Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1. Морфологическая характеристика и физиологические особенности гриба A. apis 10
1.2. Эпизоотическая ситуация по заболеванию аскосферозом медоносной пчелы 15
1.3. Действие физико - химических факторов на возбудителя аскосфероза пчел 19
Собственные исследования 38
2. Материал и методы 38
2.1. Штаммы микроорганизмов, питательные среды, взрослые пчелы, расплод, мед 38
2.2. Выделение возбудителя аскосфероза пчел и изучение его культуралыю-морфологических свойств 39
2.3. Первичный отбор и изучение фунгицидных свойств препаратов из различных классов химических соединений 40
2.4. Изучение физико-химических свойств композиции препарата йодохлорин с йодтриэтиленгликолем 42
2.5. Изучение токсичности композиции препарата йодохлорин с йодтриэтиленгликолем 43
2.6. Изучение лечебно-профилактических свойств препарата йодохлорин и его композиции с йодтриэтиленгликолем при аскосферозе пчел 47
2.7. Изучение дезинфицирующих и санирующих свойств препарата йодохлорин и его композиции с йодтриэтиленгликолем при аскосферозе пчел в лабораторных и производственных условиях 48
2.8. Электронно-микроскопическое исследование ультраструктуры гриба A. apis под воздействием препарата йодохлорин и его композиции с йодтриэтиленгликолем 51
2.9. Ветеринарно-санитарная экспертиза меда, полученного от пчел, подвергнутых обработке композицией препарата йодохлорин с йодтриэтиленгликолем 53
2.10. Статистическая обработка результатов исследования 55
3. Результаты исследований 57
3.1. Эпизоотическая ситуация по аскосферозу пчел 57
Изучение культурально-морфологических свойств изолятов A. apis, выделенных из неблагополучных пасек 59
Первичный отбор и изучение фунгицидных свойств препаратов из различных классов химических соединений 60
Физико-химическая характеристика композиции йодохлорина с йодтриэтиленгликолем 67
Результат исследования токсических свойств композиции йодохлорина с йодтриэтиленгликолем 72
Результаты исследования лечебно-профилактического действия препарата иодохлорин при аскосферозе пчел 80
Результаты изучения дезинфицирующих и санирующих свойств препарата иодохлорин и его композиции с йодтриэтиленгликолем при аскосферозе пчел в лабораторных и производственных условиях 81
Результаты электронно-микроскопического изучения ультраструктуры спор гриба A. apis под воздействием препарата иодохлорин и его композиции с йодтриэтиленгликолем 88
Результаты ветеринарно-санитарной экспертизы меда, 3.9. полученного от пчел, подвергнутых обработке композицией
препарата иодохлорин с йодтриэтиленгликолем 95
Обсуждение результатов исследования 97
Выводы 108
Практические предложения 109
Список литературы
- Эпизоотическая ситуация по заболеванию аскосферозом медоносной пчелы
- Выделение возбудителя аскосфероза пчел и изучение его культуралыю-морфологических свойств
- Изучение дезинфицирующих и санирующих свойств препарата йодохлорин и его композиции с йодтриэтиленгликолем при аскосферозе пчел в лабораторных и производственных условиях
- Физико-химическая характеристика композиции йодохлорина с йодтриэтиленгликолем
Введение к работе
Актуальность темы. Пчеловодство, являясь одной из рентабельных отраслей сельского хозяйства, обеспечивает получение ценнейших продуктов питания и способствует в регионах с интенсивным развитием повышению урожайности многих, так называемых, энтомофильных сельскохозяйственных культур. Кроме того, в результате опыления насекомыми сельскохозяйственных культур улучшаются посевные качества семян и товарные качество плодов [106].
Медоносная пчела подвержены различным заболеваниям, ущерб от которых, зачастую, может быть очень велик, поэтому успешное развитие пчеловодства не представляется возможным без глубокого и всестороннего изучения патологии медоносной пчелы.
