Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Распространение аскосфероза и экономический ущерб, причиняемый им пчеловодству 7
2.2. Характеристика возбудителя заболевания и эпизоотологические данные по аскосферозу 8
2.3. Патогенез, клинические признаки и диагностика заболевания 16
2.4. Средства и способы борьбы с аскосферозом пчел 19
2.5. Дезинфицирующие свойства озона и его действие на различные виды и формы микрофлоры 32
3. Материалы и методы исследований 38
3.1. Методика выделения возбудителя аскосфероза пчел и изучение его морфологических свойств 39
3.2. Изучение адгезии и колонизации спор A. apis на поверхности и внутри личинок пчел 40
3.3. Методика определения фунгицидной активности изучаемых препаратов 40
3.4. Испытание токсичности противоаскосферозных препаратов для пчел 41
3.5. Определение остатков нистатина и тимола в меде 43
3.6. Методы дезинфекции ульев и пчеловодного инвентаря при аскосферозе 43
4. Результаты исследований 45
4.1. Изучение морфологии возбудителя аскосфероза пчел 45
4.2. Изучение неспецифической адгезии спор гриба A. apis 51
4.2.1. Изучение адгезии спор A. apis на поверхности здоровых личинок пчел 51
4.2.2. Изучение развития гриба A. apis в кишечнике личинок пчел 52
4.2.3. Влияние на адгезивную способность спор A. apis рН среды и температуры 54
4.3. Изучение фунги статической активности испытуемых препаратов.. 56
4.3.1. Изучение фунгистатической активности испытуемых препаратов в лабораторных условиях 56
4.3.2. Изучение эффективности препарата аскостат при аскосферозе пчел в условиях пасеки 61
4.4. Влияние препарата аскостат на репродуктивную способность пчелиных маток 66
4.5. Влияние аскостата на биохимические показатели пчел 71
4.5.1. Определение гемолимфоформулы пчел 71
4.5.2. Определение степени развития жирового тела по Маурицио... 73
4.5.3. Определение общего количества липидов в гемолимфе 75
4.5.4. Определение содержания глюкозы в гемолимфе 76
4.6. Токсичность препарата аскостат для пчел и теплокровных животных 78
4.6.1. Токсичность препарата аскостат для пчел 78
4.6.2. Токсичность препарата аскостат для теплокровных животных.79
4.6.2.1. Токсичность при пероральном и внутрибрюшинном введении препарата 79
4.6.2.2. Действие аскостата на слизистые оболочки глаз 84
4.6.2.3. Кожно-резорбтивное действие препарата 84
4.6.2.4. Аллергенное действие препарата 85
4.7. Изучение динамики накопления нистатина и тимола в продуктах пчеловодства 88
4.8. Изыскание средства для дезинфекции объектов пчеловодства при аскосферозе пчел 92
4.8.1. Озонаторы и техника озонирования 93
4.8.2. Дезинфекция объектов пчеловодства газообразным озоном 96
4.8.3. Дезинфекция объектов пчеловодства водной смесью озона и уксусной кислоты 99
4.9. Сравнительная оценка эффективности озона 101
4.10. Опыты по дезинфекции озоном объектов пчеловодства в полупроизводственных условиях 104
5. Обсуждение результатов исследований 107
6. Выводы 115
7. Практические предложения 116
8. Список использованной литературы 117
- Характеристика возбудителя заболевания и эпизоотологические данные по аскосферозу
- Изучение адгезии и колонизации спор A. apis на поверхности и внутри личинок пчел
- Изучение неспецифической адгезии спор гриба A. apis
- Влияние препарата аскостат на репродуктивную способность пчелиных маток
Введение к работе
Для ветеринарной микологии особое значение приобретают вопросы экологии, связанные с воздействием на популяцию грибов таких абиотических факторов, как дезинфицирующие средства, высокая температура, а также остатки ветеринарных препаратов, радионуклидов и других химических веществ, загрязняющих внешнюю среду вследствие антропогенного действия или катастроф. Эти факторы могут оказывать определенное воздействие на популяцию грибов, влиять на их изменчивость. Понимание механизма устойчивости грибной популяции во внешней среде тесно связано со знанием природы ее адаптации и специализации. Современная наука об экологии грибов дает определение адаптации как совокупности морфофизиологических, поведенческих, популяционных и других особенностей данного вида, обеспечивающих возможность специфического образа жизни в определенных условиях внешней среды (Клочко и др., 1998).
