Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Краткая характеристика парвовирусной инфекции свиней 13
1.2. Состояние иммунной системы животных при вирусных инфекциях 20
1.3. Современные подходы к профилактике и терапии вирусных болезней животных 29
1.4. Иммунокорригирущие препараты, используемые в ветеринарии 30
2. Собственные исследования и их результаты 44
2.1. Материал и методы исследования 44
2.2. Изучение влияния глутоксима на состояние иммунной системы супоросных свиноматок 51
2.3. Оценка влияния глутоксима на иммунную систему поросят, зараженных парвовирусом in vitro 61
2.4. Оценка влияния глутоксима на иммунную систему поросят, зараженных парвовирусом in vivo 67
2.5. Экономическая эффективность лечебных мероприятий 79
Заключение
Выводы 93
Практические предложения 94
Список литературы 95
- Состояние иммунной системы животных при вирусных инфекциях
- Иммунокорригирущие препараты, используемые в ветеринарии
- Изучение влияния глутоксима на состояние иммунной системы супоросных свиноматок
- Оценка влияния глутоксима на иммунную систему поросят, зараженных парвовирусом in vivo
Введение к работе
Актуальность темы. Неблагоприятная экологическая ситуация, которая сложилась на территориях многих промышленных центров России, в частности, на Южном Урале, оказывает весьма негативное влияние на состояние здоровья животных, способствует повышению уровня их заболеваемости и летальности. В значительной степени воздействие экологического прессинга реализуется через изменения функций иммунной системы. Развивающиеся при этом вторичные иммунодефицитные состояния, в свою очередь, обуславливают повышенную восприимчивость организма к вирусным и бактериальным инфекциям, развитие аллергических реакций, хронизацию воспалительных процессов (В.А.Черешнев с соавт., 1997).
Исследования последних лет свидетельствуют о широком распространении заболеваний, вызванные вирусами, к числу которых относится и парвовирусная инфекция свиней (В.А. Ананьев, 1982; Б.Г. Орлянкин, 1988; В.А. Сергеев, Б.Г. Орлянкин, 1983; А.А. Новых с соавт., 1996; СМ. Усов, 1998; P.Biront, Р. Bonte, 1983; I. Garner, 1983; W. L. Mengeling 1981 др.).
Применяемая специфическая профилактика не всегда предупреждает развитие вирусной инфекции, поскольку одним из ведущих звеньев патогенеза развития заболевания, является формирование состояния иммунодепрессии (В.М. Апатенко, 1992; В.В. Бурдейный, 1998; СМ. Усов, 1998; R. Н. Jonson 1979; W. L. Mencielino, 1981; P. S. Paul W. L. Menoeling, 1980 др.).
Вакцинопрофилактика при ряде болезней не всегда
достаточно эффективна по той причине, что поголовье животных после вакцинации не однородно по иммунному ответу. В стаде, всегда присутствуют особи с низкими титрами специфических антител (А.Х. Аракелян, 1996). Кроме того, сами вакцины в определенные фазы иммунизации способны подавлять сопротивляемость организма к инфекциям. Титры антител при вакцинации на фоне иммунодефицита часто не достигают необходимых значений, что требует увеличения дозы вводимого антигена (Е.Ф. Касьяненко, СИ, Михлина, 1992; A.M. Земсков с соавт., 1994, H.S. Joo, 1975 ).
С учетом этого ветеринарная иммунофармакология в последнее время привлекает все большее внимание специалистов различного профиля, поскольку без глубокого знания иммунных реакций в организме в ответ на тот или иной фактор невозможно адекватно раскрыть этиопатогенез болезни, точно провести индикацию возбудителя и обеспечить разработку и внедрение более совершенных методов и средств профилактики и лечения болезней животных. Поэтому тесты иммунологического анализа реально можно использовать для оценки выраженности воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды на состояние здоровья животных и для оценки эффективности действия лекарственных препаратов.
Такая ситуация требует применения иммунокорригирующих средств, способных повысить иммуногенность вакцин и снять формирующийся вакцинный стресс. В то же время Ихммуномодулирующие средства при вирусных инфекциях должны избирательно и специфически подавлять репродукцию вирусов и не
затрагивать процессов жизнедеятельности клеток и систем организма.