В последние годы гибель пчел и снижение продуктивности в результате инфекционных заболеваний продолжают возрастать, что связано с высокой концентрацией семей пчел [5], массовыми передвижениями (кочевки) пасек, обменом племенной продукцией как внутри одной страны, так и в международном масштабе. Трудности изолирования пчел на местности способствуют широкому распространению возбудителей инфекционных болезней других видов насекомых, которые могут передаваться и медоносным пчелам [73, 98]. В связи с интенсификацией исследований в этой области, появились новые данные и установлены новые нозологические единицы, которые требуют пересмотра имеющихся знаний по тем или иным болезням.
Важную роль в распространении заболеваний играют биологические особенности поведения пчел, перелеты пчел, слеты роев, нападение на более слабые семьи [31]. Определенную роль при этом играют и экологические факторы - повышение радиационного фона, загрязнение окружающей среды и неквалифицированное применение лечебных препаратов [9]. Предрасполагающими факторами в развитии многих заболеваний являются резкие колебания температуры и повышенная влажность воздуха, нарушение вентиляции улья и высокое содержание СОг [53].
Кроме того, за последние годы наблюдается снижение иммунного статуса пчел в связи с резким ухудшением экологической ситуации, нарушением правил содержания и разведения, применением малоэффективных терапевтических средств [29, 110].
К числу наиболее опасных инфекционных заболеваний пчел, причины возникновения которых напрямую связаны с несоблюдением норм содержания, неполноценным кормлением, недостаточной эффективностыо ветеринарно-санитарных мероприятий, относятся микозы (аскосфероз, аспергиллез и др.). Эпизоотическое состояние по микозам как за рубежом, так и в нашей стране остается напряженным, особенно широкое распространение получил аскосфероз пчел или известковый расплод [59, 89, 136, 137].
Профилактика инфекционных и инвазионных болезней пчел и борьба с ними как у нас, так и в других странах, в основном, строилась на применении химиотерапевтических препаратов или перегоне пораженных семей на новые местности или в новые ульи. Эти меры без уничтожения самого возбудителя во внешней среде не могут привести к оздоровлению пасек, а только снижают заболеваемость, вызывая скрытое течение заболеваний, а также приводят к накоплению антибиотиков, сульфаниламидных препаратов в продуктах пчеловодства, что создает определенную опасность для здоровья людей.
Исходя из этого, важным этапом противоэпизоотичеких мероприятий является дезинфекция и санация, эффективность которых зависит от того, насколько полно и своевременно будут обеззаражены все инфицированные объекты на неблагополучной пасеке, что обуславливает разрыв эпизоотической цепи в звене передачи возбудителя инфекционного процесса. Для профилактики и лечения аскосфероза в последние годы многими исследователями предложен целый ряд достаточно активных фунгицидных препаратов [10, 21, 20, 25, 30, 31, 34, 37, 42, 44, 48, 59, 96, 107, 117, 132]. Однако как показала практика, применение большинства из них имеет ряд существенных недостатков, а именно, не учитываются особенности патогенеза заболевания и жизненного цикла пчел, а также сроки и режимы проведения обработок. К тому же токсичность самих соединений и продуктов их распада, а так же коррозионная активность в использовании многих из предложенных препаратов не позволяет применять их непосредственно в пчелиных семьях в присутствии пчел и расплода, что особенно важно при проведении вынужденной дезинфекции при возникновении заболевания.
В связи с этим актуальным представляется вопрос изыскания эффективных средств борьбы с болезнями пчел грибковой этиологии, в том числе и при аскосферозе пчел.
Исходя из вышеизложенного, целью данной работы явилось изыскание средств санации и дезинфекции при аскосферозе медоносной пчелы.
