Содержание к диссертации
Введение
I Обзор литературы 9
1 Бактериальная контаминация - основной показатель качества мяса 9
2 Источники и видовой состав микробной контаминации продуктов убоя скота 10
2.1 Эндогенная контаминация парного мяса 11
2.2 Экзогенная контаминация парного мяса 12
2.3 Микрофлора охлаждённого мяса 15
2.4 Микрофлора замороженного мяса 16
3 Контроль качества санитарной обработки при производстве мяса 18
4 Современные методы оценки микробиологического статуса мяса, а также контрольных критических точек мясоперерабатывающего предприятия, на основе учёта общей бактериальной обсеменённости (КМАФАнМ) 20
4.1 Прямые методы (подсчёт КОЕ и бактериальных клеток) 22
4.2 Непрямые (косвенные) методы 32
5. Каталазные методы, использующиеся в бактериологической практике 47
II Собственные исследования 56
1. Материалы и методы исследований 56
2. Разработка метода RID А АТФ для определения санитарно-гигиенического состояния мясоперерабатывающих предприятий 69
3. Разработка метода определения свежести мяса на основе ферментативной активности бактериальных контаминантов 84
3.1 Разработка перманганатометрического метода определения количества каталазы в мясе 84
3. 2 Разработка метода определения количества каталазы в мясе и мясопродуктах по скорости распада определённого количества Н202 97
Обсуждение результатов 113
Выводы 125
Список использованной литературы 128
Приложения 142
- Прямые методы (подсчёт КОЕ и бактериальных клеток)
- Каталазные методы, использующиеся в бактериологической практике
- Разработка метода RID А АТФ для определения санитарно-гигиенического состояния мясоперерабатывающих предприятий
- Разработка метода определения количества каталазы в мясе и мясопродуктах по скорости распада определённого количества Н202
Введение к работе
Актуальность темы. Задача повышения качества продукции животного происхождения - одна из наиболее важных на современном этапе развития » сельского хозяйства. В соответствии с вступлением в действие закона РФ о техническом регулировании, возрастает роль ветеринарно-санитарных мер, предусматривающих требования к мясу, его производству, процедурам испытания, инспектирования, подтверждения соответствия для обеспечения безопасности мясной продукции для потребителя.
Одним из важных показателей качества мяса и мясных продуктов является их свежесть. Под понятием «свежее мясо» понимается продукт, полученный от здоровых животных, транспортирование и убой которых проводились в строгом соответствии с действующими ветеринарными требованиями, а охлаждение, заморозка, хранение и реализация — в соответствии с санитарными и технологическими нормативами. Определить степень свежести на начальных стадиях порчи очень сложно и вместе с тем очень важно с гигиенической и экономической точек зрения. Сложность вопроса заключается в том, что основной органолептический метод исследования мяса на свежесть субъективен (Пяткин К.Д.1980; Huhtanen C.N. et al., 1975; Otero A., et ah, 1985, Mayr D. et al., 2003). Поэтому при оценке незначительных изменений в мясе на начальной стадии порчи он не может быть решающим.
Как известно, фактором, влияющим на свежесть мяса и мясопродуктов, являются микробные контаминанты, которые являются возбудителями порчи этих продуктов. Микроорганизмы постоянно контаминируют поверхности технологического оборудования, мясных туш и готовых мясных продуктов. При нарушении температурно-влажностных режимов и сроков хранения мяса и мясных продуктов микроорганизмы через активность собственных протеолитических ферментов также вызывают распад не только мышечной ткани, но и дальнейшие ферментативные превращения тех полураспавшихся продуктов, которые характерны для свежего мяса. При этом заметно
4 изменяются органолептические характеристики мяса, которое становится испорченным и опасным для здоровья потребителя (Калина Г.П., 1969; Мюнх Г.-Д., Заупе X., Шрайтер М, 1985).
В большей степени снижение микробной контаминации мяса в процессе первичной переработки скота обеспечивает соблюдение ветеринарно-санитарных и гигиенических условий с использованием эффективных средств и методов санитарной обработки и профилактической дезинфекции, в совокупности с ускоренными методами контроля микробного загрязнения мяса и технологического оборудования, соприкасающегося с ним.
Существующие средства и методы определения уровня бактериальной контаминации продукции и поверхностей технологического оборудования в процессе первичной переработки скота трудоёмки, малопроизводительны и не могут быть использованы для оперативного контроля качества мяса, особенно на малых предприятиях, где отсутствуют бактериологические лаборатории. Отсюда возникла необходимость изыскания объективных ускоренных, надёжных по своей специфичности и чувствительности лабораторных методов исследования мяса на свежесть и методов контроля качества проводимых на предприятии ветеринарно-санитарпых мероприятий.
Цель и задами исследований. Целью работы являлась разработка метода контроля ветеринарно-санитарного состояния мясоперерабатывающих предприятий и ускоренного метода оценки качества мяса на основе каталазной активности бактериальных контаминантов. Для достижения данной цели мы поставили перед собой следующие задачи:
1. Изучить возможность использования суммарного уровня аденозин5'-
трифосфата (АТФ) в смывах для контроля санитарно-гигиенического
состояния технологического оборудования.
