Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Описторхоз рыб и его распространение на территории Российской Федерации 8
Глава 2. Биология возбудителя 19
Глава 3. Возбудитель описторхоза рыб и его устойчивость к ряду физических и химических факторов 25
Собственные исследования 37
Глава 4. Материалы и методы 37
4.1. Методы паразитологических исследований 38
4.2. Органолептические методы исследования 40
4.3. Физико-химические методы исследования 41
4.4. Методы определения химического состава мяса рыб 44
4.5. Санитарно-микробиологические методы исследования 49
4.6. Методы изучения относительной биологической ценности „ и токсико-биологической оценки мяса рыбы 55
4.7. Методы обезвреживания рыбы, пораженной описторхозом 58
Результаты исследований 59
Глава 5. Изучение распространенности описторхоза рыб 59
Глава 6. Клинический осмотр и патологоморфологические исследования больной рыбы 66
Глава 7. Исследования по сравнительной оценке методов индикации, определения жизнеспособности и дифференциальной диагностики метацеркарий O.felineus 69
7.1. Выявление метацеркарий O.felineus в рыбе 69
7.2. Дифференциальная диагностика O.felineus по анатомо-морфологическим признакам 72
7.3. Сравнительная оценка методов определения жизнеспособности метацеркарий O.felineus 74
Глава 8. Органолептические и физико-химические исследования рыб при описторхозе 76
8.1. Органолептические показатели мяса рыб 78
8.2. Физико-химические показатели мяса рыб 78
Глава 9. Санитарно-микробиологический контроль рыб, пораженных описторхозом 79
Глава 10. Изучение химического состава мяса рыб, пораженных метацеркариями O.felineus 81
Глава 11. Биологическая оценка мяса рыб при описторхозе 83
Глава 12. Обезвреживание рыб, пораженных описторхозом 84
Обсуждение результатов 88
Выводы 96
Практические предложения 98
Список литературы 99
- Органолептические методы исследования
- Методы определения химического состава мяса рыб
- Дифференциальная диагностика O.felineus по анатомо-морфологическим признакам
- Физико-химические показатели мяса рыб
Введение к работе
Актуальность темы. Рыба, являясь ценным пищевым продуктом, может стать причиной заболевания человека серьезными гельминтозами. На территории России регистрируется целый ряд паразитарных болезней, возбудители которых передаются человеку через рыбу, ракообразных, моллюсков и продукты их переработки. Наиболее тяжелым гельминтозом из числа трематодозов, распространенных на территории России, является описторхоз.
Описторхоз — пероральный биогельминтоз, вызываемый трематодой из семейства Opisthorchidae, Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884). Заражение человека, кошек, собак, лисиц, песцов, свиней и некоторых других плотоядных животных (окончательных хозяев данного паразита) происходит при употреблении в пищу инвазированной личинками описторхисов рыбы семейства карповых (язь, елец, чебак, вобла, лещ, красноперка и др.) При попадании в желудочно-кишечный тракт личинки, называемые метацеркариями, эксцистируются в двенадцатиперстной кишке и мигрируют через желчный пузырь во внутрипеченочные желчные протоки, где достигают половой зрелости и начинают откладывать яйца. У инвазированных лиц в 20-40% случаев описторхисы также обнаруживаются в протоках поджелудочной железы и желчном пузыре (Герасимов А.С., 1999; Грищенко-Л.И., 1999; Соторов П.П., 1999; Акбаев М.Ш.; Быков В. П., 2001; Судариков В.Е., 2002; Фаттахов Р.Г., 2004; Беэр С.А., 2005).
Ареал возбудителя описторхоза простирается практически непрерывно от Байкала до западных границ России с наивысшей интенсивностью циркуляции паразита в Обь-Иртышском бассейне, где сложилась наиболее неблагополучная эпидемиологическая и эпизоотическая ситуация. Волжско-Камский бассейн является
второй после Западной Сибири эндемичной по описторхозу территорией России (Никитин В.В., Куимова Р.Т., 1992, Довгалев А.С, 1999). Выявлены очаги описторхоза и степень заражения в них людей (Успенский А.В., Малахова Е.И., Шубадеров В.Я., 2007). По данным Всемирной Организации Здравоохранения за 1995' год заболело описторхозом, вызываемым O.felineus, более 2 млн. человек. По данным Роспотребнадзора, ежегодно на территории Российской Федерации регистрируется до 40 тыс. больных описторхозом людей. Выявлен описторхоз среди населения практически всех субъектов Российской Федерации, а заболеваемость описторхозом на 2005 год составила 30,5 человек на 100 тыс. населения, а на долю описторхоза от всех биогельминтозов в год приходится 77,2% (Онищенко Г.Г., 2002).
