Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Аэромоноз карповых рыб и его распространение 10
Глава 2 Характеристика возбудителя и ею устойчивость 16
Глава 3 Ветеринарно-санитарное и социальное значерше аэромоноза рыб собственные исследования 27
Глава 4 Материалы и методы 27
4.1. Микробиологические методы исследования 27
4.2. Органолептическне методы исследования 33
4.3. Физико-химические методы исследования 34
4.4. Методы по обезвреживанию рыбы, пораженной .,, аэромонозом
4.5. Электронно-микроскопические методы исследования 37
4.6. Методы определения устойчивости аэромонад к воздействию физических и химических факторов Резулыаш исследований 50
Глава 5 Изучение распространенности аэромоноза карповых рыб 50
Глава 6 Клиническая картина и течение болезни 55
Глава 7 Патологоанагомические изменения у рыб, пораженных аэромонозом
Глава 8 Микробиологические исследования 58
8.1. Сравнительная оценка рос га аэромонад на различных пи гательных средах 58
8.2. Исследования но выделению аэромонад 60
8.3. Изучение биохимических свойств выделенных культур возбудителя аэромоноза и их дифференциация от бактерий сходных родов
8.4. Исследования по выделению из рыб, пораженных аэромонозом, сопутствующей микрофлоры
8.5. Изучение серологических свойств а фомонад в РА с сальмонеллезными сыворогками
Глава 9 Органолептическне и флзико-химические исследования рыб при аэромонозе
9.1. Органолептические показатели мяса рыб 68
9.2. Физико-химические показатели мяса рыб 69
Глава 10 Электронно-микроскопические исследования возбудителя аэромоноза карповых рыб 71
Глава 11 Обезвреживание рыб, пораженных аэромонозом 76
Глава 12 Изучение устойчивости возбудителя аэромоноза карповых рыб к некоторым физическим и химическим факторам 78
12.1. Устойчивость в водной среде при плюсовых температурах . 78
12.2. Определение устойчивости к воздействию антибиотиков 79
12.3. Определение устойчивое! и к воздействию озона 85
12.4. Определение устойчивости к воздействию ультразвука (УЗИ) 87
12.5. Определение устойчивости к воздействию УФ-излучения . 89
12.6. Изучение устойчивости возбуди іеля аэромоноза к химическим средствам 89
Обсуждение результатов 98
Выводы 112
Практические предложения 115
Список литературы
- Микробиологические методы исследования
- Сравнительная оценка рос га аэромонад на различных пи гательных средах
- Органолептические показатели мяса рыб
- Устойчивость в водной среде при плюсовых температурах
Введение к работе
Актуальность темы
Как известно, Россия является одним их ведущих рыбопромышленных государств в мире по уловам рыбы и нерыбных объектов. Рыбное хозяйство -одно из тех отраслей экономики страны, которое находится в постоянном контакте с мировым рынком и различными международными организациями. Сырьевая база рыбной промышленности России состоит из биологических ресурсов мирового океана и входящих в его состав морей. В водоемах России добывается: в морях -143 тыс.т., то есть 45% общих уловов, в пресноводных водоемах (реки, озера, водохранилищах) - 125 тыс.т., что составляет 40%, в хозяйствах пресноводной аквакультуры (товарное рыбоводство) добывается 48 тыс.т. - то есть 15 % продукции. В водах, прилегающих к России, океанов и морей, в многочисленных внутренних водоемах (озер, рек, прудов, водохранилищ) обитает более 1000 видов рыб, из которых примерно 250 промысловых (Дворянков В.А., 2000; Богерук А.К., 2006).
Продукция, вырабатываемая из рыбы и морских животных (морские млекопитающие, моллюски, ракообразные), является источником ценных белков, жиров, макро- и микроэлементов, водо- и жирорастворимых витаминов, потребление которых необходимо для нормального развития и функционирования организма человека, укрепления его здоровья, повышения работоспособности, профилактики старения и серьезных заболеваний. Потенциальные ресурсы гидробионтов значительны. Современное состояние биоресурсов океанов, морей и внутренних водоемов позволяет добывать 150-160 млн. тонн сырья (Мамонтов Ю.П., Павлович Г.М., 2005; Асланов Г.А., Чугунов А.А., 2002).
Отрасль играет заметную роль в продовольственном комплексе страны: удельный вес ее в общих объемах товарной продукции составляет около
5 11%, в основных фондах - 14%, в численности промышленно-производственного персонала- 15% (Никоноров С.Н., 2006).
Важный вклад рыбное хозяйство вносит также в обеспечение национальной продовольственной безопасности. Масса среднедушевого потребления рыбных продуктов значительна: в общем балансе потребления животных белков, включая мясные, молочные продукты и яйца, рыбные белки сегодня составляют около 10%, а в мясо - рыбном балансе - не менее 25%.
Россия в начале XXI в. обладает потенциальными водными биоресурсами, обеспечивающими потребность страны в гидробионтах. Среднегодовой объем допустимого улова рыбы и нерыбных объектов оценивается на уровне 8,6 млн.т., в т.ч. в отечественной экономической зоне и во внутренних водоемах - около 4,9 млн.т. (примерно 57%), в экономических зонах иностранных государств - 2 млн. т. (около 23%) и в открытых районах мирового океана - 1,65 млн.т. (почти 20%) (Коровников А.В., 2006; Прохоров СВ., 2006).