2. Испытать биолюминесцептный метод контроля для определения уровня
ЛТФ в условиях мясоперерабатывающего производства, изучить его
чувствительность и специфичность.
-
Определить критерии содержания суммарного АТФ в смывах для классификации степени чистоты поверхностей.
-
Разработать ускоренный метод определения свежести мяса и мясопродуктов на основе определения активности каталазы бактериальных контаминантов.
-
Изучить зависимость между уровнем активности каталазы и степенью свежести мяса убойных животных.
-
Разработать методические рекомендации и указания по определению свежести мяса и санитарно-гигиенического состояния оборудования мясоперерабатывающих предприятий.
Научная новизна. На основании проведённых исследований по изучению возможности использования метода Шс1аАТФ с разработанными нами методическими приёмами для определения санитарно-гигиенического состояния мясоперерабатывающих предприятий определены критерии чистоты оборудования по уровню АТФ, позволяющие рекомендовать данный метод для практического применения.
Изучена динамика изменения уровня активности каталазы в мясе убойных животных в зависимости от зрелости и степени свежести мяса. В процессе созревания мяса происходит резкое падение первоначально высокого уровня тканевой каталазы. Затем в созревшем мясе уровень тканевой каталазы практически не изменяется. Показано, что в процессе порчи мяса происходит увеличение активности фермента за счёт роста количества бактерий при незначительном уровне мышечной каталазы в качестве фона.
В результате проведённых исследований нами впервые разработан метод определения качества мяса на основе активности каталазы бактериальных контаминантов. Данный метод определения свежести мяса имеет существенные преимущества по сравнению с классическими методами по своей специфичности, простоте и скорости получения результатов и может быть использован для прогнозирования срока хранения мясного сырья.
6 Практическая ценность работы.
На основании результатов исследований разработаны:
«Методические указания по ускоренному определению санитарно-гигиенического состояния мясоперерабатывающих предприятий с помощью метода RidaAT
«Методические рекомендации по определению свежести мяса на основе анализа активности каталазы бактериальных контаминантов» (утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 27.04.2005 г).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
4-ой Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2002 г);
5-ой Международной научно-практической конференции «Пища. Экология. Человек» (Москва, 2003);
ХП-ом Всероссийском ветеринарном конгрессе (Москва, 2004);
5-ой Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2004 г);
заседаниях Учёного совета ВНИИВСГЭ;
межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2005 г). Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных статей. Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 стр.
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Список литературы включает 154 источника (81 отечественных и 73 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 12 таблицами, 3 графиками и 3 рисунками.
Прямые методы (подсчёт КОЕ и бактериальных клеток)
Разработка Р.Кохом метода культивирования микроорганизмов на плотной питательной среде (агаре) послужила основой для создания прямого чашечного метода определения общей бактериальной обсемененности. С помощью этого метода определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов -КМАФАнМ в смывах с поверхностей оборудования и в экстрактах, гомогенатах различных продуктов. Данный метод является классическим и обычно используется как эталонный при определении пригодности других методов, предлагаемых для определения общей бактериальной обсемененности.
Традиционная процедура включает: гомогенизацию для твердых образцов (например, мясо), разведение, посев на чашках на соответствующую питательную среду, термостатирование при выбранной температуре в течение более 48 часов и подсчёт специфических колоний. Площадь поверхности чашки достаточна для образования 300 колоний, но поскольку многие продукты содержат более чем 300 микробов на 1 см , то на поверхности чашки Петри необходимо распределить разбавленный образец [50].
Однако целый ряд факторов влияет на точность подсчета бактерий этим методом. Так, бактерии в экстракте мяса часто встречаются в виде цепочек, скоплений, содержащих различное количество клеток, а при росте на питательных средах могут давать одну колонию. К тому же на поверхности мясной туши бактерии распределены неравномерно, что отражается на получаемых результатах. Разные бактерии, присутствующие в мясе, имеют неоднородный оптимум роста. Состав питательной среды, ее рН, редоксипотенциал, температура и продолжительность термостатирования влияют на результат подсчета [64, 74]. Кроме того, возможны ошибки при подсчете, если заливается слишком горячий агар [113].
Точность подсчета общего числа микроорганизмов на плотной питательной среде зависит и от способа разведения и состава раствора для приготовления разведений. ГОСТ 7702.2.1-95 предусматривает разведение мясного экстракта в физиологическом растворе. Имеются указания ряда авторов [57] о неблагоприятном воздействии физиологического раствора на некоторые виды микроорганизмов. Поэтому они рекомендуют приготавливать разведения в теплом растворе Рингера или в 1,5 %-ном растворе трехзамещенного цитрата натрия.