Распространение гриба A. apis связано с изменением условий внешней среды, что привело к широкому распространению такого заболевания как аскосфероз пчел.
Аскосфероз - инфекционная болезнь (микоз) открытого и печатного расплода пчел, вызываемая грибом Ascosphaera apis. Болезнь возникла на фоне резкого иммунодефицита, вызванного экологическими и экономическими факторами.
К экологическим факторам относятся выраженное повышение радиационного фона, загрязнение окружающей среды и неправильное применение лечебных препаратов.
К экономическим факторам относятся сокращение затрат на содержание пчел, нарушение правил кормления и ветеринарно-профилактических мероприятий, бесконтрольный ввоз и вывоз маток и пакетов пчел. Все эти факторы явились причиной распространения данного заболевания. Иммунодефицит, наблюдающийся в последние годы у пчел, приводит к широкому распространению заболеваний, ранее встречавшихся в единичных случаях, в частности, аскосфероза. За последние годы аскосфе-роз широко распространился на пасеках многих континентов. Гриб Ascosphaera apis устойчив во внешней среде и к воздействию различных дезинфектантов, поэтому многие из существующих лечебно-профилактических средств при аскосферозе недостаточно эффективны.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлось изыскание новых экологически безопасных средств борьбы с аскосферозом пчел.
В задачи исследований входило:
• Изучить некоторые биологические особенности возбудителя аскосфероза пчел.
• Провести научные изыскания лечебных средств, эффективных при аскосферозе.
• Изыскать средства и режимы дезинфекции ульев и пчеловодного инвентаря, эффективных при этом заболевании.
Научная новизна. Установлено, что споры гриба Ascosphaera apis прикрепляются (адгезируют) на поверхности и в кишечнике личинок пчел, прорастают и дают начало микроколониям. Изучена зависимость адгезии спор Ascosphaera apis от рН среды и температуры.
Определена фунгицидная активность в лабораторных и эффективность применения препарата аскостат при аскосферозе пчел в пасечных условиях, изучены влияние препарата аскостат на пчел и теплокровных животных, а также динамика накопления действующих веществ аскостата (нистатин и тимол) в меде обрабатываемых семей пчел.
Изучена эффективность применения озона для дезинфекции объектов пчеловодства.
Практическая ценность.
В результате проведенных исследований разработаны: - наставление по применению препарата аскостат для борьбы с аско-сферозом и аспергиллезом пчел (в соавторстве);
- технические условия на опытную партию препарата аскостат;
- технология применения озона для дезинфекции объектов пчеловодства.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены:
- на совещании ветврачей в Республиканской ветеринарной лаборатории (Косино, 2001);
- на первой специализированной выставке "Пчела и человек - 2001" на ВВЦ; на выставке "Интермёд-2001" в выставочном комплексе
"Экспострой на Нахимовском";
- на второй специализированной выставке "Пчела и человек - 2002" на ВВЦ;
- на межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (20.05.2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 печатные работы. Проведенные исследования и полученные результаты позволяют вынести на защиту следующие основные положения диссертационной работы:
• некоторые биологические особенности возбудителя аскосфероза пчел;
• эффективность применения препарата аскостат при аскосферозе пчел;
• токсикологическая характеристика препарата аскостат;
• технология применения озона для дезинфекции ульев и пчеловодного инвентаря при аскосферозе пчел.
Характеристика возбудителя заболевания и эпизоотологические данные по аскосферозу
В 1955 году Olive и Spiltoir отнесли гриб к роду Ascosphaera. С этого момента возбудитель аскосфероза получил название Ascosphaera apis Maassen ex Claussen, Olive et Spiltoir (1955) (Курасова, Костин, Малиновская, 1971). По последним сообщениям (Eriksson и Hawksworth, 1985), возбудитель данного заболевания относится к классу Plectomycetes и отряду Ascosphaerales. На сегодня систематическое положение гриба следующее (Eriksson и Hawksworth, 1985): Царство - Fungi тип - Ascomycota класс - Plectomycetes (сумчатые) подкласс - Hemiascomycetes (голосумчатые) отряд - Ascosphaerales семейство - Ascosphaeriaceae род - Ascosphaera вид - Ascosphaera apis Гифы мицелия (грибница) гриба - разветвленные, септированные, бесцветные, многоядерные клетки. Гриб гетероталличный, раздельнополый, то есть имеется дифференциация мицелиев по половому признаку: мужской или женский. При встрече двух разнородных в половом отношении мицелиев на их гифах формируются многоядерные половые структуры, так называемые гаметангии, не дифференцированные на гаметы (половые клетки). Каждый из гаметангиев отделяется от гиф перегородкой. Женский и мужской гаметангии резко различаются по величине: мужской меньше, он переливает свое содержимое (ядра и протоплазму) в более крупный (женский). После слияния содержимого гаметангиев происходит кариогамия (слияние ядер), за этим следует множественное деление копу-ляционных ядер и в нутриоците, являющемся главной, быстро растущей питательной частью женского гаметангия, вокруг образовавшихся ядер происходит формирование большого числа спор, склеенных в компактные массы - споровые шары, которых иногда называют асками, или сумками.