Для выполнения цели исследования были выдвинуты следующие задачи:
1.Провести мониторинг эпизоотической ситуации по аскосферозу пчел в отдельных регионах России;
2.Провести скрининг химических соединений из различных классов и изучить фунгицидные свойства эффективных препаратов и их композиций в отношении гриба Ascosphaera apis;
3.Изучить ультраструктуру спор гриба Ascosphaera apis и её изменения при воздействии отобранных перспективных препаратов;
4.Изучить токсичность эффективных препаратов и их композиций на организм теплокровных животных и медоносной пчелы;
5.Изучить дезинфицирующие, санирующие и лечебно-профилактические свойства эффективных препаратов и их композиций при аскосферозе пчел в лабораторных и производственных условиях.
Научная новизна работы. Отобраны новые, функционально замещенные аммониевые соединения, обладающие фунгицидной и фунгистатической активностью, в частности при аскосферозе и аспергиллезе пчел (Патент на изобретение РФ № 2220957 от 10 января 2004 г.). Впервые изучена активность препарата йодохлорин в отношении возбудителя аскосфероза, а также создана композиция на основе препаратов йодохлорин и йодтриэтиленгликоль, обладающая высокой фунгицидной активностью в отношении возбудителя аскосфероза пчел. Токсикологическими исследованиями установлена безвредность композиции в отношении организма медоносной пчелы.
Практическая ценность работы. Разработаны состав и режимы применения препарата йодохлорин и композиции препарата йодохлорин с йодтриэтиленгликолем в качестве лечебно-профилактических дезинфицирующих и санирующих средств при аскосферозе пчел.
Методика проведения производственных испытаний по оценке дезинфицирующих санирующих и лечебно-профилактических свойств йодохлорина и композиции на его основе при аскосферозе, аспергиллезе и гнильцовых заболеваниях пчел утверждена начальником Управления ветеринарии Республики Марий Эл.
Временное наставление по применению препарата йодохлорин с йодтриэтиленгликолем в качестве дезинфицирующего, санирующего и лечебно-профилактического средства при аскосферозе пчел утверждено директором ВНИВИ 28.10.04.
Препарат йодохлорин и композиция препаратов йодохлорин и йодтриэтиленгликоль внедрены на пасеках республик Марий Эл и Мордовия.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы изложены и одобрены на научных сессиях ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань) по итогам НИР за 2003-2005гг., на международной научно-производственной конференции по актуальным проблемам
Агропромышленного комплекса (г. Казань), 2003 г.; на международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных», Владимир, 2004.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
На защиту выносятся следующие положения:
1.Мониторинг эпизоотической ситуации по аскосферозу пчел в отдельных регионах России;
2.Скрининг химических соединений из различных классов и изучение фунгицидных свойств эффективных препаратов и их композиций в отношении гриба Ascosphaera apis;
3.Ультраструктура спор гриба Ascosphaera apis и её изменения при воздействии отобранных перспективных препаратов;
4.Токсичность йодтриэтиленгликоля и композиции препарата йодохлорин с йодтриэтиленгликолем на организм теплокровных животных и медоносной пчелы;
5. Дезинфицирующие, санирующие и лечебно-профилактические свойства йодтриэтиленгликоля и композиции препаратов йодохлорин и йодтриэтиленгликоль при аскосферозе в лабораторных и производственных условиях.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах компьютерного набора, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Работа содержит 13 таблиц, 20 рисунков. Список литературы включает 243 источника, из' них 105 иностранных.
Эпизоотическая ситуация по заболеванию аскосферозом медоносной пчелы
Развитие пчеловодства имеет большое значение, так как кроме обеспечения ценнейшими продуктами питания людей, промышленность сырьем пчелы играют важную роль как опылители сельскохозяйственных культур.