Согласно протоколу, рекомендованному ХАССП для контроля санитарно-гигиенического состояния производства для увлажнения ватных тампонов для отбора смывов и получения разведений должен быть использован стерильный раствор: 8,5 г NaCl, 1 г триптон казеин-пептона, агар 0,1 г, и дистиллированная вода до 100 мл [91]. В то время как у нас для отбора смывов используется просто физиологический раствор.
Еще одним недостатком данного метода многие авторы [124] считают тот факт, что не учитываются анаэробы, часть психротрофных и термофильных бактерий. Вопрос об универсальной среде, на которой могли бы расти все микроорганизмы, детально изучался, однако подобрать такую среду оказалось практически невозможным [34].
В разных странах для учета общего количества бактерий используют самые разнообразные среды. Для получения сравнимых результатов, характеризующих общее количество бактерий, необходимо использовать строго определенные питательные среды. Этой цели отвечает питательная среда триптон - дрожжевой экстракт - глюкоза. В нашей стране готовая среда с таким составом компонентов выпускается под названием «Среда для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов - КМАФАнМ».
Подсчет числа выросших колониеобразующих единиц (КОЕ) очень зависит от способностей исследователя рассмотреть и подсчитать мелкие и мельчайшие колонии, к тому же подсчет вручную очень утомителен [97, 98]. Основным же недостатком прямого чашечного метода считается его значительная трудоемкость и длительность получения конечных результатов - трое суток. Кроме того, коэффициент колебаний (погрешность метода) при посеве на чашки Петри составляет в среднем 20 % и более [131], а по данным авторов [74] - 90%, даже с современной техникой подсчёта количества колоний.
Несмотря на многочисленные недостатки, преимущество метода заключается в том, что с его помощью все же можно получить довольно точную количественную оценку жизнеспособных клеток. [27].
Некоторые технологические преимущества облегчают автоматизацию данного метода. Например, существует прибор Стомахера (Stomaching) -эталонный метод для гомогенизации образцов пищевых продуктов. В соответствии с эти методом стерильную ёмкость с пробой и разбавителем помещают в прибор Стомахера, в котором продукт измельчается, и микроорганизмы вытесняются в разбавитель. Полученный образец далее используется для подсчёта жизнеспособных клеток различными методами. Тони Шарп создал прибор, названный пульсатором, который может вытеснять бактерии из пищевого продукта путём генерирования импульсов в ёмкости. Гравиметрические устройства для разведения значительно снижают ошибки, возникающие при взвешивании и разливе с дозированием вручную [74, 92,129].
С целью усовершенствования чашечного метода, путем модификации и автоматизации, в разных странах были разработаны различные приборы и приспособления. Овально-пробирочный и чашечно-петельный методы основаны на том же принципе, что и стандартный чашечный, за исключением того, что посев образцов производят платиново-родиевой проволочной петлей, а не пипеткой. Петли стандартизированы на захват 0,01 или 0,001 см разведения образца и стерилизуются в пламени. При использовании овально-пробирочного метода образец вносят в пробирку с расплавленным агаром, приготовленным в соответствии с требованиями стандартного метода. После перемешивания пробирку с содержимым оставляют в горизонтальном положении и агар застывает. Подсчитывают колонии, которые образовались за время инкубации при 32С в течение 48 ч. Чашечно-петельный метод аналогичен предыдущему, за исключением того, что петля присоединяется к шприцу Корнуолла непрерывного действия через укороченную подкожную иглу 13-го калибра, конструкции Луер-Лока. Образец вымывается из петли в чашку Петри стерильным буферным раствором из пипетки Корнуолла. В ос-тальном методика такая же, что и в стандартном чашечном методе [50]. Данные методы дают более надежную оценку численности бактериальной популяции и в то же самое время менее трудоемки и дорогостоящи, чем чашечный метод, хотя менее точны при исследовании образцов с высокой микробной загрязненностью. К недостатку относят точность градуировки петель и порчу металлической поверхности петли из-за появления и постепенного увеличения нароста твердых частиц из экстракта мяса [89].
Посев гомогенатов на чашках и точное разведение можно выполнить посредством спирального устройства для посева. Неразбавленный или разбавленный образец вытекает из тефлоновой трубки по архимедовой спирали на поверхность агаровой чашки. Плунжер распылителя (шприца), несущий образец, движется с равномерно снижающейся скоростью по мере того, как распылитель перемещается от центра к наружному краю агара. Посев бактерий ограничен дорожкой спирали. Колонии развиваются в наибольших концентрациях вблизи центра и реже встречаются к краю чашки. Поскольку количество образца и скорость его внесения известны, то объем в любой части чашки будет одинаковым. Поэтому можно определить число бактерий в любой части чашки при помощи обычного счетчика колоний с модифицированной счетной сеткой. Чувствительность данного метода - 103-106 колониеобразующих единиц на г/мл. [129].
Разработан также счетчик с использованием лазера для автоматического подсчета и регистрации колоний. Автоматические счётчики колоний определяют посредством анализа изображений при помощи программного компьютерного обеспечения интерференцию частиц продуктов питания и полученных от различных оптических свойств разных типов колоний [50, 129].