Зрелый нутриоцит со споровыми шарами, имеющий вид темно коричневой, оливково-коричневой, с возрастом чернеющей, капсулы сферической формы, называется цистой, или спороцистой (Гробов, Смирнов, Попов, 1987; Смирнов и др., 1988; Горбунова, Клюшникова, Комарницкий и др., 1967; Мюллер, Леффлер, 1995; May, 1993; Rath, 1985). Установлено, что в цикле развития гриба образуются аски, содержащие восемь аскоспор (Спесивцева, цит. по Spiltoir, 1964). Морфометрические признаки гриба Ascosphaera apis. Данные по морфометрическим признакам гриба A. apis различаются. W.P. Stephen, J.D. Vandenberg, B.L. Fichter (1981) указывают размер споровых шаров в пределах 7,0-19,4 мкм в диаметре, размер спор 2,0-3,8x1,0-2,3 мкм; на внутренней поверхности стенки цисты имеются многочисленные сосочки, наружная поверхность гладкая. J.P. Scou (1972) приводит другие цифры: размер споровых шаров 7,0-18,0 мкм, в среднем 12,5 мкм; одноклеточные прозрачные аскоспоры с липкой поверхностью имеют размеры 1,5-1,9x3,0-3,5 мкм по Prokschl, 1,9x3,2 мкм по Spiltoir and Olive (1955). Отношение длины к ширине равно 1,9. М. Christensen, М. Gilliam (1983) обнаружили размеры спор в пределах 2,6-3,5x1,4-1,8 мкм, диаметр спороцист до 120 мкм, в среднем 80,2 мкм. По сообщению К. Turi, Cs. Doboliy, Е. Szalai и Zs. Szel (2000), существует два вида гриба рода Ascosphaera: Ascosphaera apis и Ascosphaera major, которые дифференцируются по следующим признакам: 1. орнаментации споровых цист (однообразная пунктуация у A. apis и сглаженная у A. major); 2. диаметру споровых цист (A. apis до 120 мкм, в среднем 80,2 мкм; A. major до 250 мкм, в среднем 128,5 мкм); 3. размеру спор и отношению их длины к ширине (большинство спор Ascosphaera apis имеют размеры 2,6-3,5x1,4-1,8 мкм, соотношение дли-на.тиирина равно 1,9; размеры спор Ascosphaera major 3-4x1-1,5 мкм, соотношение длина/ширина равно 2,6). Оптимальной средой для роста мицелия гриба и накопления мицели-альной массы является картофельно-декстрозный агар (КДА) с 0,4% дрожжевого экстракта. Для изучения спороношения целесообразно использовать сусловый агар. Среда Сабуро малопригодна для изучения гриба (Жуков, 1997). А по данным О.Ф. Гробова и А.К. Лихотина (1989), для культивирования гриба наиболее приемлемы сусло-агар, картофельно-глюкозный агар и среда Сабуро. Как утверждают К. Turi, С. Doboliy, Е. Szalai и Z. Szel (2000), картофельный агар как питательная среда позволяет более надежно и эффективно определить наличие гриба, чем Сабуро-глюкозный агар. По J.P. Scou (1972), Ascosphaera apis хорошо растет на солодовом экстракт-агаре, медленнее на картофельно-декстрозном и мучном агарах. L. Bailey и B.L. Ball (1991) утверждают, что A. apis можно культивировать на КДА с добавлением 0,4% экстракта дрожжей и на солодовом агаре с 0,52% солода. Строго вегетативный рост с воздушными гифами и отсутствием плодовых тел встречается на картофельной среде; сусло-агар найден лучшим для микроскопических работ, т.к. воздушные гифы практически отсутствуют.