Эффективность пчеловодства как отрасли существенно сдерживается различными факторами, такими как - нарушения правил содержания, несоблюдения ветеринарно-санитарных норм на пасеках, бесконтрольное использование антимикробных препаратов, заболевания и отравления пчел. Большой экономический ущерб современному пчеловодству наносят инфекционные и инвазионные заболевания взрослых пчел и расплода. Особенно широкое распространение в последние годы получили микозы -в частности аспергиллез и аскосфероз пчел [42, 117]. Так, по данным некоторых авторов [31, 6] число особей в пчелиных семьях при аскосферозе снижается в среднем на 23%, а при острой форме заболевания отмечается гибель расплода до 30%, а способность же их к медосбору уменьшается на 49% [42]. По данным других авторов [2] продуктивность пчелиных семей снижается на 50-60%. Заражение пчел аскосферозом влияет на жизнеспособность и физиологическое состояние развивающихся пчел, долгота жизни которых снижается в два раза [40]. При возникновении болезни поражение расплода может достигнуть 25-30% и быстро распространиться по всей пасеке. При этом может погибнуть до 60-65%, а при сильном поражении, до 80% [211] личинок расплода, если заболевание возникло в середине пчеловодного сезона [171, 235]. На стационарно неблагополучных пасеках степень поражения расплода составляет свыше 50% [ 58, 113].
В течение последних 20 лет аскосфероз получил широкое распространение на пасеках ряда стран [117], хотя ранее вспышки заболевания расплода медоносных пчел аскосферозом относительно часто регистрировали в Европе, включая Британские острова, в течение многих лет [139, 140, 147, 148, 149, 150, 158, 160, 165, 193, 192, 197, 243, 198, 207, 233]. По сообщениям Carrera Р. [156] скорость распространения известкового расплода за последние пять лет вызывает большую тревогу у пчеловодов Италии, a Lahitte J. [191] отмечает, что во Франции более 80%) от всех грибковых заболеваний приходится на аскосфероз. О массовой вспышке известкового расплода пчел в Израиле сообщается в работе Yakobson В., Elad D. [242].
В Болгарии, в южной ее части, в 1988 году была зафиксирована внезапная вспышка аскосфероза, охватившая до 70%) пчелиных семей со степенью поражения расплода 20-45% [35].
Увеличение ареала данного заболевания вызывает серьезные опасения пчеловодов Словакии [116]. По сообщению Heath L. [183] аскосфероз был зарегистрирован в Швейцарии, Польше, Франции, СССР,
Чехословакии, Греции, Норвегии, Англии, Шотландии и продолжает наблюдаться тенденция к дальнейшему его распространению.
По сообщениям Kordos L. [189] перицистоз (аскосфероз) вызывает большие экономические и трудовые затраты в Венгрии. Canadieja J. [155], Sulimanovic D. [230, 231], Томац И. [128] отмечают широкое распространение аскосфероза в Югославии.
В Чешской республике аскосфероз не относят в группу опасных заразных болезней пчел, тем не менее многие исследователи отмечают, что пораженность пчелиных семей в среднем достигает до 11,1-45,2% за последние двадцать лет [79].
В Латвии по данным Стафецкого Р. [121] перицистоз медоносной пчелы за последние 5 лет (1990-1994 гг.) был выделен у 54 исследованных пчелосемей, а аспергиллез всего в 2 случаях (1992 и 1994 гг.) у 5 пчелосемей. Seal D. [224] сообщил о появлении случаев заболевания аскосферозом в Новой Зеландии. Furuya К. [164] и Takatori К.-, Tanaka I. [234] обнаружили аскосфероз в Японии. Сейчас же аскосфероз является серьезной проблемой японского пчеловодства, получив, практически, повсеместное распространение, он рассматривается, по опасности, на одном уровне с варроатозом и нозематозом [http://www.honeybee.org.au]. Rossi С, Carranza М. [217] зарегистрировали первый случай аскосфероза в Аргентине.
Постепенно известковый расплод пчел завоевывает новые ареалы, на сегодняшний день известны случаи аскосфероза также и в Азии, включая страны Среднего Востока и страны к востоку индийского полуострова [196].