Из пресных внутренних водоемов наибольшие уловы получают в северо-западных озерах Урала и Сибири, а также в водохранилищах Волго-Донского бассейна, которые поставляют такие виды рыб, как сазан, судак, лещ, щука, сом, плотва, язь, окунь, и основную часть сиговых рыб.
Водный биопотенциал пресноводных водоемов и хозяйств аквакультуры занимает чуть менее 50% внутренних водоемов.
Наша страна располагает громадными возможностями для развития аквакультуры (20 млн. га озер, 4,5 га водохранилищ, 1 млн. га водоемов комплексного назначения, более 150 тыс. га прудов, свыше 300 тыс. кв. м садков и бассейнов). Есть все основания полагать, что существующая в мире тенденция к увеличению доли продукции аквакультуры по отношению к океаническому и морскому промыслу имеется и в России. На это направлены Постановление Правительства России от 31 октября 1999 г. (№ 1201) «О развитии товарного рыбоводства, осуществляемого во внутренних водоемах
Российской Федерации» и, разработанная Росрыбхозом, Федеральная программа «Аквакультура России в период до 2005 года», а также Концепция развития рыбного хозяйства Российской Федерации на период до 2020 г., одобренная Распоряжением Правительства РФ от 02.09. 2003 г.(№1265-р) (Мамонтов Ю.П., 2000; Никоноров СИ., Кожемяко О.Н., 2006).
Однако интенсификация рыбоводства и продолжающийся в настоящее время рост уровня загрязнения окружающей среды способствуют резкому увеличению числа бактериальных болезней прудовых рыб - объектов аквакультуры. Если не так давно ихтиопатологи сталкивались с тремя-четырьмя бактериальными болезнями, то теперь их количество увеличилось, и список этот далеко не окончательный. Сейчас актуальной на современном этапе интенсивного рыбоводства является профилактика заболеваний, вызываемых грамотрицательными и другими микроорганизмами, в т.ч. и аэромонадами.
Нередко пораженная рыба является источником серьезных заболеваний человека и животных. У пораженной рыбы резко снижаются вкусовые качества, товарный вид, питательная ценность, что приводит к ее порче, и тем самым наносится большой экономический ущерб.
Иногда в таких хозяйствах регистрируют высокие потери молоди, особенно в первые 6 мес. выращивания - до 70-90% (Юхименко Л.Н., Смирнов Л.П. и др., 2000; Белоусов В.И., 2005), это, несомненно, составляет одну из проблем этой формы аквакультуры. Зачастую причиной такой высокой смертности молоди являются высоковирулентные формы аэромоноза, снижающие темпы роста, приводящие к массовой гибели рыбы и экономическим потерям.
Аэромоноз является частью общемировой экологической проблемы, опосредованно связанной с деятельностью человека, всевозрастающим использованием в пище пресноводных рыб и других гидробионтов, контаминированных этим возбудителем.
7 Рыба и рыбопродукты, содержащие возбудитель аэромоноза, представляют серьезную опасность для человека и животных. Впервые клиническое значение аэромоноза, как заболевания человека, было доказано Hill В. J. с соавт. в 1954 г. (цит. по Погореловой Н. И. и соавт., 1995 г.). Они наблюдали ранее здоровую 40-летнюю женщину с септическим метастатическим миозитом, которая умерла через 48 часов после появления симптомов. С тех пор число сообщений на эту тему растет, что объясняется двумя причинами: 1) ранее выделение аэромонад не связывали с клинической симптоматикой; 2) аэромонады можно легко спутать с энтеробактериями, инфекции, вызванные аэромонадами, часто приписывали E.coli.
К началу 2004 г. в Российской Федерации на ветеринарном учете состояло более 1000 рыбоводных предприятий различной ведомственной принадлежности и 60000 рыбопромысловых водоемов (рек, озер, водохранилищ) общей площадью около 25 млн. га. В системе Росрыбхоза функционируют 400 рыбоводных хозяйств, из которых неблагополучными по заразным болезням рыб являются более 25%. Рыбоводством занимается 500 сельскохозяйственных организаций, ряд рыбоводных цехов промышленных предприятий и кооперативных объединений. В настоящее время часть фонда приватизирована, часть - сдана в аренду предпринимателям. В таких прудах, как правило, профилактические и лечебные мероприятия не проводятся (Материалы по статистической отчетности Департамента ветеринарии МСХ РФ, Яременко Н.А., 2003).
Значительная часть прудов не эксплуатируется вследствие высокого уровня цен на рыбопосадочный материал, комбикорма, удобрения и лекарственные препараты. В рыбоводных хозяйствах ликвидируются штатные единицы специалистов по болезням рыб, профилактические и лечебные отработки проводятся рыбоводами, что приводит к снижению качества проводимых ветеринарно-санитарных мероприятий.
8 Поэтому в целях усиления постоянного контроля за качеством пищевой продукции и кормов для животных, получаемых из рыб и других водных животных, как источников возможной бактериальной инфекции, необходимо в комплексе ветеринарно-санитарных мероприятий решать также и вопросы ветеринарно-санитарной экспертизы рыб и рыбопродуктов, в частности, это касается и при аэромонозной инфекции рыб.