Для работы микробиологических лабораторий, определяющих качество мяса, доступны различные автоматизированные системы для приготовления чашек Петри, наполненных агаром. Также продаются зарубежными фирмами и уже готовые чашки со средой.
Каталазные методы, использующиеся в бактериологической практике
Фермент катал аза локализован в клетке в пероксисомах (микротельцах) [79]. В отличие от большинства гидролитических ферментов каталаза является сложным ферментом, состоящим из белка и простетической группы, в состав которой входит протогемоглобин, связанный с белковой частью молекулы двухкарбоксильными остатками [35]. Молекулярная масса каталазы 225000 - 248000 в зависимости от источника ее получения. В молекуле каталазы содержится до 0,09% железа. Это означает, что в состав одной молекулы фермента входит 4 атома железа, то есть в молекуле присуствуют четыре простетические группы протогемоглобина. Отличительной особенностью каталазы является то, что ее простетическая группа непосредственно участвует в активации субстрата [47]. Субстратом для каталазы является перекись водорода - соединение неустойчивое, в концентрированном виде легко разлагается с образованием воды и кислорода, но при низких концентрациях может существовать в растворах. Она довольно легко вступает в различные реакции с образованием производных. Как правило, большинство из них неустойчивы. При алкилировании или ацилировании перекиси водорода возникают моно- и диалкильные и ацетильные производные. Перекиси могут быть разрушены под воздействием температуры и за счет действия переходных металлов -окислителей и восстановителей. Под действием ферментов перекись разлагается мгновенно. По мнению многих авторов, каталаза и пероксидаза ускоряют реакции одного типа, но каталаза окисляет саму перекись водорода и не окисляет большинство веществ, на которые действует пероксидаза.
Известно несколько теорий, объясняющих по-разному механизм действия каталазы на перекись водорода, все они говорят о сложном процессе разложения перекиси водорода на 02 и Н20 с образованием не менее двух комплексов фермента с субстратом, в результате чего происходит окисление простетической группы фермента и затем ее восстановление. Простетическая группа каталазы прочно связана с белковой частью молекулы. Фермент катализирует разложение перекиси водорода на кислород и воду согласно уравнению: 2Н202 - 2Н20 + 02
В присутствии спиртов и небольшого количество перекиси водорода фермент способен окислять спирт в альдегид по уравнению:
Н202 + R- СН2ОН — R- СНО + 2Н20
Перекись водорода образуется в процессе дыхания живых организмов и в результате различных биохимический реакций окисления органических веществ. Физиологическое значение каталазы и заключается прежде всего в защите тканей от токсичного действия перекиси водорода, образующейся в процессе ферментативного окисления углеводов. Каталаза является одним из наиболее важных ферментов и способна вести реакции с большой скоростью и большим числом циклов [75]. Каталаза относится к ферментам, которые наиболее длительно сохраняют свою активность, почти не требуют энергии активации, скорость реакции этого фермента лимитирует лишь скорость диффузии субстрата к активному центру [45].
Каталаза, синтезируемая микроорганизмами, обладает сравнительно высокой устойчивостью к кислой среде. Оптимальная зона рН для каталазы лежит в интервале 6,0 - 8,0 [80].
Каталаза широко представлена в клетках живых организмов, в том числе микроорганизмов и растений [47, 58].
Содержание каталазы в тканях и органах животных может колебаться в весьма широких пределах. Так, у морских свинок величина показателя колебалась от 50 до 299, у крупного рогатого скота от 53 до 148 условных единиц. Наибольшее количество данного фермента обнаружено в печени, крови (эритроцитах) и почках [71, 104]. В таблице 1 приведены данные по активности каталазы на примере крысы [45].
При исследовании представителей отряда грызунов (крысы, нутрии и шиншиллы) авторами [38] выявлена высокая межвидовая вариабильность активности каталазы в органах и тканях. Так, в органах шиншиллы максимальной концентрация каталазы была в почках. В печени, селезёнке и лёгких данного вида отмечены близкие по уровню значения активности. У песцов по сравнению с лисами в печени, почках и селезёнке отмечена более низкая активность каталазы. Наиболее активна каталаза в печени нутрий и енотовидных собак. Каталаза очень важна в механизме поддержания кислородного гомеостаза у водных и полуводных млекопетающих. Активность каталазы в одном и том же органе значительно различается даже у таксономически близких видов млекопитающих и определяется прежде всего спецификой их экологии и, очевидно, связана в основном с адаптацией животных к гипо- или гипероксии.
В медицинской практике повышение уровня каталазы в крови служит диагностическим признаком различных заболеваний. Например, многие авторы указывают на повышение активности сывороточной каталазы при панк-риатитах, при переломах длинных трубчатых костей (разрушение эритроцитов, излившихся в гематому и поступление эритроцитарной каталазы в сосу-дное русло). Отчётливым снижением активности каталазы сопровождается гипоксия (хронические- лёгочные заболевания, лейкозы, ревматоидный артрит и т.д.). В тоже время острая пневмония и обострение хронических заболеваний лёгких сопровождаются повышением активности фермента в эритроцитах. Обнаружено повышение активности каталазы мочи у больных с бактериурией, лейкоцитоурией и гематурией, при вирусном гепатите [45].