В настоящее время в ветеринарной практике для лечения вирусных инфекций - широко применяют различные иммуномодуляторы, иммуноглобулины и интерфероны (В .Г. Богуш, 1993; И.В. Волчек, 1998; Ф.Г. Гизатуллина и соавт., 1998; Ф.И. Ершов, 1996; М.В. Михайлова, 1999; Б.Г. Орлянкин и соавт., 1999; Н.Д. Придыбайло, 1991; B.C. Прудников, Ю.Т. Зелютков, 1999; W.K. Contrib 1984; Е. De Maeyer, 1988; A. L. Dunn 1998; С. A. Dinarello 1986; S. Harraga, 1994; A. Ahers, 1994; I. Fngel, 1994; M. Bakhiet, 1997; P. Colgan Sean et all 1994 и др.). Однако многие иммуномодуляторы в настоящее время остаются еще недостаточно изученными. К их числу относится синтетический иммуномодулятор, принадлежащий к классу лекарственных средств тиопоэтинов - глутоксим. В гуманитарной медицине препарат с успехом прошел широкие клинические испытания в комплексной терапии вирусных гепатитов В и С, для сопровождения химио- и радиотерапии в онкологии (В.Е. Жемчугов, А.Г. Румянцева, Л.А. Кожемякин, 2001 ).
Цель и задачи исследований. Целью работы являлось изучение влияния глутоксима на иммунную систему супоросных свиноматок и родившихся от них поросят, с подтвержденным диагнозом на парвовирусную инфекцию.
На разрешение были поставлены следующие задачи:
1. Изучить эпизоотическую обстановку в хозяйстве, провести клиническое обследование поголовья свиней и с помощью ИФА
уточнить диагноз на ПВС.
2. Оценить влияние глутоксима на общее состояние и
иммунную систему супоросных свиноматок с парвовируснои
инфекцией.
3. Определить действие глутоксима на
иммунокомпитентные клетки крови у инфицированных поросят in
. vitro.
4. Установить действие глутоксима на элиминацию вируса,
иммунную систему у инфицированных поросят in vivo, их
сохранность и продуктивность.
5. Рассчитать экономическую эффективность
терапевтического действия глутоксима у свиней с парвовируснои инфекцией.
Научная новизна. Впервые изучено влияние глутоксима на
состояние иммунокомпетентных клеток и активность гуморальных
факторов иммунитета у инфицированных супоросных свиноматок
и полученных от них просят. Выявлены ряд общих черт и различий
в действии глутоксима на клетки иммунной системы in vitro и in
vivo. Установлено, что глутоксим как in vitro, так и in vivo
вызывает снижение активности Тх и Тс, НСТ реакции нейтрофилов,
IgG, СН50 активности комплемента. В тоже время показано, что
.глутоксим in vitro обладает более выраженным влиянием на
иммуннокомпетентные клетки животных. Помимо
однонаправленных изменений системы иммунитета, отмечено и разнонаправленное влияние препарата на ЦИК и С1 - С5 компоненты комплемента.
На основе данных in vitro (активности Т звена иммунитета и метаболической активности нейтрофилов) разработаны подходы по назначению и оценке эффективности препарата in vivo.
Практическая значимость работы. Применение глутоксима свиньям с парвовирусной инфекцией способствует снижению выявляемое АГ вируса в крови, воспалительной реакции иммунной системы за счет снижения активности Тх, Тс, ЦИК, НСТ- реакции нейтрофилов и возрастания отдельных компонентов комплемента. Это позволяет существенно снизить вирусемию, летальность нарождающегося потомства и повысить его продуктивность.
Полученные данные могут быть использованы специалистами ветеринарных лабораторий для верификации диагноза на ПВС, оценки его лечебной эффективности, а также в учебном процессе при чтении лекций по фармакологии и эпизоотологии, написании монографий, справочников и учебных пособий.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Инкубация цельной крови с глутоксимом, полученной от
поросят с парвовирусной инфекцией вызывает изменения как
клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета,
проявляющихся снижением количества лейкоцитов, лимфоцитов, количества Тх, Тс, фагоцитоза, НСТ реакции нейтрофилов, В-лимфоцитов, СН50 - комплемента, при повышении числа эозинофилов, нейтрофилов, лизосомальной активности нейтрофилов, ЦИК, дисбалансом активности С1 —С5 фрагментов
*
комплемента.
2. Действие глутоксима in vivo проявляется элиминацией АГ
вируса из крови и изменениями параметров иммунной системы во
многом схожими с его действием in vitro, однако степень этих
изменений была менее выражена.
3. Механизм действия глутоксима связан с его
регулирующей ролью на редокс-систему клеток иммунитета,
наиболее значимым звеном которого является снижение активности
Т-клеток и метаболических функций нейтрофилов.