Этим обосновывается выбор и актуальность проведенной нами научно-исследовательской работы.
Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования является разработка вопросов ветеринарно-санитарной экспертизы рыбы при аэромонозе с решением следующих задач:
Изучить распространенность аэромоноза среди карповых рыб;
Провести исследования по изучению органолептических и физико-химических показателей мяса рыб, пораженных аэромонозом;
Изучить микробную обсемененность карпов при аэромонозе;
Изучить устойчивость возбудителя аэромоноза к воздействию ряда физических и химических факторов;
Предложить научно-обоснованную ветеринарно-санитарную оценку рыбы при аэромонозе и режимы ее обезвреживания.
Научная новизна. Определены органолептические, физико-химические и микробиологические показатели рыб, пораженных аэромонозом на разных стадиях течения болезни.
Установлено, что при аэромонозе выделение аэромонад (A.hydrophila) и сопутствующей микрофлоры (S. enteritidis, Е. coli, St. aureus, Рг. vulgaris) из органов и тканей имеет место уже при поражении рыб в начальной стадии заболевания (наличие на коже небольших единичных красных пятен).
Выделенные из рыб культуры аэромонад агглютинировали в РА с 0-комплексными (серогруппы ABCDE) и монорецепторными сыворотками (0-соматические и Н-жгутиковые), что свидетельствует о наличии у аэромонад и сальмонелл некоторых общих антигенных факторов.
Проведенными исследованиями разработаны режимы обезвреживания мяса рыб, пораженных аэромонозом, при воздействии высоких и низких температур, процессов посола и копчения, СВЧ.
Дано обоснование, что при поражении карпов аэромонозом, в начальной стадии заболевания, направлять их на обезвреживание по предлагаемым режимам с последующей переработкой на пищевые рыбные продукты.
Изучены методом электронно-микроскопического исследования морфологические особенности бактерий Aeromonas hydrophila на жидких и плотных средах обитания; определена способность аэромонад к размножению и персистенции в кишечнике карповых рыб.
Проведенными исследованиями определена устойчивость культур аэромонад (Aeromonas hydrophila) к воздействию высоких температур (+ 73 и выше), 15 наименований антибиотиков (среди которых ципрофлоксацин, норфлоксацин и цефатоксим обладают наибольшей бактерицидной активностью), УФЛ, УЗ, озону и химическим средствам (аламинолу, бианолу, йодезу, септустину, дезамину).
Подготовлена и представлена в Федеральный институт промышленной собственности заявка на патент «Способ дезинфекции водной среды от возбудителя аэромоноза карповых рыб» (заявка № 2007102836/13 от 26.01.2007 г.).
Практическая ценность работы. На основании проведенных исследований подготовлены предложения по проведению ветеринарно-санитарной экспертизы карповых рыб при аэромонозе и определению устойчивости аэромонад к физическим и химическим факторам, которые включены в разработанные нами «Методические рекомендации по ветеринарно-санитарной экспертизе карповых рыб при аэромонозе и определению устойчивости аэромонад к физико-химическим факторам» (утверждено Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 04.07.2005 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных статей.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и приложений. Работа содержит 16 таблиц, 20 рисунков, 2 диаграммы. Список литературы включает 153 источника отечественных и зарубежных авторов.
Обзор литературы Глава 1. Аэромоноз карповых рыб и его распространение
Аэромоноз - инфекционная болезнь карпов, сазанов и их гибридов, проявляющаяся серозно-геморрагическим воспалением кожного покрова, асцитом, некротическим распадом кожной и мышечной тканей, поражением внутренних органов. Аэромонозом (эпизоотический язвенный синдром (по МЭБ), краснуха карпов, геморрагическая септицемия, инфекционная водянка, люблинская болезнь) также болеют, но реже, серебряные и золотые караси, лещи, лини, офра, плотва, верховка и белые амуры. Патогенность возбудителя аэромоноза доказана многими авторами, что показано в подготовленной нами таблице №1.
Прудовые рыбы подвержены многим инфекционным болезням, но среди них наибольшую опасность для их здоровья представляют аэромонады (Афанасьев В.И., 1990; Смирнов A.M., Скира В.Н., 2000; Коромыслов Г.Ф., Борисова М.Н., 2000).
Таблица 1
Распространение аэромоноза среди биологических объектов
Бактерии рода Aeromonas впервые были выделены и описаны в 1890 году O.E.Zimmermann'oM из питьевой воды, и им было дано название «Bacillus punktatus».
На роль аэромонад, как возбудителя заболеваний холоднокровных, указывали и другие авторы. Еще в 1904 году Плен М. (Plehn М., 1904) высказала мнение, что B.cyprinicida (Pseudomonas cyprinicida) является возбудителем заболевания карпов, которое назвала Karpenrotseuche.
Впоследствии многие авторы выделяли эти микроорганизмы из воды (Lehmann К.В. und Neumann R., 1896; Wunder V. und Dombrouski H., 1953; Артемова T.3., 1971 и др.), называя их «Bacterium punctatus», «Achromobater bunctatum», затем «Prseufomonas punctata», «Aeromonas punctata». В России этого возбудителя обнаружил в 1915 году Домрачев П.Ф., который описал эпизоотию краснухи карпов в одном из хозяйств Витебской губернии (цит. по Нечипоренко Ю.Д., 1968).