При ветеринарно-санитарной экспертизе рыбы описторхоз регистрировался в 2005 году 6,7%, в 2006г. — в 5,4% случаев.
Основными задачами ветеринарной службы в рыбоводческих хозяйствах является охрана гидробионтов от инфекций, контроль за состоянием объектов аквакультуры, своевременное проведение лечебно-профилактических обработок, обеспечение населения безопасной и качественной рыбопродукцией (Борисова М.Н., 2004).
В связи с этим в- целях повышения эффективности ветеринарного контроля за рыбой и качеством пищевой продукции; получаемой из рыб, как возможных источников инвазионных заболеваний, необходимо, прежде всего, улучшить проведение ветеринарно-санитарной экспертизы и оценки рыб и рыбопродуктов, в частности, при описторхозе.
Этим обосновывается выбор и актуальность
исследовательской работы.
Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования является разработка вопросов ветеринарно-санитарной экспертизы рыбы при описторхозе с решением следующих задач.
Изучить распространенность описторхоза среди рыб в различных регионах Российской Федерации.
Провести сравнительную оценку паразитологических методов исследования рыб при описторхозе.
Провести исследования по изучению органолептических и физико-химических показателей мяса рыб, пораженных описторхозом, с учетом интенсивности инвазии.
Изучить общий химический состав и биологическую ценность мяса рыб, пораженных описторхозом.
Провести микробиологические исследования мяса рыб при данном заболевании.
Изучить устойчивость метацеркарий описторхисов к воздействию ряда физических и химических факторов.
7. На основании проведенных исследований подготовить
«Методические рекомендации по проведению ветеринарно-
санитарной экспертизы рыбы при описторхозе».
Научная новизна. Изучена зараженность описторхозом различных видов пресноводных рыб бассейнов рек Обь (среднее течение в районе г. Ханты-Мансийска), Волга и Большой Могой (в районе г. Астрахани) и Тавда (приток Тобола в районе г. Тавда) с определением экстенсивности (ЭИ) и интенсивности инвазии (ИИ).
Установлено, что описторхоз рыб может протекать как моноинвазия, так и в смешанной форме с другими метацеркариями трематод, а именно: Paracaenogonimus ovatus (сем. Prohemistomidae), Bolbophorus confusus (сем. Posthodiplostomidae) и Hysteromorpha tribola (сем. Diplostomidae).
С учетом интенсивности инвазии определены органолептические, физико-химические и микробиологические показатели рыб, пораженных описторхозом.
При описторхозе с высокой интенсивностью инвазии из мяса рыб выделяется сопутствующая микрофлора (E.coli).
Впервые выявлена зависимость, что повышение интенсивности инвазии, сопровождающееся повышением влаги в мясе рыб, сопровождается уменьшением содержания белка, жира, золы, кальция и фосфора, что снижает его (мяса) калорийность в сравнении со здоровой рыбой.
Гистологическими исследованиями установлено, что заболевание рыб описторхозом сопровождается образованием в местах локализации метацеркарии капсул из соединительной ткани и поражением мышечной ткани в виде дегенеративных изменений.
Проведенными исследованиями разработаны (в дополнение к существующим) режимы обезвреживания мяса рыб, пораженных описторхозом, в частности: замораживание при —18 С и экспозиции 7 суток и -20 С - 48ч; воздействие высокими температурами (+60 С и экспозиции 35 мин, варка - 10 мин и прожарка — 15 мин); посол рыбы при применении хлорида натрия в концентрации 50 г/л в течение 30 суток, 100 г/л - 21 сутки и 150 г/л - 10 суток; применение СВЧ при мощности 900 Вт и экспозиции 3,5 мин и 600^ Вт и экспозиции 4,5 мин.