Некоторые исследователи [82, 83, 119] изучали активность ферментов, в том числе каталазы, в мышечной ткани. Уровень фермента по их данным зависит от многих факторов, таких как вид, возраст и пол животного, условия содержания и кормления, степень обескровливания и некоторые другие.
О разнокачественности каталаз различного происхождения можно судить по различию в энергии активации этих ферментов [52]:
Каталаза эритроцитов 1700 кал;
Каталаза печени 600 кал;
Каталаза бактерий 1410 кал.
Для определения свежести и доброкачественности мясного сырья наибольшее значение имеет микробная каталаза, содержание которой определяется количеством бактериальных клеток и в целом в несколько раз превосходит (в количественном отношении) содержание животного фермента [37].
Одной из наиболее характерных черт микроорганизмов является наличие интенсивного темпа жизненных процессов: дыхание, рост, размножение, все виды обмена веществ в их клетках протекают несравненно быстрее, чем у высших растений или животных. Возможность столь интенсивного обмена веществ обуславливается чрезвычайно малыми размерами бактериальных клеток, огромной величиной суммарной поверхности, относительной простотой их строения, но в первую очередь наличием у них соответствующего ферментного аппарата. Ферментный аппарат бактериальной клетки является основой всей ее жизнедеятельности [7, 51]. Ферментные системы микроорганизмов обладают рядом особенностей. Во-первых, необычайное богатство ассортимента ферментов, вырабатываемое микробной клеткой. Во-вторых, следует отметить чрезвычайно высокую активность ферментных систем микроорганизмов. В этом отношении животные клетки не могут конкурировать с ними. Важнейшими специфическими особенностями микроорганизмов и, следовательно, их ферментных систем, можно считать и исключительную интенсивность действия. Однако при этом в различных типах клеток наборы ферментов имеют много общего, так как в них зачастую протекают близкие (или даже одинаковые) обменные процессы [23, 51].
Разработка метода RID А АТФ для определения санитарно-гигиенического состояния мясоперерабатывающих предприятий
Максимальное соблюдение ветеринарно-санитарных и гигиенических правил будет обеспечивать не только повышение качества мяса и производимых из него мясопродуктов, но и ограничивать контаминацию патогенными микроорганизмами, опасными для человека. Поэтому так важно своевременно выявлять степень чистоты оборудования после мойки и дезинфекции экспресс-методами.
Применяемый метод определения КМАФАнМ в смыве с поверхности определяет только микроорганизмы, к существенному недостатку относиться длительность получения результатов (48-72 ч).
В настоящее время согласно программе ХАССП [125] необходимо применять инструментальные методы контроля чистоты производства. Наиболее перспективным является биолюминесцентный метод, основанный на измерении концентрации аденозин-5ч-трифосфата (АТФ) в анализируемом образце при помощи люциферин-люциферазной системы светляков. Смыв с поверхности оборудования исследуется на суммарную АТФ, как на индикатор потенциальной среды для разведения бактерий и порчи продукции.
Аденозин 5л-трифосфат (АТФ) - один из ключевых внутриклеточных метаболитов, присутствующий в относительно больших количествах во всех живых микробных клетках и быстро разрушающийся при их гибели. Так как содержание АТФ в живых клетках практически постоянно, уровень АТФ в образце соответствует числу живых бактерий. Этот принцип был положен в основу биолюминесцентного индикаторного метода обнаружения микробных клеток в различных объектах.
Как уже упоминалось в литературном обзоре, помимо бактериального существует ещё АТФ, содержащийся в соматических клетках и свободный АТФ. В 1939 г. В.А.Энгельгардт и М.Н.Любимова установили, что миозин обладает ферментативной активностью, катализируя гидролитический распад АТФ на аденозин дифосфорную и фосфорную кислоты [81]:
АТФ + Миозин + Н20 -» АДФ + Н3Р04 + Миозин
После убоя животного в мышечной ткани под воздействием ферментов органические фосфаты распадаются, поэтому уменьшается их содержание и увеличивается количество более простых азотистых продуктов и неорганического фосфата. Мышечная ткань имеет небольшие запасы АТФ, которые быстро расходуются. Реакции гликолиза (гликогенолиза) и клеточного дыхания приводят к восстановлению запаса АТФ в мышечной ткани. После убоя животного в мышечной ткани резко уменьшается количество АТФ. Вскоре она исчезает совсем [43]. Охлаждение и замораживание мяса удлиняет период распада АТФ [61]. Таким образом, фрагменты мышечной ткани, кровь имеют определённое количество АТФ.
Апробированный нами в условиях мясоперерабатывающих предприятий метод определяет как АТФ бактериального происхождения, так и АТФ мясных фрагментов, элементов крови и других контаминантов, загрязняющих поверхность оборудования, т.е. суммарную АТФ.