В 1911 году о заболевании карпов под аналогичным названием «краснуха» сообщили Шпикерман А. и Тинеман А. (цит. по Юхименко Л.Н., Викторовой В.Ф., 1979), хотя по своим клиническим признакам и патологоанатомическим изменениям оно в значительной степени отличалось от болезни, описанной М. Плен. Выделенный ими возбудитель B.plehniae, в отличие от B.cyprinicida, обладал высокой ферментативной активностью в отношении углеводов и не образовывал пигмента. По своим культурально-морфологическим и биохимическим свойствам он близко стоит к Aeromonas punctata.
В конце 20-х и начале 30-х годов прошлого столетия в ряде стран Европы, в том числе и в европейской части Советского Союза, распространилось инфекционное заболевание карпов, которое впервые описал Schaperclaus W. (1930) под названием «инфекционная брюшная водянка», выделив в качестве этиологического агента бактерию Pseudomonas (Achromobacter, Bacterium, Aeromonas) punctata. Вызываемую этим микробом болезнь карпов Шеперклаус назвал Infectiose Bauchwassersucht, т.е.
13 инфекционная брюшная водянка. Это заболевание карпов в странах Западной Европы по наиболее выраженному и постоянному его признаку - водянке -асциту у больных рыб было названо в Чехословакии Vodna telnost, в Румынии - Hidropisia, в Венгрии - Hasvickor, в Болгарии - Червенкта по тарана, в Польше - Posoenica, т.е. были предложены названия по значимости тождественные немецкому (Нечипоренко Ю.Д., 1968). Schaperclaus W. в своей книге «Болезни рыб» (1954) пишет: «Я не считал целесообразным, инфекционную брюшную водянку карпов -Infectiose Bauchwassersucht - обозначать, как Rotseuch - краснуха, так как в Германии уже понимали под этим названием довольно определенные заболевания». Автор говорит о краснухе, описанной Plehn М., имеющей специфического возбудителя, и краснухе неспецифического происхождения, возникающей у карпов вследствие механического раздражения кожи, влияния химических и других агентов внешней среды, т.е. незаразного происхождения.
У нас в стране инфекционную брюшную водянку карпов впервые описали Эпштэйн Г.В. и Пешков М.А. (1934) под названием «краснуха карпов». Обнаружив при гистологическом исследовании эозинофильные включения в коже и в головном мозге, они на основании этих данных высказали мнение о вирусной этиологии болезни (цит. по Лобунцову К.А. и Рудикову Н.И., 1979).
В отечественных исследованиях по болезням рыб того времени это заболевание описано под названием «пленовская краснуха карпов» (Догиль В.А., Пешков М.А., Гусев Н.В., 1939). Щербина А.К. (1939, 1960, 1964) инфекционную брюшную водянку карпов Шеперклауса назвал «краснухой или геморрагической септицемией». Это привело к тому, что к уже известному заболеванию, описанному под названием «краснуха Плен М.» Домрачева П.Ф., было присоединено новое заболевание, иной этиологии -инфекционная брюшная водянка карпов Шеперклауса. Позже Щербина А.К. (1952) отмечал, что «Термин «Краснуха карпов» включает в себя три
14 различных по этиологии болезни...» и считал «наиболее целесообразным оставить за ней название «геморрагическая септицемия карпов»». Одновременно с этим автор сообщил, что «...следует прийти к предварительному выводу, что возбудителем геморрагической септицемии карпов является бактерия Pseudomonas punctata forma ascitae (Achromobacter punctatum), имеющая фильтрующиеся стадии существования». И хотя этим автор явно противоречил сам себе, все же безапелляционно утверждал, что «диагноз на геморрагическую септицемию считается вполне обоснованным, если при осмотре больных рыб обнаружены характерные для этой болезни симптомы, выявлены основные эпизоотические особенности и при бактериологическом исследовании выделены патогенные штаммы бактерии Pseudomonas punctata».
Следует подчеркнуть, что в работах Щербины А.К. (1960) под названием «краснуха» приведено три заболевания карпов: «краснуха или геморрагическая» и немецкая краснуха с ее двумя формами -доброкачественной и злокачественной. Автор книги для каждой из форм указал разных возбудителей и поэтому каждая форма по существу представлена как этиологически самостоятельная болезнь.
Возбудитель краснухи карпов Aeromonas punctata, как это установил Пасовский А.И. (1939), является постоянным обитателем кишечника здоровых карпов и представителем его нормальной микрофлоры. Исключительную ценность имеют также исследования Маркевича А.П., Ляймана Э.М. и Шполянской А.Ю. (1949), отмечавших, что заболевание карпов краснухой начинается с воспаления кишечника (цит. по Погореловой Н.П., Журавлевой Л.А., 1995).