Установлено, что применение процессов вяления и воздействие ультразвуком не приводят к обезвреживанию от описторхисов.
Практическая ценность работы. На основании проведенных исследований подготовлены предложения по улучшению проведения ветеринарно-санитарной экспертизы и оценке рыб при
описторхозе и определению устойчивости описторхисов к физическим и химическим факторам, которые включены в разработанные нами «Методические рекомендации по проведению ветеринарно-санитарной экспертизы рыбы при описторхозе». (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 04.09.2007 г.).
Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 5 научных статей.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и приложений. Работа содержит 21 таблицу, 11 рисунков, в том числе 2 диаграммы. Список литературы включает 126 источников отечественных и зарубежных авторов.
Органолептические методы исследования
Физико-химические исследования проводили согласно ГОСТ 7636-85 «Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа» (качественные реакции определения аммиака и сероводорода). Исследования с целью определения показателей свежести больной и здоровой рыб (реакции на пероксидазу и с сернокислой медью, определение концентрации водородных ионов) проводили согласно «Правилам ветеринарно-санитарной экспертизы пресноводной рыбы и раков» (1989).
Определение аммиака. Метод основан на взаимодействии аммиака, образующегося при порче рыбы, с соляной кислотой и появлении при этом облачка хлористого аммония.
Проведение анализа. В широкую пробирку наливали 2-3 см3 смеси Эбера, закрывали пробкой и встряхивали 2-3 раза. Вынимали пробку из пробирки и сразу же закрывали ее другой пробкой, через которую продета тонкая стеклянная палочка с загнутым концом. На конец палочки прикрепляли кусочек исследуемого мяса рыбы с температурой близкой к температуре воздуха в лаборатории в момент проведения анализа. Мясо вводили в пробирку так, чтобы не запачкать стенок пробирки и чтобы оно находилось на расстоянии 1-2 см от уровня жидкости.
Обработка результатов. Через несколько секунд в результате реакции аммиака с соляной кислотой должно образовываться облачко хлористого аммония. Интенсивность реакции оценивали следующим образом: - реакция отрицательная; + реакция слабоположительная (быстро исчезающее расплывчатое облачко); ++ реакция положительная (устойчивое облачко, проявляющееся через несколько секунд после внесения мяса в пробирку с реактивом); -Н-+ реакция резко положительная (облачко появляется сразу после внесения мяса в пробирку с реактивом).
Определение сероводорода. Метод основан на взаимодействии сероводорода, образующегося при порче рыбы, со свинцовой солью с появлением темного окрашивания вследствие образования сернистого свинца.
Проведение анализа. 15-25 г исследуемого фарша из спинной мускулатуры рыб помещали рыхлым слоем в бюксу вместимостью 40-50 см3. В бюксу подвешивали горизонтально над фаршем полоску плотной фильтровальной бумаги, на поверхность которой, обращенной к фаршу, нанесены 3-4 капли раствора свинцовой соли диаметром 2-3 мм. Расстояние между бумагой и поверхностью фарша 1 см. Бюксу закрывали сверху крышкой, зажимая фильтровальную бумагу между крышкой и корпусом бюксы, и оставляли стоять при комнатной температуре. Параллельно проводили контрольный анализ без навески продукта. По истечении 15 мин бумагу снимали и сравнивали ее окраску с окраской бумаги, смоченной тем же раствором свинцовой соли (контрольный анализ). При наличии в исследуемом образце свободного сероводорода происходит побурение или почернение участков бумаги, смоченных раствором свинцовой соли.
Интенсивность реакции обозначали следующим образом: - реакция отрицательная; ± следы окрашивания капли; + реакция слабоположительная; ++ реакция положительная (бурое окрашивание всей капли, более интенсивное по краям); +++ реакция резко положительная (интенсивное темно-бурое окрашивание всей капли).