В Соединенных Штатах Америки первые случаи перицистомикозов (аскосфероза) были зарегистрированы в 1968 г. Baker G., Torchio Р. [144], затем, Thomas G., Luce А. [238] обнаружили возбудителя известкового расплода в Калифорнии, а к 1974 году данное заболевание получило широкое распространение и было зарегистрировано практически во всех штатах, где было развито пчеловодство [159]. Так, например, в отчёте министерства сельского хозяйства штата Северная Каролина за 2003 год указывается, что за подотчётный период период в штате было зафиксировано 314 новых случаев аскосфероза [http://www.ncagr.com].
Gochnauer Т. [176] сообщил о первом случае аскосфероза в Канаде в провинции Британская Колумбия, а через четыре года, к 1976 году известковый расплод регистрировался уже в 33 штатах США и 6 провинциях Канады. В середине восьмидесятых заболевание весьма широко отмечалось в Новой Зеландии и Японии [166, 184, 185, 202, 228, 239,241].
Выделение возбудителя аскосфероза пчел и изучение его культуралыю-морфологических свойств
Культуру A. apis выделяли из материалов, полученных с неблагополучных по грибковым заболеваниям пасек. Материалом служили трупы личинок и куколок, участки сот размером 10x10 см, с погибшими мумифицированными личинками.
Для микроскопии пчел и личинки помещали в чашки Петри и просматривали под микроскопом при малом увеличении с целью обнаружения на поверхности их тела гифов гриба органов спороношения, спороцист и мицелия.
Для выделения культуры возбудителя соскобы с тел погибших личинок и куколок переносили в чашки Петри на среду Сабуро и сусло-агар. При выделении грибов из кишечника поверхность хитинового покрова пчел обрабатывали 70%-ным спиртом, промывали стерильной дистиллированной водой, после чего с помощью глазного пинцета и ножниц извлекали кишечник и распределяли его по поверхности среды. Посевы культивировали в термостате при температуре 35С и наблюдали за ними в течение 14 суток.
С целью получения чистой культуры проводили дополнительный пересев с периферии колоний, характерных для данного вида гриба. Параллельно дифференцировали чистую культуру исследуемого гриба от возбудителей аспергиллеза и других микозов пчел. Для подавления сопутствующей вульгарной микрофлоры перед посевом в питательную среду, расплавленную на водяной бане и охлажденную до 50С, добавляли антибиотики (пенициллин - 50 ЕД и стрептомицин - 100 тыс. ЕД на 1 л среды).
Первичный отбор препаратов из различных классов химических соединений и композиций на их основе проводили с использованием штамма возбудителя известкового расплода (аскосфероза) пчел A. apis. Фунгицидные свойства препаратов изучали общепринятыми методами [94], используя при этом концентрации веществ от 0,125 до 2%, при экспозиции 5-120 минут. Препарат йодохлорин готовили путем электрохимической активации водных растворов йодида калия и хлорида
натрия в концентрациях 0,3 масс% и 0,9 масс% соответственно. Композицию иодохлорина с иодтриэтиленгликолем готовили путем простого химического смешивания в соотношениях иодохлорина: 99,8; 99,7; 99,5 масс% и йодтриэтиленгликоля 0,2; 0,3; 0,5 % соответственно. Композицию исследовали в нативном виде. С этой целью взвесь спор с концентрацией 200 000 микробных тел в 0,1 мл добавляли в раствор композиции из расчета 1:10.