Аэромоноз зарегистрирован в России, в Западной и Восточной Европе, Южной Америке, Африке, Австралии, Тасмании, Азии, в том числе в Италии, Дании, Германии, Великобритании (Puble Health Laboratory Service) и скандинавских странах (Соторов И.Н., 1990). Так, A.hydrophila явилась возбудителем двух форм болезни нильской тиляпии, разводимой в прудах
15 Верхнего Египта. В Китае заболевание нильской тиляпии, вызываемое этой бактерией, носит название «гнилая кожа» из-за появления язв. В Шотландии зарегистрирована гибель кумжи (Trhorpe J. и Roberts R., 1972), связанная с высокой концентрацией A.hydrophila в воде.
В США, Японии и Европе неоднократно наблюдались случаи гибели золотых рыбок (Elliot et al.,1977).
В Индии у погибающих белых толстолобиков с признаками анемии, кровоизлияний, водянки и т.п. высеяны A.hydrophila. Вирулентные культуры возбудителя также были выделены из пресноводных лососевых в Австралии, от пресноводных рыб озера Бай (Филиппины), у анчоусов и сардин, содержащихся в лабораторных условиях.
Несколько эпизоотии описано в Италии (Chittino, 1972).
Многие авторы отмечали заболевания лягушек, пиявок, змей, ящериц, крабов, вызванные бактериями A.punktata (Sanarelli J., 1891; Trambusti A. 1893; Russell Т.Н., 1898; Beichenbach-Klinke H.H., 1963; Busing K.N., 1951; Schubert R., 1960).
Различные аспекты проблемы аэромоноза карповых рыб в России изучали многие авторы: Шербина А.К., 1960; Лобунцов К.А., 1970, 1979; Канаев А.И., 1972; Бутко М.П., Радин И.Д., 1974; Афанасьев В.И., 1986; Юхименко Л.Н., 1987; Осетров B.C., 1988; Кардашова Е.В., Пожалостина Л.В., 1994; Соторов П.П., 1999; Грищенко Л.И. и соавт., 1999; Зимин Н.Л., 2000; Наумова A.M. 2005; Енгашев В.Г 1968,2005 и др.
Показатели распространенности инфекционных болезней рыб по РФ составляют 31% от всех болезней, однако, ущерб от таких заболеваний, как аэромоноз карповых рыб и фурункулез (аэромоноз) лососевых рыб, весьма значительный. Следует иметь в виду, что аэромонады являются постоянными обитателями водной среды и при определенных обстоятельствах (стресс, снижение резистентности, нарушение гидрохимического режима) представляют опасность заражения рыб аэромонозом. Возбудители аэромоноза могут передаваться через воду, больных рыб и реконвалисцентов и других пораженных позвоночных, эктопаразитов. Установлено, что в воде прудов хозяйств, благополучных и неблагополучных по аэромонозу, аэромонады встречаются всегда. Варьируется лишь их количество и степень вирулентности. Это подтверждает тот факт, что аэромонады являются одним из компонентов микробиоценоза воды (Юхименко Л.Н., Викторова В.Ф., 1988).
Инфекция наносит значительный экономический ущерб. Согласно данным Афанасьева В.И. (1984), при помещении двухлеток карпа в зимовальный пруд 1085 экземпляров (96%-е поражение язвенной формой) в апреле выход составил всего 39,8%.
В России аэромоноз поставлен в один ряд с особо опасными инфекциями, при которых на хозяйство накладывают карантин. Рыбоводческие хозяйства в России, где установлен диагноз на аэромоноз, объявляются неблагополучными по данному заболеванию, на них накладывают карантин и проводят комплекс мероприятий по плану, утвержденному районной (городской) администрацией. Для лечения рыб применяют препараты нитрофуранового ряда и антибиотики в смеси с кормом по разработанной схеме.
Микробиологические методы исследования
Посевы производились из внутренних органов, крови, с мест поражений кожной поверхности карпов на МПА, МЖА, МПБ, Эндо и Плоскирева и других с последующей идентификацией подозрительных культур по культурально-морфологическим, биохимическим свойствам. Схема выделения аэромонад представлена на рис. 2.
Для получения экспериментального аэромоноза заражали карпов внутрибрюшинно (3 экз.). Использовали суточную агаровую культуру A.hydrophila (штамм 147-25) в концентрации 2 млрд. микробных тел, которую вводили в дозе 0,2 мл каждому. На 5-й день после заражения производили вскрытие снулых рыб, у которых при жизни было отмечено ерошение чешуи на месте инъекции, а на вскрытии - кровенаполнение внутренних органов. Затем исследовали органы рыб на наличие аэромонад. 4.1.2. Выделение сопутствующей микрофлоры Для выделения золотистого стафилококка (St. aureus) исследуемый материал (12 проб) вносили в МПБ с хлоридом натрия (6-7%) и инкубировали 24 часа при +37 С. Далее из среды обогащения производили посев на солевой МПА, который выдерживали в термостате 24 ч. Учитывали колонии золотистого цвета, правильной округлой формы, выпуклые с гладкой поверхностью и ровными краями, диаметром 2... 7 мм, непрозрачные. Из культур, выросших на питательной среде, готовили мазки, окрашивали по Граму и микроскопировали, где учитывали наличие характерных скоплений кокков (напоминающих гроздья винограда), окрашенных по Граму положительно.