Изучение адгезии и колонизации спор A. apis на поверхности и внутри личинок пчел
В ходе изучения потенциальных фунгицидов принимали во внимание физико-химические свойства и степень изученности каждого из них, включая биологическую активность, характер действия на пчел и на тепло кровных животных, стабильность при хранении, токсичность и другие показатели.
Определение фунгицидной активности препаратов в лабораторных условиях проводили на основе общепринятого метода дисков. С этой целью в стерильные чашки Петри, расположенные на горизонтальной поверхности, наливали питательную среду и подсушивали в течение 30 минут при 37С. На поверхность застывшего агара пинцетом раскладывали диски из фильтровальной бумаги диаметром 10 мм. Затем на диски наносили с помощью микропипетки по 0,02 мл раствора испытуемых концентраций и суспензию спор с плотностью 200 тыс. в 1 мл. Суспензию готовили из 5-7-суточной культуры A. apis в стерильном физиологическом растворе и доводили разведение спор до нужной концентрации. В качестве контроля использовали диски, пропитанные водой. Чашки инкубировали в термостате при температуре 30С в течение 10 суток, учитывая при этом концентрацию препарата, ингибирующую рост мицелия возбудителя аскосфероза пчел. Оценку фунгистатической активности препарата проводили по величине диаметра колоний гриба в опыте по сравнению с контролем.
Изучение токсичности препаратов для пчел проводили методами скармливания и топикального нанесения. Пчел содержали в энтомологических садках в термостате при температуре н-30С.
При скармливании растворов изучаемых препаратов в сахарном сиропе каждая пчела получала по 0,02 мл смеси, затем пчелы естественным путем перераспределяли между собой смесь таким образом, что каждая получила примерно равную дозу. После поедания опытной смеси пчелам давали чистый сахарный сироп в неограниченном количестве.
При топикальном нанесении обработки проводили из расчета 0,1, 1, 10 и 100 мкг испытуемого вещества на пчелу однократно. Каждую дозу испытывали на 30 пчелах.
Препараты, наименее токсичные для пчел и с выраженным фунги-цидным действием, в дальнейшем испытывали на пораженных аскосферо-зом пчелиных семьях, подобранных по принципу аналогов.
Пасечные испытания препаратов проводили в весенне-летний период. Семьи пчел обрабатывали препаратами путем их скармливания в 50%-ном сахарном сиропе пчелам и опрыскивания рамок с пчелами водными растворами из мелкодисперсного распылителя.
До и после обработки ульев исследуемыми препаратами обращали внимание на состояние расплода и взрослых пчел. Особое внимание уделяли пчелиному и трутневому расплоду, учитывая возраст личинок, их форму, консистенцию и цвет. Для облегчения подсчета пораженных личинок в соторамках и количества печатного расплода использовали рамки-сетки с размерами квадратов 5x5 см, вмещающих по 100 пчелиных ячеек. Степень поражения расплода (слабую, среднюю, сильную) определяли с учетом числа погибших личинок в соторамках, на поддоне и на предлет-ковой площадке. В ходе пасечных испытаний ежедневно проводили отбор проб расплода по 5-7 личинок из опытных и контрольных семей пчел для лабораторного исследования на аскосфероз. После обработки семей испытываемыми препаратами вели наблюдение за общим состоянием семей, их работоспособностью и репродуктивной активностью пчелиных маток. Здесь же отрабатывали режимы обработок: оптимальные дозы препаратов на курс лечения, на однократную обработку семьи, кратность обработок, длительность интервалов между ними, продолжительность курса лечения, наиболее благоприятные условия - сезон года, время суток и другие факторы.
Изучение неспецифической адгезии спор гриба A. apis
Изучение адгезии и колонизации спор A. apis на поверхности личинок пчел проводили следующим образом. Личинок осторожно извлекали из сотов, брюшные сегменты освобождали от внутреннего содержимого и промывали в фосфатном буфере. Затем в стерильные бюксы со споровой суспензией гриба (200 тыс. спор/мл) помещали брюшные сегменты личинок и выдерживали от 120 минут до нескольких часов при комнатной температуре. По истечении экспозиции для фиксации адгезированных на поверхности личинок спор образцы обрабатывали 25%-ным глутаровым альдегидом на физиологическом растворе. После фиксации альдегидом сегменты брюшка личинки тщательно промывали фосфатным буфером, затем проводили обезвоживание спиртами возрастающей концентрации (30% - 50% - 70% - 96% - 100%), в каждом по 30 минут. Затем сегменты личинок просматривали в световом микроскопе.
