительного увеличения на 5 сутки - на 1,5%, далее уменьшалась на 15- на 1,6, на 30- на 4,8% соответственно, однако, в динамике наблюдения отмечено, что ФА, ФЧ и лизоцимная активность в данной группе были на 6,5, 3,7 и 1,7% соответственно выше контрольных показателей.
У животных третьей группы регистрировали снижение ФА и ФЧ на 5 сутки на 1,6 и 3,5%. На 15 сутки опыта эти показатели увеличились и были на 1,5 и 3,4% выше фона. Однако, на 30 сутки отмечали снижение ФА и ФЧ на 3 и 4,2% соответственно ниже исхода, что на 5,4 и 1,8% было выше контроля. Лизоцимная активность через 5 суток не изменялась, через 15- увеличилась на 3, через 30- на 6,7% выше фона и на 11,7% выше данных биологического контроля.
В четвертой группе (животные получали афлатоксин В1, охратоксин А и ксимедон) наблюдались более заметные изменения. Так, на 5 сутки опыта ФА и ФЧ увеличились на 3,7 и 3,2% соответственно. В дальнейшем отмечали снижение, которое на 15 сутки составило 6,7 и 4,8, на 30- 12,5 и 8,4% ниже исходных данных, однако, по сравнению с данными в контрольной группе эти показатели были выше на 11,0 и 7,6% соответственно. Лизоцимная активность сыворотки крови в динамике наблюдения через 5 суток уменьшалось на 1,6, через 15- на 4,8, через 30- на 6,4% соответственно ниже первоначальных и на 8,1% выше контрольных данных.
В пятой опытной группе, где овцы получали Т-2 токсин, афлатоксин В1, охратоксин А и ксимедон показатели ФА и ФЧ в процессе воздействия на 5 сутки уменьшались на 6,4 и 5,6, на 15- на 12,7 и 13,2, на 30- на 20,0 и 17,3% ниже фона и на 15,0 и 17,1% выше, чем в группе биологического контроля. Активность лизоцима в ходе опыта достоверно снижалась на 5, 15 и 30 сутки -на 6,0, 10,5 и 13,5% соответственно ниже фоновых, что, однако, было на 6% выше контрольных значений.
Содержание Т -, и В - лимфоцитов у овец при экспериментальном сочетанном микотоксикозе
Доказана роль афлатоксинов в развитии раковых опухолей у людей и животных. Афлатоксикозы отличаются высокой летальностью и значительными изменениями в печени (111). Многократные наблюдения случаев афлатоксикозов у с/х животных с убедительностью показали, что афлатоксины являются одними из наиболее сильных гепатотропных ядов, обладающих также выраженными канцерогенными свойствами.
Установлено, что большинство видов млекопитающих и птиц, различные виды рыб, микроорганизмов, а также высших растений чувствительны к токсическому действию афлатоксинов.
Наряду с вышеупомянутым необходимо отметить проблему смешанных (сочетанных) микотоксикозов, как потенциально опасную форму отравления токсинами микроскопических грибов.
Несмотря на имеющиеся данные, аспекты влияния микотоксинов на иммунную систему до конца не изучены, не выяснено их влияние при сочетанном поступлении в организм.
На основании вышеизложенного перед нами была поставлена задача по изучению иммунологического статуса в динамике воздействия Т-2 токсина, афлатоксина В1 и охратоксина А как при раздельном, так и при сочетанном поступлении в организм животных. Вместе с этим необходимо было изучить влияние ксимедона в качестве иммунокорректора на течение микотоксикоза.
Как показали исследования, при подостром сочетанном поступлении микотоксинов происходят более выраженные изменения показателей иммунной системы, чем при их раздельном введении. Так, при сочетанном микотоксикозе (афлатоксин В 1+охратоксин А; Т-2 токсин+афлатоксин В 1+охратоксин А) регистрировали снижение количества эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина на 18,6, 24,7 и 15,2% и на 22,5, 29,0 и 21,3% соответственно ниже фоновых значений.
При раздельном же поступлении микотоксинов наблюдали менее значительные изменения. Так, при Т-2 токсикозе данные показатели снижались на 12,7, 18,8 и 10%, при афлатоксикозе В1- на 8,7, 14,0 и 7,3%, при охратоксикозе А - на 6,6, 11,7 и 4,1% соответственно.
Результаты исследования факторов неспецифической резистентности в динамике подострого сочетанного и раздельного поступления микотоксинов показали, что изменения, вызываемые смешанными микотоксинами, были гораздо выраженными, чем при отдельном введении токсинов. В частности, в группах, где животным задавали Т- 2 токсин+ афлатоксин В1+ охратоксин А и афлатоксин В1+ охратоксин А количество Т -, и В - лимфоцитов снижалось соответственно на 47,8 и 58,0 и 17,4 и 14,5%, в то время как при введении Т-2 токсина данные показатели уменьшались на 14,3 и 11,6, при афлатоксикозе В1-на 9,6 и 8,4, охратоксикозе А - на 7,3 и 7,1% соответственно ниже первоначальных данных.
Таким же образом изменялись фагоцитарная активность нейтрофилов и лизоцимная активность сыворотки крови. При Т-2, афлатоксин В1 и охратоксин А микотоксикозе данные показатели понижались на 35 и 19%. Сочетанное введение афлатоксина В1 и охратоксина А вызвало снижение этих параметров на 23,5 и 14,5% соответственно. Тогда как при Т-2 токсикозе снижение составило 16,2 и 8,6, при афлатоксикозе В1 - 12,3 и 6,5, охратоксикозе А - на 8,4 и 5,0% соответственно ниже фоновых показателей.
Приведенные выше результаты позволяют предположить, что сочетанное введение микотоксинов в дозе 1/10 ЛД50 вызывают более значительные изменения, чем при их раздельном поступлении. Наряду с этим установлено, что одновременное введение Т-2 токсина, афлатоксина В1 и охратоксина А оказывает более сильное иммунодепрессивное действие, чем при смешанном введении афлатоксина В1 и охратоксина А. Из вышесказанного следует, что указанные микотоксины при совместном поступлении в организм оказывают синергическое действие.
В литературных источниках имеются сведения, в которых отмечается синергизм данных микотоксинов в сочетании с другими видами ядов микроскопических грибов. Наши результаты согласуются с работами авторов, которые отмечали усиление токсического действия микотоксинов при их одновременном поступлении в организм (26,161). Известно позитивное влияние ксимедона на обмен веществ, иммунную систему (58); имеется опыт использования его для повышения устойчивости организма при Т-2 токсикозе (71). Все это определило назначения экспериментов по оценке иммунокоррегирующего действия ксимедона в динамике раздельного и сочетанного микотоксикоза.
Как показали наши исследования, применение данного препарата оказывало заметное положительное влияние на течение микотоксикоза, при этом, наблюдаемое снижение гематологических и иммунологических показателей были менее значительными, чем в контрольных группах, которым задавали только микотоксины.
Исследования показали, что иммунокоррегирующее действие ксимедона наиболее выражено при несочетанных микотоксикозах. При одновременном введении нескольких видов токсинов с ксимедоном оказывало более значительные поражения, и процент восстановления иммунологических показателей шел медленнее и дольше, однако, по сравнению с контрольной группой течение отравления происходило в более легкой степени и, гематологические и иммунологические показатели были на порядок выше. Так же необходимо отметить, что в контрольной группе животных, которым задавали одновременно микотоксины Т-2, афлатоксин В1 и охратоксин А две овцы пали, в то время как в группе, где наряду с микотоксинами вводили ксимедон случаев падежа животных не отмечено.