Для выделения кишечной палочки (E.coli) посев исследуемого материала проводили методом отпечатков со свежего разреза пробы на среду Эндо. Через 24 часа учитывали рост колоний, характерных для E.coli: округлой формы, с ровными очерченными краями, имеющие матовую поверхность, малиново-красный цвет, размер колоний 2...4 мм. Из культур (из изолированных колоний), выросших на средах, готовили мазки, окрашивали по Граму. Учитывали при просмотре наличие палочковидных грамотрицательных бактерий, которые располагались одиночно, парно или в виде коротких цепочек. И делали заключение о присутствии кишечной палочки.
Для выделения бактерий рода Proteus ("Pr. vulgaris) 1 г продукта высевали в рыбопептонный бульон, посевы помещали в термостат при 37 С.
Через 24 ч. для определения бактерий рода (Proteus) брали 2 капли из рыбопептонного бульона и вносили в конденсационную воду свежескошенного МПА (способ Шукевича), не касаясь поверхности среды. Засеянные пробирки вертикально помещали в термостат при t 37С. Через 18-24 ч. посевы просматривали, обращая внимание на образование ползущего вверх вуалеобразного опалесцирующего налета с голубоватым оттенком, издающего неприятный гнилостный запах, что позволяло судить о присутствии вульгарного протея (Н-форма, т.е. подвижные полиморфные палочки).
Для выделения сальмонелл (Salmonella) навеску (мышечной ткани) массой 25 г, а внутренних органов по 2 г высевали в среду обогащения (селенитовый бульон, МПБ), а кровь - в объеме 0,5 мл. На второй день (через 24 ч. выдержки в термостате) из среды обогащения делали высев в чашки Петри на среду Плоскирева. Посевы термостатировали при +37 С в течение 15-18 ч. На среде Плоскирева учитывали рост характерных для сальмонелл колоний: прозрачных, голубоватых или нежно-розовых. Из подозрительных колоний делали мазки, которые окрашивали по Граму и микроскопировали (грамотрицательные палочки, располагающиеся единично, спор и капсул не образуют), исследовали в РА с сальмонеллёзными сыворотками на стекле.
Определение количества микроорганизмов на тестируемой поверхности. Количество микроорганизмов на 1 см определяли чашечным методом (учет роста колоний).
Стерильными марлевыми тампонами протирали ограниченную поверхность тест-объекта (10 х 10см ), которые затем помещали в пробирки с 10 мл стерильного физиологического раствора. Отбирали не менее 3-х смывов с каждого вида поверхности.
Сравнительная оценка рос га аэромонад на различных пи гательных средах
Нами были исследованы экземпляры карпов из неблагополучных по аэромонозу ряда рыбоводных хозяйств Московской области (рыбхоз «Клинский» Клинского района, рыбокомбинат «Бисеровский» Ногинского района и рыбхоз «Гжелка» Раменского района), а именно: с признаками заболевания в начальной стадии (наличие на коже небольших единичных красных пятен); с явными характерными клиническими признаками аэромоноза (острая форма); при экспериментальном аэромонозе и в качестве контроля использовались клинически здоровые рыбы (из р/х «Малая-Истра» - хозяйства благополучного по аэромонозу). Как показывают данные проведенных исследований (таблица № 3), выявление возбудителя аэромоноза отмечается у карпов как в начальной стадии заболевания, так и с явными клиническими признаками аэромоноза. Выделение аэромонад отмечается также при экспериментальном аэромонозе из внутренних органов рыб (на 5 день после заражения), когда отмечены только первые клинические признаки заболевания. Полученные данные свидетельствуют, что карповые рыбы уже на начальной стадии заболевания аэромонозом в ветеринарно-санитарном отношении представляют опасность как пищевой продукт при употреблении его человеком, так как и на этой стадии заболевания из внутренних органов и на поверхности кожи нами были выделены аэромонады. Выделенные культуры возбудителя аэромоноза для подтверждения их типичности были исследованы по ряду показателей, как-то: культурально-морфологические и биохимические свойства (п.8.3.).
Изучение биохимических свойств выделенных культур возбудителя аэромоноза и их дифференциации от бактерий сходных родов
Изучение биохимических свойств аэромонад предусматривает определение их оксидазной активности, способности к расщеплению глюкозы, образования сероводорода и других свойств выделенных культур; в качестве контроля проводили сравнение этих показателей с музейными штаммами.
Результаты исследований, изложенные в таблице № 4, показывают, что по комплексу биохимических свойств представляется возможным подтвердить типичность выделенных культур возбудителя аэромоноза и дифференцировать их от бактерий сходных родов (Vibrio, Pseudomonas, Plesiomonas), а именно по положительной оксидазной активности, аэробному окислению (к/г), образованию к/г на среде Гисса с маннитом, на средах с глюкозой, сахарозой и мальтозой, образование сероводорода и протеолитической активности на среде с лакмусовым молоком. Эти показатели совпадают с таковыми музейными штаммами аэромонад (контроль).
По этим же показателям (за исключением оксидазной активности) можно дифференцировать аэромонад от бактерий родов Vibrio, Pseudomonas, Plesiomonas.
Следует иметь в виду, что при заболевании животных (в т.ч. и рыбы) происходит ослабление резистентности их организма и поэтому наблюдается развитие сопутствующей микрофлоры наряду с возбудителем болезни. В связи с вышесказанным нами были проведены микробиологические исследования на наличие в органах больных карпов (в начальной стадии заболевания и при острой форме аэромоноза) сальмонелл, золотистого стафилококка, кишечной палочки и протея.