При изучении в световом микроскопе процесса адгезии спор A. apis на поверхности личинок пчел было обнаружено, что спустя 12 часов после нанесения спор гриба начинается их колонизация на поверхности кутикулы. На поверхности личинок пчел, искусственно контаминированных спо рами A. apis, был обнаружен растущий мицелий гриба. Это позволяет предположить, что в естественных условиях возникновение заболевания может происходить и при попадании спор на поверхность личинок пчел. Полученные нами данные согласуются с результатами опытов, описанными Z.GHnski в 1981 г.
Для изучения динамики развития гриба A. apis в средней кишке личинок пчел были экспериментально подобраны дозы заражения личинок пчел спорами возбудителя аскосфероза. Доза заражения составила от 2,5 до 4 млн спор на одну гнездовую рамку с расплодом. Заражение производили путем опрыскивания рамок суспензией спор гриба в сахарном сиропе. Контролем служили личинки, взятые из здоровых семей пчел.
В результате проведенных исследований путем ежедневного наблюдения за состоянием кишечника личинок из опытных рамок было установлено, что попадание спор возбудителя аскосфероза в кишечник личинок пчел происходит на 3-4 день после начала опрыскивания пчел сиропом со спорами гриба.
Для установления изменений, происходящих в средней кишке личинок пчел при заражении их спорами гриба, проводили изучение развития возбудителя в кишечнике с помощью световой микроскопии. Для этого из личинок извлекали среднюю кишку, помещали в фиксирующий раствор (2%-ный глутаровый альдегид на фосфатном буфере) и оставляли при +6С на одни сутки. На следующий день участки средней кишки промывали буферным раствором нейтральной реакции и проводили дополнительную фиксацию тем же глутаровым альдегидом. Затем осуществляли обезвоживание в восходящих концентрациях этилового спирта: спирт 30%-ный в течение 2-х часов, спирт 50%-ный в течение 2-х часов, спирт 70%-ный в течение суток.
После последней обработки производили измельчение образцов. Затем с помощью световой микроскопии (х400) отбирали здоровые и пораженные участки средней кишки личинок пчел. После отбора образцов проводили дальнейшее их обезвоживание в 95%-ном спирте (трехкратно по 15 минут). Готовые образцы размером от 1 до 2 мм наносили на предметные стекла и просматривали в световом микроскопе.
В опытных препаратах после попадания спор гриба в кишечник личинок через 2-3 часа нами была обнаружена адгезия (прилипание) и колонизация единичных спор A. apis на поверхности слизистой средней кишки личинок пчел. Видимого повреждения слизистой в этот период отмечено не было. Спустя восемь часов после этого начинался процесс поражения эпителиальных клеток слизистой оболочки кишечника и интенсивное развитие гриба. Через 72 часа после заражения было обнаружено разрушение ворсинок кишечника и проникновение мицелия A. apis в полость тела личинки. Далее происходило разрастание мицелия возбудителя аскосфероза по всему телу личинки.
В контрольных препаратах от здоровых личинок пчел была хорошо видна неповрежденная структура ворсинок слизистой оболочки средней кишки.
Таким образом, изучение развития аскосферозного процесса в средней кишке личинок пчел с помощью световой микроскопии позволило нам проследить за динамикой развития аскосферозной инфекции в организме личинок и обнаружить, что после попадания спор A. apis в кишечник личинок происходит прилипание (адгезия) спор A. apis к слизистой оболочке средней кишки. Затем начинается процесс поражения эпителиальных клеток кишечника и интенсивное развитие гриба.