Определение рН. К 5 г фарша мяса рыбы добавляли 50 мл дистиллированной воды и настаивали в течение 30 мин при периодическом перемешивании, затем пропускали через бумажный фильтр. Фильтрат использовали для исследования. Определяли рН рН-метром (Hanna рН 211). Учитывали, что у рыбы свежей фильтрат слегка опалесцирует (рН до 6,9); у рыбы сомнительной свежести фильтрат слегка мутноватый (рН 7,0-7,2); у рыбы несвежей фильтрат мутный, запах неприятный (рН 7,3 и выше).
Реакция на пероксидазу. В бактериологическую пробирку вносили 2 мл водной вытяжки (1:100) из жаберной ткани и добавляли 5 капель 0,2%-ного спиртового раствора бензидина. Содержимое пробирки встряхивали, после чего вносили две капли 1%-ного раствора перекиси водорода.
Методы определения химического состава мяса рыб
Для определения химического состава мяса рыб использовали пробы свежей снулой рыбы (из спинной мускулатуры язей двухлеток), выловленных из реки Обь в районе города Ханты-Мансийск, исследования проводили согласно ГОСТ 7636-85 «Рыба, морские-млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа».
Определение массовой доли воды высушиванием при 100-105 С. Метод основан на испарении воды из продукта при тепловой обработке и определении изменении массы его взвешиванием.
Навеску спинной мускулатуры от 1,5 до 2 г, взвешенную с абсолютной погрешностью не более 0,001 г, помещали в чистую высушенную и тарированную бюксу со стеклянной палочкой, при помощи которой распределяли навеску продукта в бюксе ровным тонким слоем. Бюксу закрывали притертой крышкой, взвешивали на аналитических весах и высушивали в сушильном шкафу при 100-105 С до постоянной массы. Первое взвешивание проводили через Зч после начала сушки, последующие — через 30-40 мин. Постоянная масса считалась достигнутой, если разница между двумя взвешиваниями не превышала 0,001 г. В бюксу предварительно вносили 5-10 г песка и навеску продукта тщательно перемешивали.
Массовую долю Х3 в процентах вычисляли по формуле Х3 = (mrm2) 100/mi-m, где m — масса бюксы с песком г, т\ — масса бюксы с навеской и песком до высушивания, г; т2 - масса бюксы с навеской и песком после высушивания, г.
За окончательный результат принимали среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не превышало 0,5%.
Определение массовой доли белка по Къельдалю. Метод основан на окислении органического вещества при сжигании его в серной кислоте в присутствии катализатора, отгонке образующегося аммиака паром, улавливании его раствором серной кислоты и определении содержания азота методом титрования.
Навеску мышечной ткани массой 0,6-1 г взвешивали с абсолютной погрешностью не более 0,0005 г, помещали в колбу для сжигания вместимостью 100 см, добавляли несколько мелких кристаллов медного купороса и приливали 10-20 см3 серной кислоты плотностью 1840 кг/м . Колбу осторожно нагревали в вытяжном шкафу, не допуская разбрызгивания жидкости. Когда содержимое колбы становилось однородным, прекращали нагревание, давали остыть, добавляли 0,5 г сернокислого калия и продолжали нагревание до тех пор, пока жидкость в колбе не становилась прозрачной, зеленовато-голубой окраски без бурого оттенка. По окончании сжигания содержимое колбы охлаждали и количественно переносили в отгонную колбу вместимостью 500-750 см . Приемником служила коническая колба вместимостью 250-300 см , с 25-30 см серной кислоты 0,05 моль/дм . Конец трубки холодильника погружали в раствор серной кислоты. В отгонную колбу осторожно, по стенкам, избегая смешивания жидкостей, приливали 50-70 см раствора гидроокиси натрия 330 г/дм , бросали кусочек лакмусовой бумаги и быстро закрывали ее пробкой, соединенной посредством каплеуловителя с холодильником, осторожно перемешивали содержимое и нагревали. Реакция жидкости в колбе должна быть резко щелочной. После закипания жидкости в колбе приемник опускали так, чтобы конец трубки холодильника находился на некотором расстоянии от поверхности раствора и продолжали отгонку до тех пор, пока не отгонится не менее 2/3 жидкости. Конец отгонки определяли по лакмусовой бумаги. Если отгонка закончена, капля дистиллята не должна вызывать посинения красной лакмусовой бумаги. По окончании отгонки конец трубки холодильника обмывали водой в приемную колбу и содержащийся в ней избыток серной кислоты оттитровывали раствором гидроокиси натрия 0,1 моль/дм в присутствии метилового красного. Одновременно проводили контрольный анализ без навески исследуемого образца.