Результаты этих исследований приведены в таблице 3, из которой можно видеть, что: при поражении аэромонозом в начальной стадии заболевания имело место выделение: - сальмонелл из жабр (идентифицирован серовариант S. enteritidis [группа Ді; О-антиген 9,12; Н-антиген (1-я фаза g, m); 2-я фаза (1,7)]; золотистого стафилококка (St. aureus) - из жабр, мышечной ткани; кишечной палочки (Е. coli) - из жабр и мышечной ткани; протея (Рг. vulgaris) - из печени и жабр; при острой форме аэромоноза выделены: - сальмонеллы (Salmonella) - с поверхности кожного покрова, мышечной ткани и жабр (тот же серовариант, как указано выше); - золотистый стафилококк - с поверхности кожного покрова и мышечной ткани); - кишечная палочка - с поверхности кожного покрова, мышечной ткани, жабр; - протей - с поверхности кожного покрова и жабр; у клинически здоровой рыбы (контроль) были выделены только из ткани жабр золотистый стафилококк, кишечная палочка и протей.
Таким образом, выделение сопутствующей микрофлоры при аэромонозе карповых рыб должно учитываться при ее (рыбе) ветсанэкспертизе и оценке как пищевого продукта для человека, особенно следует учитывать в связи с выделением на начальной стадии заболевания не только аэромонад, но и сальмонелл, при наличии которых такая рыба не подлежит свободной реализации.
Органолептические показатели мяса рыб
При проведении органолептических исследований мяса карпов учитывался в комплексе ряд показателей, а именно: внешний вид, чешуйчатый покров, слизь, глаза, брюшко, анальное отверстие, цвет мышечной ткани, запах, консистенция, цвет бульона, которые представлены в таблице 6.
Из таблицы 6 можно видеть органолептические показатели мяса здоровых рыб в начальной стадии аэромоноза. Имеются несущественные различия, в частности, касающиеся чешуйчатого покрова, слизи, брюшка. 9.2. Результаты физико-химических показателей мяса рыб Определение физико-химических показателей мяса проводили у карпов, пораженных аэромонозом в начальной стадии заболевания. Исследованию подверглись пробы карпа чешуйчатого и карпа зеркального. В качестве контроля служила охлажденная рыба (карп чешуйчатый и карп зеркальный), не пораженная аэромонозом. Физико-химические показатели мяса рыбы, Опыт 1. При изучении в сканирующем электронном микроскопе морфологических особенностей роста клеток (суточная культура) в популяции A.hydrophila было видно, что на участках колоний бактерии A.hydrophila плотно прилегают друг к другу, имеют определенную ориентацию и объединены межклеточным матриксом. На отдельных участках колоний выявляются покровы в виде тонкой пленки, через которую видны очертания клеток (рис.16,17). бактериальные популяции необходимо пользоваться культурой бактериальных клеток, находящихся в S-форме. Установлено, что для данной культуры оптимальное время роста (S-форме) составляло 24 часа (рис.18). Опыт 2. В поздние сроки роста культуры (R-форма) свыше 48 часов наблюдался ее переход в состояние гетероморфизма с различными проявлениями L-трансформации. На рис. 19 видны шаровидные клетки сферопластного типа, находящиеся в ассоциации и объединённые общими чехлами. В центре рисунка виден плотный тяж, сформированный из детрита клеток, клеточных стенок и покровов. На поверхности таких тяжей отчетливо дифференцируются мелкие шаровидные L -формы.
Опыт 3. В исследованиях было установлено, что популяции бактерий A.hydrophila воздействие неблагоприятных факторов (в нашем опыте -длительность культивирования, действие антибиотика ципрофлоксацина) способствует переходу популяции в стадию гетероморфизма с различными проявлениями L-трансформации и образованием L-форм. При определенных условиях (выращивание на среде обогащения) нестабильные L-формы могут реверсировать в исходное состояние с восстановлением морфо биологических свойств.
Изучение взаимоотношения аэромонад с мальками карпа
По данным опуликованных работ (Погорелова Н.П., Журавлева Л.А., Ибрагимов Ф.Х., Ющенко Г.В., 1995), известно, что по отношению к рыбам A.hydrophila находится нередко в сапрофитической фазе существования, как условно-патогенная микрофлора. При этом было отмечено, что в качестве инфекции патологические процессы у рыб могут наблюдаться как при повышении температуры воды от 20 до 25С , так и ее понижении до 5-10С, а также при воздействии других биотических и абиотических факторов.
Для исследования взаимоотношения аэромонад с рыбами использовались клинически здоровые мальки карпа. В начале проводили контаминацию аэромонадами (A.hydrophila) автоклавированной водопроводной воды в количестве 106 м. тел./мл., в которой находилось 5 мальков. В течение срока наблюдения (10 суток) мальки оставались живыми. На 11-е сутки тушку погибшего малька отбирали для микробиологического анализа, промывали стерильным физиологическим раствором и делали высев смыва на МПА, инкубировали при 37С в течение 24 час. в термостате. После подращивания, из отдельных колоний готовили мазки с последующим окрашиванием по Граму. В световом микроскопе были выявлены грамотрицательные палочки, характерные для данного вида бактерий.