Любое количество АТФ выше фонового уровня, независимо от источника происхождения (бактерии, плесени, дрожжи, пищевые частицы, кровь), будет указывать на загрязнение поверхностей оборудования, на которых изготовляются мясные продукты.
Согласно действующим инструкциям, после проведения санитарной обработки на мясоперерабатывающем предприятии проводят визуальный, химический и микробиологический контроль качества проведённой работы. Критерием удовлетворительного состояния оборудования является отсутствие видимых загрязнений на поверхности трудноочищаемых узлов оборудования. Не реже 1 раза в неделю после санитарной обработки проводят бактериологический контроль санитарной обработки технологического оборудования и инвентаря. Смывы для контроля КМАФАнМ (КОЕ/см2) оборудования берут стерильным тампоном с поверхности 10x10 см по принятой методике. Результаты учитывают через 2-3 дня. После санитарной обработки общее микробное число не должно превышать 1000 клеток на 1 см2.
Микробные клетки без своевременного и полного удаления с поверхностей технологического оборудования и его обвязки, емкостей, стен, пола помещений и т.д. достаточно быстро образуют биопленку («biofilm»). Такие микробные сообщества найдены, например, на поверхностях водных резервуаров (танков), труб, хирургических приборов, емкостей по переработке продовольствия, и т.д., где бактерии держатся стойко, сопротивляясь удалению, мойке и действию обычных дезинфицирующих средств, которые не могут проникать через полисахаридную мембрану клеточных стенок бактерий [91, 135, 144]. Всё это ведёт, в конечном счёте, не только к загрязнению конечных мясных продуктов, но и вызывает биокоррозию оборудования. Поэтому столь важен контроль чистоты различных поверхностей технологического процесса в мясной промышленности.
Предел обнаружения АТФ зависит от способа подготовки образца. Под действием экстрагента, распыляемого на поверхность исследуемого объекта, входящего в набор RidaATO, происходит разрушение клеточных мембран и АТФ выходит наружу. Наряду с этим происходит разрушение не только ферментативной системы, синтезирующей АТФ, но и системы, гидролизующей АТФ. При этом концентрация АТФ остаётся постоянной и равной той концентрации АТФ, которая была в клетке в момент её гибели [72]. Следует отметить, как преимущество, что экстракция АТФ заканчивается уже через несколько секунд.
После распыления экстрагирующего раствора поверхность протиралась стерильным сухим тампоном. Эта технология характеризуется высокой эффективностью сбора АТФ с исследуемой поверхности. К достоинствам этого способа следует отнести и то, что, поскольку кюветы с жидкими реагентами не используются, отсутствует угроза разлива реагентов в случае поломки кювет. Сухой метод сбора АТФ с поверхности также значительно снижает стоимость исследований более чем на 40%. Кроме того, сухой тампон действительно работает лучше, обеспечивая более быструю и эффективную абсорбцию как свободной, так и высвобожденной АТФ с поверхности (10 см ), чем "увлажненный" тампон.
Биолюминесцентная реакция начинается при контакте тампона с внутренней поверхностью кюветы-пробирки, на которую нанесён тонкоплёночный реагент (люциферин-люцифераза). Тонкий стержень тампона облегчает его вращение в кювете-пробирке, тем самым гарантируя высокую эффективность перемешивания реагентов.
На последней стадии исследования детекторную пробирку помещали в люминометр, в котором измеряли интенсивность люминесценции, возникающей в результате взаимодействия пленочных реагентов в детекторной пробирке с АТФ, собранной с исследуемой поверхности.
Эта технология обеспечивает высокую точность измерения, поскольку потери АТФ полностью исключены. Специальная конструкция оптического датчика люминометра обеспечивает сбор и регистрацию люминесценции, испускаемой пробиркой во все стороны, таким образом исключая занижение результата вследствие неравномерного распределения АТФ на тампоне.
Время анализа - всего 2 минуты. В результате измерений получают данные как сумму небактериального и бактериального АТФ в относительных световых единицах (RLU). Суммарный результат исследований выводится в численном виде и может нормироваться по фону как «чисто», «условно чисто» или «грязно».
На первом этапе мы провели исследование различных объектов, поверхность которых загрязняли искусственно в лабораторных условиях, нанося смешанную культуру микроорганизмов мяса, фрагменты мышечной ткани и других загрязнений.
Использовали следующие тест-объекты: плитка глазурованная, плитка метлахская, внутренняя поверхность кастрюли из нержавеющей стали, разделочная доска из полиуретана тефлоновая, внутренняя поверхность чашки Петри. К поверхности прикладывали куски мышечной ткани различной степени порчи (с наличием следов ослизнення, присутствия фекальных загрязнений и т.д.) и растирали их для получения слоя видимого загрязнения. Оставляли высыхать на 1-2 часа. Затем проводили измерение уровня АТФ. После этого проводили цикл либо мойки с помощью щетки, либо мойки и дезинфекции, тщательно ополаскивали водой. После высыхания проводили повторный замер уровня АТФ для определения качества проведенных санитарных мероприятий. Полученные данные представлены в таблице 3.