При изучении фунгицидности синтезированных препаратов в каждое разведение добавляли заранее приготовленную взвесь спор с концентрацией 200000 микробных тел в 1 мл из расчета 1:1. Контролем служила аналогичная взвесь спор с физиологическим раствором. По истечении срока экспозиции (5-120 минут) проводили нейтрализацию общепринятыми методами [97] с последующим трехкратным центрифугированием проб при 3-6 тыс. об/мин в течение 30 мин, затем производили посев на среду Сабуро и сусло-агар, и инкубировали на них в термостате при температуре 30-35С. Учет результатов проводили в течение 5-14 суток. В дальнейшем, фунгицидные свойства препаратов, отобранных при первичном отборе, были всесторонне изучены с применением метода батистовых тестов [28, 94]. Батистовые тесты размером 5x10 мм погружали на 20 минут в заранее приготовленную суспензию спор гриба A. apis с плотностью 200000 кл/мл на двадцать минут. Затем в асептических условиях тесты подсушивали фильтровальной бумагой, после чего для дополнительной фиксации выдерживали в термостате при температуре 37С в течение 20 минут. Контаминированные таким образом тесты погружали в растворы отобранных ранее препаратов и композиций; экспозиция при этом составляла от 5 до 120 минут. Контролем служили тесты, помещенные в стерильную дистиллированную воду. По истечении срока экспозиции тесты извлекали и отмывали путем трехкратного кратного центрифугирования в физиологическом растворе, затем делали посевы на среды Сабуро, сусло-агар и инкубировали в термостате при температуре 30-35С.
Учет результатов проводили ежедневно в течение 14 суток; при этом отмечали наличие или отсутствие признаков роста культуры возбудителя аскосфероза. Окончательный вывод о фунгицидности испытуемого вещества делали после обобщения результатов трех повторных опытов.
Электроактивацию солевых растворов проводили в электрохимическом двухкамерном активаторе при силе тока 15-20А, напряжении 20-30 вольт, используя выпрямители электрического тока ВСА-5К в течение 15 минут.
Химические исследования включали определение элементного йода, активного хлора и суммы галогенов, а также определение концентрации водородных ионов в композиции.
Определение элементного йода проводили с использованием методик [1, 8], основанных на реакции тиосульфата натрия с йодом. При расчете суммы галогенов и содержания активного хлора использовались формулы [3, 135].
Изучение дезинфицирующих и санирующих свойств препарата йодохлорин и его композиции с йодтриэтиленгликолем при аскосферозе пчел в лабораторных и производственных условиях
Испытания лечебно-профилактических свойств композиции йодохлорина с йодтриэтиленгликолем проводили на пчелосемьях, подобранных по принципу аналогов, в идентичных условиях содержания. При этом учитывали силу семей и степень пораженности их аскосферозом. С этой целью на пасеке сформировали 4 группы (по 5 семей в каждой группе) пчелосемей - 3 опытных (инфицированных аскосферозом) и 1 контрольную не инфицированную аскосферозом. Семьи были помещены в чистые, продезинфицированные композицией йодохлорина с йодтриэтиленгликолем, ульи. Обработку пчелосемей осуществляли в безвзяточный период путем скармливания лечебного сиропа в указанных концентрациях, а также путем опрыскивания соторамок с пчелами при помощи мелко-дисперсного распылителя «Росинка».
Каждой группе опытных семей скармливали лечебный сахарный сироп со следующими соотношениями препаратов и корма 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, что составляло 20, 25, 30 и 50% содержания препарата в корме. Сахарный сироп с препаратом задавали из расчета 50 мл на каждую улочку пчел три раза с интервалом в 5 суток до полного забора пчелами корма. Контрольные семьи получали сахарный сироп без препарата.
Обработку соторамок опытных семей проводили композицией из расчета 10-15 мл на рамку, заполненную пчелами. Излишки композиции использовали для опрыскивания внутренних поверхностей улья.
Контрольные семьи обрабатывались стерильной водой. Опрыскивание соторамок проводили трехкратно с интервалом пять суток.
В течение эксперимента регулярно проводили осмотр опытных и контрольных групп семей на наличие клинических признаков заболевания путем подсчета пораженных личинок и печатного расплода в соторамках при помощи рамки-сетки, а также отбирали пробы расплода для микологических исследований на аскосфероз, по результатам которых оценивали эффективность препарата в зависимости от концентраций и формы применения.