Влияние препарата аскостат на репродуктивную способность пчелиных маток
После обработки пчелиных семей изучаемым препаратом аскостат наблюдали его влияние на жизнедеятельность пчел, учитывая такие показатели, как: репродуктивные свойства пчелиных маток, гигиеническое поведение пчел и наличие подмора на дне ульев. С этой целью были сформированы 3 группы семей пчел, две из которых были опытными, которым с канди скармливали аскостат, и одна -контрольная, пчелы получали чистое канди (таблица 8). Наблюдение за репродуктивной активностью пчелиных маток по количеству печатного расплода после обработки пчел препаратом аскостат проводили помощью рамки-сетки (с размерами квадратов 5x5 см, вмещающих по 100 пчелиных ячеек). В таблице 8 указано количество печатного расплода на рамку. Оценивали также общее состояние семей и их работоспособность (путем сравнения среднего числа пчел, вылетающих из летка за 10 минут). Все эти наблюдения вели до и после проведения опыта. С этой целью были сформированы 7 групп пчелиных семей, в том числе одна контрольная. Первые измерения проводили через 12 дней (период созревания запечатанного расплода) после обработок пчел аскостатом. При этом определяли силу семей пчел (в улочках), общее количество печатного расплода в семье и общее количество меда. Полученные результаты приведены в таблице 7 и диаграмме 5. В диаграмме 5 изложены средние результаты таблицы 7. Гибели взрослых пчел, личинок и пчелиных маток не было отмечено ни в одной из опытных семей (таблица 8). Как показали результаты опытов, при применении препарата аско-стат происходит увеличение количества печатного расплода в опытных группах пчел (на 37%), что можно объяснить лечебным действием нистатина и стимулирующим действием тимола (таблица 7, диаграмма 5). После применения аскостата сила пчелосемей увеличилась на 22,8, а количество меда в пчелиных семьях повысилось на 8%.В процессе проведения испытаний в опытных группах пчел было отмечено активное удаление пораженных личинок из гнезд пчел. Таким образом, обработка пчел аскостатом не приводит к снижению репродуктивной активности пчелиных маток у опытных групп пчелиных семей в сравнении с контрольной группой.
В ходе проведенных исследований не было отмечено существенного различия в репродуктивной активности пчелиных маток в опытных и контрольных группах пчелиных семей. Случаев гибели пчел, пчелиных маток, личинок и куколок в опытных семьях выявлено не было. Одновременно с проведением лечебных обработок пчелиных семей препаратом аскостат был реализован комплекс ветеринарно-санитарных и организационных мероприятий согласно п.п. 4.7.1.-4.7.5. "Инструкции по дезинфекции, дезакаризации, дезинсекции и дератизации на пасеках" утв. ГУВ МСХ СССР от 5.06.1982. 4.5. Влияние аскостата на биохимические показатели пчел. Одновременно проводили изучение влияния препарата аскостат на биохимические показатели гемолимфы пчел. При проведении биохимических исследований было использовано девять групп пчел по 200 особей в каждой группе. При этом шесть групп являлись контрольными и три -опытными в каждом конкретном случае. При этом были исследованы следующие показатели: - гемолимфоформула пчел (по методу Гробова); - степень развития жирового тела пчел (по методу Маурицио); - общее количество липидов в гемолимфе пчел (по методу Свана). - содержание глюкозы в гемолимфе пчел (по методу Шомоньи Нильсона); Для исследований были использованы пчелы из семей, обработанных препаратом аскостат согласно наставлению по его применению. Всего в четырех сериях опытов из 20 ульев было исследовано 700 пчел. Для получения средних данных по группе пчел использовали обычные методы вариационной статистики. Результаты исследований приведены в таблицах 9 и 10. При отборе пчел для исследования учитывали: силу семьи, кормо-обеспеченность, благополучие в отношении заразных болезней и сезон года. Для получения более достоверных данных были использованы пчелы одного возраста. Гемолимфу получали путем отсасывания из синуса в об ласти четвертого тергита брюшка с помощью тонкого стеклянного капилляра. Перед этим пчел умерщвляли парами эфира и выдерживали в течение 10 мин в горячей воде при температуре 60С для обеспечения более интенсивной окраски мазков. Взятую гемолимфу наносили на предметное стекло; с помощью шлифованного стекла делали мазок размером с 10-копеечную монету. Для приготовления одного мазка использовали гемолимфу одной пчелы. Мазки высушивали в течение 24 часов, после чего фиксировали в метаноле 30 мин. Окраску производили по методу Рома-новского-Гимза. Окрашенные мазки просматривали под микроскопом, используя иммерсионный объектив. Гемоцитарную формулу определяли по общепринятой методике выведения лейкоформулы у животных, с использованием классификации клеточных элементов. Для удобства сравнения гемолимфоформул больных и здоровых пчел мы использовали возрастной коэффициент гемолимфы (ВКГ), представляющий собой отношение числа старых клеток к числу зрелых и молодых (Гробов, 1967)