Как видно из полученных данных определённому количеству МАФАнМ соответствует определённый уровень АТФ. В процессе санитарных мероприятий наблюдается снижение обоих показателей. Следует отметить, что при использовании только мойки с использованием щетки на поверхности тест - объектов мы не наблюдали следов видимых загрязнений. В то же время при проведении тестов на качество ветеринарно - санитарных мероприятий (количество МАФАнМ и уровень АТФ) обнаруживали наличие микрофлоры на исследуемых поверхностях. По действующим правилам качество мойки оценивалось, как «чисто». Но, как уже указывалось выше, наличие даже остаточной микрофлоры может привести к последующей порче продукции из мяса. При проведении мойки в сочетании с дезинфекцией препаратом «Септабик» фирмы «Абик» (Израиль) в 0,1 %-ной концентрации (экспозиция 10 мин) наблюдали отличную очистку поверхностей. Эти предварительные опыты показали, что метод 1ШаАТФ эффективно определяет степень чистоты поверхностей. Также данным методом можно быстро определить качество дезинфекции, оценить действие того или иного дезинфицирующего средства при его выборе для использования на предприятии.
Разработка метода определения количества каталазы в мясе и мясопродуктах по скорости распада определённого количества Н202
В 1950 г Ф.С.Околов [56] предположил, что активность каталазы может быть изучена не только по количеству распавшейся перекиси водорода, но также и по скорости распада определённого её количества. Этот принцип мы решили проверить и положили его в основу предлагаемой ниже каталазной пробы.
Перекись водорода, как известно, подвергается воздействию двух ферментов: каталазы и пероксидазы. Из них каталаза разлагает Н202 на О и Н20, а пероксидаза с помощью образующегося кислорода дегидрирует вещества типа фенолов. Если в экстракт мяса, содержащий каталазу, внести небольшое количество перекиси водорода и затем оставить смесь стоять на различные отрезки времени, то в том случае, когда каталазы в экстракте будет много, перекись разрушится и исчезнет быстро. Если каталазы мало, то наоборот, её удаётся найти в течение длительного срока.
Чтобы обнаружить присутствие остаточной перекиси водорода, надо добавить растворы пероксидазы и реактива для её выявления, например, бензидина. Жидкость посинеет при присутствии перекиси. В тот момент, когда каталаза разрушит всю перекись водорода, внесение пероксидазы и бензидина не даст феномена окисления, жидкость не посинеет.
Пероксидазные окислительные системы наиболее распространены в растительном мире. Тем не менее, и у животных были найдены различные пероксидазы (например: лактопероксидаза в молоке; пероксидазная функция гемоглобина; пероксидаза печени, окисляющая триптофан; пероксидаза лейкоцитов крови). У микроорганизмов фермент пероксидаза найден только в дрожжах и у некоторых групп бактерий (например, Acetobacter suboxydans) [52]. Таким образом, незначительное фоновое содержание пероксидазы не окажет существенного влияния на значение количества определяемого фермента каталазы данным методом. К тому же пероксидазная активность самой каталазы очень мала.
Наша дальнейшая работа была направлена на отработку условий, необходимых для определения активности каталазы в мясе.
При оптимизации условий обработки мясного сока мы подбирали:
- объём и концентрацию исходного экстракта из мяса.
- кислоту и её концентрацию для остановки реакции; - количество пероксидазы;
- красители для выявления пероксидазы;
- время учёта реакции.
.С помощью механического пресса из образцов исследуемых проб мяса мы получали мясной сок, который разводили физиологическим раствором в 10 раз и использовали для определения свежести мяса по уровню активности в нём фермента катал азы.
На первом этапе исследований мы использовали чистый мясной сок. Оказалось что, при перемешивании ОД мл чистого мясного сока с перекисью водорода, образовывался столбик стойкой пены. Это вело к тому, что при дальнейшем добавлении реактивов они плохо перемешивались, не достигали дна пробирки и учёт реакции был часто невозможен. К тому же учёт в малом объёме затруднителен для визуального учёта. Мы увеличили объём исследуемого образца до 0,5 мл. Это приводило к образование ещё более плотного и высокого столбика пены. Тогда мы стали использовать различные разведения экстракта мяса в физиологическом растворе. Использовали разведения в 2, 5 и 10 раз. Нами установлено, что 1 мл десятичного разведения экстракта мяса достаточно для удобной работы. При этом достигается равномерное перемешивание всех реактивов и легкий учёт результатов изменения цвета при визуальном наблюдении, образование пены незначительно, лишь на поверхности.
На следующем этапе работы мы подбирали кислоту и её концентрацию.