Исследование дезинфицирующих и санирующих свойств композиции йодохлорина с йодтриэтиленгликолем проводили в лабораторных и производственных условиях на пасеках республик Мордовия и Марий Эл, неблагополучных по аскосферозу общепринятыми методами [105], а также согласно «Методике проведения производственных испытаний по оценке санирующих и лечебно-профилактических свойств йодохлорина и композиций на его основе при аскосферозе, аспергиллезе и гнильцовых заболеваниях пчел, утвержденной начальником РГУ Управления ветеринарии Республики Марий Эл».
В качестве тест-объектов в условиях лаборатории использовали тест -поверхности размером 10x10 см из материалов, применяемых в пчеловодстве для изготовления инвентаря и оборудования (дерево, нержавеющая сталь и оцинкованное железо), а также соты.
Для заражения тест-объектов использовали свежеприготовленную взвесь A. apis, содержащую 200000 спор в 1 мл. С этой целью из 10-14 суточной культуры A. apis на среде сусло - агар, давшей обильное спороношение, делали смывы стерильным физиологическим раствором и центрифугировали при 1-1,5 тыс. об/мин в течение 30 минут.
Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспензировали стерильным физиологическим раствором до получения 200000 спор в 1 мл взвеси по оптическому стандарту мутности.
Полученной суспензией инфицировали тест-объекты. Взвесь на тест -объекты из дерева наносили в смеси с «биологической защитой», состоящей из прополиса, воска и фекалий пчел, из расчета 2 мл на каждый тест-объект; металлических - из меда, смеси фекалий пчел, воска и прополиса. Тест-объекты из сот инфицировали, внося по одной капле взвеси в ячейку без «биологической защиты».
Затем инфицированные тест-объекты подсушивали в течение 30 минут, после чего наносили рабочие растворы препаратов. По истечении срока экспозиции (10, 15, 30 и 60 мин) проводили нейтрализацию общепринятыми методами [97]. Тест-объекты контрольной группы подвергали обработке стерильным физиологическим раствором в тех же условиях.
После экспозиции и нейтрализации с тест-объектов путем смыва и соскоба брали пробы, которые центрифугировали при 3 тыс. об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливали, а осадок высевали на среды сусло-агар и Сабуро и культивировали в термостате при температуре 30-35 С в течение 14 суток.
Качество проведенной дезинфекции оценивали по наличию или отсутствию роста гриба на питательной среде. Достоверность эксперимента проверяли получением не менее трех совпадающих результатов в трех опытах.
Изучение дезинфицирующих и санирующих свойств композиции йодохлорина и йодтриэтиленгликоля в производственных условиях проводили на базе пасек республик Мордовия и Марий Эл.
В экспериментальных исследованиях в условиях пасек использовали ульи и соторамки от пораженных аскосферозом пчелиных семей, с которых предварительно были выделены споры A. apis, а также был использован инвентарь, изготовленный из нержавеющей стали и оцинкованного железа, применёнными в работе с больными семьями.
Перед дезинфекцией внутренние поверхности ульев, бруски соторамок и металлический инвентарь механически очищали. После чего на внутренних стенках и дне ульев очерчивали квадраты ЮхЮ см, а на отдельных сотах, освобожденных от меда, перги, расплода и трупов личинок - квадраты размером 3x3 см.
Физико-химическая характеристика композиции йодохлорина с йодтриэтиленгликолем
Пчеловодство ранее державшееся в основном на «плечах» общественного сектора и пчеловодов-энтузиастов, в настоящее время в нашей стране эта отрасль сельского хозяйства получила относительно более широкое развитие за счет частных предприятий, акционерных обществ и т.п. Однако развитие пчеловодства в значительной мере сдерживается высокими потерями от различных инфекционных и инвазионных заболеваний взрослых пчел и пчелиного расплода, а также затратами на их ликвидацию и профилактику.
Инфекционных агентов, поражающих взрослых пчел и их расплод, достаточно много и против многих из них еще не разработаны эффективные средства и методы борьбы. В последнее время в нашей стране широкое распространение получили микозы, такие как аскосфероз и аспергиллез, поражающие в основном расплод.