Для электронно-микроскопического исследования тушку малька фиксировали в 4% растворе глутарового альдегида на фосфатно-буферном растворе в течение суток. После этого тушку обезвоживали в восходящих концентрациях этилового спирта (50, 60, 70). Из фрагментов жабр и кишечника готовили препараты, которые подвергались дальнейшему обезвоживанию в 96 и 100 этиловом спирте. Препараты наклеивали на подложки, напыляли и просматривали на сканирующем электронном микроскопе.
Устойчивость в водной среде при плюсовых температурах
Важным моментом при выращивании рыбы в рыбоводных хозяйствах и при ее переработке на рыбоперерабатывающих предприятиях является требование создания соответствующих санитарных условий на этих предприятиях, что должно обеспечивать получение здоровой рыбы и выпуск качественной рыбной продукции. Согласно «Международному ветеринарному кодексу по водным животным» (1999) для выполнения этих требований предусматривается применение ряда физических и химических средств. Знание чувствительности возбудителя аэромоноза к физико-химическим факторам важно не только для ветсанэкспертизы, но и для мероприятий по санации рыбохозяйственных и рыбоперерабатывающих предприятий.
Опыты были проведены по изучению устойчивости аэромонад в стерильной водной среде (рН 8,3), в которую предварительно вносили односуточную культуру аэромонад из расчета 2 млрд.м.тел/мл и которую подвергали подогреву, начиная от +20 до +100С. После каждого периода увеличения температуры отбирали пробу в объеме 1мл и производили посев на МПА, инкубировали в термостате при температуре +37С в течение 7 суток. Учет производили по наличию роста культуры или ее отсутствию на питательной среде (таблица 9). Установлено, что культура (A.hydrophila, штамм №164-19) в физиологическом растворе (объем 0,5 л при исходной концентрации 2 млрд./мл) при температуре от +20 до +65С оставалась жизнеспособной, а при +73С и выше погибала моментально.
Определение устойчивости к воздействию антибиотиков
В комплексе мероприятий по борьбе с аэромонозом карповых рыб в рыбоводных хозяйствах применяют ряд препаратов, где действующим веществом являются антибиотики.
Согласно «Инструкции о мероприятиях по борьбе с аэромонозом карповых рыб» (1998) рекомендованы ряд препаратов нитрофуранового ряда (фуразолидон, фуракарп, фуртин, фурадонин) и антибиотиков (левомицитин, дибиомицин, бациллихин, ветдипасфен, карповит биомицин, биоветон, кротонолактон, кормогрицин), многие из которых не представляется возможным приобрести по ряду причин (отсутствие производства и др.).
Нами исследовано 15 наименований антибиотиков в концентрации от 5 до 300 мкг в 3-кратной повторяемости с применением 3х культур аэромонад, выделенных из различных рыбоводных хозяйств Московской области. Учет эффективности осуществлялся по зоне задержки роста культур.
Результаты исследований представлены в таблице 10. Так, аэромонады малочувствительны (до 14 мм) к группе полусинтетических пенициллинов (ампициллину, карбенициллину, оксациллину, цефазолину); достаточно чувствительны (15-25 мм) к эритромицину, канамицину, полимиксину, стрептомицину (с колебаниями ЗЗР в пределах 17-28 мм); высокочувствительны (свыше 25 мм) - к норфлоксацину, тетрациклину (с колебаниями ЗЗР в пределах 29-30 мм), амикацину (с колебаниями ЗЗР в пределах 23-33 мм), гентамицину, цефтоксиму, ципрофлоксацину, левомицетину, фурадонину.
Среди испытанных антибиотиков с высокой чувствительностью к ним аэромонад выделяются: представитель из группы фторхинолонов ципрофлоксацин (ЗЗР до 51-52 мм для A.hydrophila и до 32-35 мм для A.caviae) и норфлоксацин (ЗЗР 45-48 мм для A.hydrophila и 27 мм для A.caviae, цефатоксим 3-го поколения из группы цефалоспоринов (ЗЗР 40-42 мм для A.hydrophila и 32-33 мм для A.caviae), которые превышают таковые показатели контрольных антибиотиков.
В ряду высокочувствительных антибиотиков, на наш взгляд, представляет интерес ципрофлоксацин, к которому в наибольшей степени чувствителен возбудитель аэромоноза по сравнению с другими препаратами. Он может быть перспективным (в отдельных случаях) для борьбы с аэромонозом карповых рыб. В связи с этим были проведены электронно микроскопические исследования по изучению действия этого антибиотика на аэромонад (пп. 12.2.1.).
Электронно-микроскопические исследования по изучению действия ципрофлоксацина на аэромонад
Задачей данного исследования являлось изучение, как наиболее эффективного антибиотика ципрофлоксацина, выявление механизма его действия на возбудителя аэромоноза (A.hydrophila).
В связи с этим на первом этапе были проведены исследования по изучению выживаемости бактериальных клеток A.hydrophila под действием ципрофлоксацина. Для этой цели применяли методику разведений культуры с последующим высевом на мембранные фильтры (см. стр. 33 данной диссертации).