Дифференциальная диагностика O.felineus по анатомо-морфологическим признакам
Стоить отметить также, что большинство из исследованных нами рыб были инвазированы другими метацеркариями трематод, а именно: Paracaenogonimus ovatus (сем. Prohemistomidae), Bolbophoras confiisus (сем. Posthodiplostomidae) и Hysteromorpha tribola (сем. Diplostomidae), как моноинвазия, так и в смешанной форме. Так, для P.ovatus ЭИ у красноперки составила 60-100%, ИИ 1-ЗОэкз.; у густеры - ЭИ 80%, ИИ 1-11экз.; у леща - ЭИ 50%, ИИ 1-5экз; у воблы - ЭИ 20%, ИИ 2экз. Для B.confusus у красноперки ЭИ составила 38,46-40%, ИИ 1-11экз.; у леща - ЭИ 8,33%, ИИ 1 экз.; у воблы - ЭИ 20%, ИИ 1 экз.; для H.tribola для густеры ЭИ составила 60%, ИИ 1-3 экз.
Видовую принадлежность метацеркарий определяли по Сударикову В.Е. (2002). Приведенные автором описание метацеркарий свели в единую таблицу 12, так как мы считаем, что их нужно дифференцировать исходя из анатомо-морфологических признаков, имея в виду, что до наших исследований не указывалось на наличие этих трематод. Принцип дифференциации указанных видов трематод основан на строении метацеркарий, размеру и форме цист, размеру и форме метацеркарий, освобожденных из цисты.
При обнаружении личинок в рыбе, в том числе при оценке эффективности ее обеззараживания, необходимо определять их жизнеспособность. Нами проведена сравнительная оценка ряда методов определения жизнеспособности личинок описторхисов.
По морфологическим признакам. Метацеркарий трематод, выделенных из тканей рыбы с помощью препаровальной иглы, помещали в каплю теплой воды или физраствора (37-40?С) на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и исследовали под малым и большим увеличением микроскопа. Явное нарушение целости оболочек цист, грубые изменения внутреннего строения личинки, распад ее содержимого, разрушение экскреторного пузыря являются признаками гибели метацеркарий. Отсутствие указанных показателей свидетельствует о наличии живых личинок.
Метод механического воздействия. Как известно, метацеркарий обладают способностью совершать движения,, находясь в цисте. Наличие даже самых слабых самостоятельных движений личинки свидетельствует о ее жизнеспособности. В этой связи движение личинок стимулировали слабым придавливанием. метацеркарий покровным стеклом.
Метод химического воздействия. Вызвать движение личинок можно желчью животных или трипсином. На выделенных метацеркарий наносили несколько капель химического реагента так, чтобы полностью покрыть личинок. Для ускорения эксцистирования предметное (часовое) стекло с личинками слегка подогревали над пламенем спиртовки. Через несколько секунд под воздействием химического раздражителя начинался выход личинок из цист и их активное движение, что служило показателем жизнеспособности. Процесс эксцистирования личинок контролировали под микроскопом типа МБС.
При отсутствии в течение 30 мин всякой двигательной реакции следует учитывать как гибель личинок.
Метод окрашивания. Для определения жизнеспособности метацеркарий использовали окрашивание раствором; розоловош кислоты (аурина).
Кусочки мышц с личинками освобождали от жира. На ткань наносили капли розоловош кислоты, а через 2 мин - 0,1; н раствор? гидроксида калия, равномерно распределяя: его по; ткани. Избыток жидкости с препарата снимали фильтровальной бумагой. Накрывали покровньшистеклом и микроскопировали. В этих опытах ткань рыбы окрашивалась в розовый цвет, живые личинки совершенно не окрашивались; мертвые личинки становились розовыми.