Источником инфекционного агента, в первую очередь, становится инфицированная пчелосемья, а механизм передачи в значительной степени связан с особенностями содержания насекомых. Чаще всего заражение происходит при пчелином воровстве, слетах и налетах пчел, так как объектом воровства становятся ослабленные и больные семьи, не способные противостоять атаке извне. Кроме того, распространению болезней способствуют хищники и паразиты. Не последнюю роль в передаче грибковых заболеваний играет и сам человек, нарушая ветеринарно-санитарные правила содержания пчелосемей, распространяя споры возбудителя с вощиной, пчеловодческим инвентарем, на одежде, при смене маток, во время кочевок и т.д. [19].
Относительно вопроса изучения аскосфероза пчел и, в частности, методов диагностики, условий выживаемости возбудителя, а также разработки средств и методов борьбы с ним в настоящее время уделено достаточно серьезное внимание, о чем свидетельствуют многочисленные работы отечественных и зарубежных исследователей [42, 45, 47, 52, 72, 169, 208]. Однако методы и подходы к решению проблемы аскосфероза у нас и за рубежом существенно отличаются. Так, большинство работ зарубежных авторов посвящены поиску фунгицидов, как правило, на основе антибиотиков. Например, начиная с 1974 года в США велись разработки фунгицида «Беномил» (Methyl(butylcarbamoyl)-2 benzimidazolecarbamate), но результаты себя не оправдали, препарат не был регламентирован для широкого применения в пчеловодстве, так как снижал продолжительность жизни пчел и обладал низкой фунгицидной активностью, а так же, предположительно, имел отрицательное влияние на организм теплокровных животных [http//www.beesource.com]. К тому же бесконтрольное и неправильное применение антибиотиков приводит к нарушению естественной бактериальной микрофлоры внутри пчелиной семьи, что ведет к повышению активности патогенной микрофлоры и микроскопических грибов, а также к снижению резистентности семьи в целом.
Снижение общей резистентности пчел [110] приводит к появлению устойчивых штаммов гриба A. apis. Развитию резистентности гриба способствует постоянное применение одного и того же препарата, что зачастую приводит лишь к временному исчезновению явных признаков заболевания. При этом концентрация возбудителя в семье снижается и болезнь переходит в скрытую форму течения, при которой появляются споры гриба, устойчивые к используемому препарату. При этом гриб начинает вновь размножаться и вызывает рецидивы болезни, но уже в более тяжелых формах. Чтобы этого избежать, необходимо проведение полного комплекса ветеринарно-санитарных и лечебных мероприятий, а также чередование эффективных препаратов на одной и той же пасеке.
Однако как показала практика, применение большинства из них имеет ряд существенных недостатков. а) не учитываются особенности патогенеза заболевания, а именно: препараты наносят на поверхности сотов, в ячейках которых находятся уже погибшие личинки. Для достижения действенного терапевтического эффекта препарат должен попадать в кишечник личинок так же, как и возбудитель с медом и пыльцой (пергой); б) слишком удлинен интервал между обработками (5-7 суток), что при минимальной фунгистатической концентрации препарата приводит к появлению резистентных штаммов гриба; в) трудоемкость обработок.
Перегон же пчелиных семей в обеззараженные ульи и на другие соты также не оправдан, так как он вызывает серьезный стресс, снижает резистентность пчелосемей и не всегда способствует выздоровлению.
Начиная с 1988 года за рубежом ведется разработка биологических методов борьбы с аскосферозом. В пищеварительном тракте взрослой медоносной пчелы обитают бактерии-антагонисты, способные в процессе жизнедеятельности вырабатывать метаболиты задерживающие и подавляющие рост A. apis. На сегодняшний день из кишечника медоносной пчелы выделено большое количество грамнегативных микроорганизмов - Klebsiella ps., E.coli ps. и др., однако, пока найден только один штамм, из выделенных бактерий, способный задерживать рост грибов [169, 227, 238; www.exorsect.com; www.beeweaver.com].