К 1 мл десятичного разведения мясного экстракта мы добавляли заведомый избыток перекиси водорода. Она под влиянием фермента каталазы начинает распадаться с выделением свободного кислорода. Для остановки этой реакции обычно используют серную кислоту. Помимо неё мы применяли в наших исследованиях и другие кислоты: фосфорную и уксусную Мы использовали концентрации кислот от 1 до 10%. В наших экспериментах наилучшие результаты были получены с уксусной кислотой.
При её использовании в 1% концентрации, после прибавления реактива на пероксидазу, цвет смеси был намного более ярким, чем при применении серной или фосфорной кислот в 10% концентрации.
Остаток непрореагировавшей перекиси водорода определяли с помощью фермента пероксидазы. В нашей работе мы использовали коммерческие препараты пероксидазы хрена (КФ 1.11.12.7) промышленного производства: Reanal, Венгрия и ПХ НПО «БИОЛАР», Россия. Для стабильности фермента его раствор готовили на сульфате аммония. Это позволяет хранить фермент без потери его активности в течение длительного времени при 4-8С. Мы в работе использовали хранящуюся в таком виде пероксидазу в течение 1 месяца.
Применение пероксидазы той или иной фирмы-производителя никак не отражалось на результатах нашего метода, поскольку, беря исходный препарат разной начальной активности, мы делали перерасчёт на необходимую нам в работе активность фермента (10 Ед. на 1 мл).
Для выявления активности самой пероксидазы существует огромное количество различных реактивов. Мы использовали доступные, самые распространённые в практике научных исследований. Для работы использовали следующие реактивы: бензидин, о-фенилендиамин, 4-аминоантипирин, фенол, а также медицинский препарат - азопирам. Использовались концентрации согласно стандартным методикам приготовления реактивов на пероксидазу, как описано в главе материалы и методы. При выборе учитывали следующие показатели: цвет смеси после добавления реактива на пероксидазу, контрастность с исходным цветом раствора, время проявления окрашивания, стойкость окрашивания. Для этого добавляли их после введения фермента пероксидазы в объеме 0,1 мл. Полученные данные представлены в таблице 7.
Наиболее известный препарат для выявления пероксидазы - это бензидин. В случае наличия перекиси водорода появляется синее окрашивание разной интенсивности. Наши исследования показали, что образующийся окрашенный комплекс не стабилен, окраска довольно быстро исчезала. Добавление больших объёмов бензидина не исправило ситуацию. Мы отказались от этого варианта. К тому же бензидин относиться к группе сильных аллергенов.
Азопирам - это медицинский препарат, используемый для проверки качества мойки шприцов, оборудования и т.п. Его использование не ответило нашим целям, так как помимо выявления пероксидаз растительного происхождения, как оказалось, азопирам выявляет также наличие гемоглобина, реагирует на присутствие следов сильных окислителей (хлорамина, хлорной извести, хромовой смеси для обработки посуды, стирального порошка с отбеливателем и др.), а также ржавчины и кислот. Полученные при его использовании данные были противоречивы.
Фенол и 4-аминоантипирин в присутствии пероксидазы соединяются с перекисью водорода, образуя хинонимин красного цвета. Так как реактив содержат фенол, при этом требуется избегать контакта с кожей и слизистыми оболочками. При добавлении данной смеси получалось стойкое малиновое окрашивание. Но такой же цвет смеси получался при исключении фенола и использовании только 4-аминоантипирина. В то же время при добавлении только фенола данные были противоречивы.
Наилучшие результаты получили при добавлении о-фенилендиамина. Яркое, контрастное соломенно-оранжевое окрашивание проявлялось сразу и не исчезало со временем.
Как запасной вариант приемлемо окрашивание 4-аминоантипирином. Хоть при этом и образуется менее стойкий окрашенный в малиновый цвет комплекс, времени для учёта реакции вполне хватает.
Поэтому, для окончательного выбора мы в методику включили два реактива на пероксидазу: 4-аминоантипирин и офенилендиамин. Всё зависит от наличия данных реактивов в лаборатории, в продаже. На крайний случай можно применить и бензидин.
Следующим этапом нашей работы стало определение временных параметров учета результатов реакции для образцов мяса с различной степенью свежести. Для этого мы брали образцы свежего мяса и искусственно подвергали их порче при (+4С) в течение нескольких дней. Ежедневно проводились исследования одновременно несколькими методами: органолептическим, определение КМАФАнМ и каталазным. Для каталазной пробы исследования проводили в течение часа через каждые 1-5 минуты. Полученные данные представлены в таблице 8.
Из данных таблицы видно, что для определения степени свежести мяса достаточно 30-40 мин. Причем были исследованы две совершенно разные пробы, с разными нормами качества свежести по СанПиНу. При ухудшении качества мяса временные критерии уже 30 мин. Проанализировав данную таблицу, нами выбраны следующие временные контрольные точки для исследований - через: 1 (тотчас - контроль), 3, 5, 10, 15, 20, 30 мин.
Таким образом, в целом предлагаемая схема анализа состоит из нескольких этапов, как представлено на рисунке 3.
Похожие диссертации на Ускоренные методы оценки бактериальной контаминации мяса и поверхностей технологического оборудования