Метод биологической пробы. Метод основан на способности большинства видов гельминтов, паразитирующих у человека, приживаться и у других млекопитающих. Кусочки мышц рыбы с личинками скармливают лабораторным животным (котятам). Через определенное для каждого вида гельминта время, в фекалиях животного обнаруживают яйца паразита. Затем животное усыпляют (умерщвляют); и вскрывают методом неполного гельминтологического вскрытия. Обнаруженных; гельминтов определяют до вида.
Выделение яиц O.felineus начинается через 20-25 суток после: заражения. При вскрытии животных через 3-5 недель после заражения половозрелых трематод обнаруживают в желчных протоках печени, желчном пузыре. Метод дает 100% эффект заражения, что подтверждает жизнеспособность.
Физико-химические показатели мяса рыб
Выделение условно-патогенных микроорганизмов из опытных проб рыб, пораженных описторхозом с ИИ более 51 экз., по-видимому, можно объяснить их проникновением вместе с личинками во время их внедрения через кожный покров рыб, их миграции и в связи с этим ослаблением общей резистентности организма рыб.
Для определения химического состава мяса рыб использовали пробы свежей снулой рыбы (из спинной мускулатуры язей двухлеток), выловленных из реки Обь в районе города Ханты-Мансийск. Были определены массовые доли воды, белка, жира, содержание золы, фосфора и кальция. На основании этих показателей расчетным путем определена энергетическая ценность мяса рыб, пораженных описторхозом с учетом степени инвазии. В качестве контроля исследовано мясо здоровой рыбы (язя). Результаты этих исследований представлены в таблице 17.
Как установлено исследованиями, мясо рыб, пораженных описторхозом, характеризуется более повышенным содержанием влаги в сравнении со здоровой рыбой: при низкой ИИ на 1,26%, при средней ИИ — на 1,36% и при высокой - на 3,06%. В этой связи отмечается зависимость, что чем выше ИИ я содержание влаги, тем меньше уровень содержания белка, жира, золы, кальция и фосфора соответственно: - при низкой ИИ: белка- на 1,25%, жира - на 0,1%, золы - на 0,059%, фосфора - на 0;36%, кальция - на 0;34%; - при средней ИИ: белка - на 0,67%, жира — на 0;5%, золы - на 0,082%, фосфора - на 0,66%, кальция — на 0j5%; - пршвысокой ИИ: белка — на 2,42%, жира— на 0j55%, золы— наО; 177%, фосфора,- на 0;86%, кальция - на 0;90%
Расчетным путемі, исходя из таблицы Покровского К.С (1971) по определению пищевой; ценности продуктов, было определено; что энергетическая ценность на 100 г мяса (ккал) рыб, пораженных описторхозом в сравнении со здоровой рыбой составляет: при низкой ИИ- 95,9; при средней ИИ — 94,62 и при высокой ИИ- 87,17 ккал, что указывает на снижение их калорийности соответственно на 5,8% 7,1% и 19,9% в сравнении с контролем.
Данные обработаны методом определения достоверности различий между двумя? средними величинами; с использованием t критерия. Различие статистически? значимо с вероятностью 95%: Расчеты по снижению; веществ в мышечной ткани? проведены! по определению абсолютного снижения, т.к. считаем этот подход показывает более объективно изменения по химическому составу.
Таким образом, исходя из полученных данных, рыба, инвазированная O.felineus, особенно при: высокой ИИ; характеризуется более низкой энергетической ценностью в сравнении со здоровой рыбой.
Определение относительной биологической ценности (ОБЩ. Материалом для определения ОБЦ служила рыба (красноперка и язь), пораженная описторхозом, от которой отбирали пробы мышечной ткани в области спинной мускулатуры. Так, при низкой и средней ИИ относительная биологическая ценность ниже на 1-1,7%, что недостоверно. Что касается мяса рыб с высокой ИИ, то снижение относительной биологической ценности составляет 2,7%, что является достоверным показателем и указывает на пониженную его биологическую ценность.
Токсико-биологическая оценка. Токсико-биологическая оценка рыбы, пораженной описторхозом, была проведена с применением культур Tetrahymena pyriformis и Colpoda steinii, а также при постановке биопробы на белых мышах. Результаты исследований представлены в таблице 19.