4. Глутоксим in vivo снижает инфицированность супоросных
свиноматок, летальность потомства, а при лечении поросят
увеличивает их выживаемость и продуктивность.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 14 Российской научной конференции «Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях» (Челябинск,2000); научной конференции, посвященной 20-летию ЦНИЛ ЧелГМА «Современные технологии в биологии и медицине» (Челябинск,2000); Межвузовской научно-практической и научно-методической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, животноводства, товароведения, обществознания и подготовки кадров на Южном Урале на рубеже веков (Троицк, 2002); на Международной научно-практической конференции «Новые энтеросорбенты и фармакологически активные вещества и их применение в ветеринарии и животноводстве», посвященной 80-летию Заслуженного деятеля науки РФ, доктора ветеринарных
наук, профессора Рабинович М.И. ( Троицк, 2002); на международной научно-практической конференции « Актуальные проблемы ветеринарной медицины», (Троицк, 2004 г), расширенном заседании кафедры фармакологии УГАВМ, ноябрь,2004 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять научных статей.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их результатов, заключения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы. Она изложена на 118 страницах, иллюстрирована 13 таблицами и 13 рисунками. Список литературы включает 183 источников, в том числе 58 иностранных авторов.
»
Состояние иммунной системы животных при вирусных инфекциях
Иммунная система - один из важнейших механизмов адаптации организма и мощный фактор, направленный на сохранение его антигенного гомеостаза (Р.В. Петров, 1982; Я.Э. Кенигсберг, 1985; В.П. Шишков,1985; Н.А. Радчук, с соавт., 1991; Д.В. Стефани, Ю.Е. Вельтищев, 1996; А.И. Коротяев, С.А.Бабичев, 1998; А.А. Ярилин, 1997, 1998; А. Ройт, 1991; J.H.L. Playfair, 1999, МВакМеі,1997идр.). Многие ученые отмечают важную роль иммунной системы в патогенезе многих болезней, поэтому оценка ее функциональной активности является актуальной задачей клинической иммунологии (Е.И. Соколов, 1998; Ю.Н. Федоров, О.А. Верховский, Д.М. Никулин, 1999; S.M. Levitz, 1994; N. Sakurai, 1994 и др.). В функциональном отношении иммунная система является самой динамичной системой организма, поскольку активность и кооперативные отношения различных звеньев иммунитета постоянно меняются с возрастом, подвержены суточным и сезонным колебаниям (В.Н. Шабалин, Л.Д. Серова, 1988; И.М. Донник, 1997). Основными клетками организма, определяющими работу иммунной систехмы, ЯВЛЯЮТСЯ лейкоциты во всем многообразии их популяций и субпопуляций (В.Н. Шабалин, Л.Д. Серова, 1988; Ю.Н. Федоров, О.А. Верховский, 1996; СВ. Jorgensen, J.S. Agtrholm etal., 1993).
Ключевыми клетками иммунной системы являются лимфоциты (М.Р. Сапин, 1999). Именно они выполняют функции нахождения, распознавания и уничтожения, попавших в организм или образовавшихся в нем генетически чужеродных агентов. Возможность выполнения этих функций происходит в связи с наличием на поверхности лимфоцитов антигенных рецепторов. Наличие рецепторов предполагает возможность для индивидуального лимфоцита отвечать на любой антиген, в котором представлены соответствующие антигенные детерминанты. Действие иммунных механизмов основано на реакциях двух типов: клеточного и гуморального. Это связано с наличием двух независимых популяций лимфоцитов: В-клеток, вырабатывающих антитела, и Т-клеток, осуществляющих реакции клеточного типа (П.А. Емельяненко, 1985, В.П. Шишков. 1985; Н.А. Радчук с соавт, 1991; А. Ройт, 1991; J. Н. L. Playfair, 1999 и др.).
В-лимфоциты это клетки, предназначенные для реализации гуморального иммунного ответа с образованием специфических антител, называемых иммуноглобулинами (Ig). Антитела защищают позвоночных от инфекций, нейтрализуют вирусы и бактериальные токсины, мобилизуют комплимент, фагоциты и киллерные клетки (Р.В. Петров, 1982; Я.Е. Коляков, 1986; В.Б. Климович, 1998; А.И. Коротяев, С.А. Бабичев, 1998; Р.С. Canning, 1990; J. W. Hadden, 1987;S.M.Levitz, 1994; К. Mehta 1986; С. F. Nathan 1980; C. Wanidworanum, 1994).
Иммуноглобулины представлены классами M, G, А, Е. При антигенном раздражении IgM появляется первым и является комплементфиксирующим. Секреторный IgA играет важную роль в формировании местного иммунитета и находится на слизистых оболочках пищеварительного, дыхательного и мочевыводящего трактов, молочной железы и в их секретах. В носовом секрете его в 20 раз больше, чем в сыворотке крови, При местной иммунизации или инфицировании содержание его значительно повышается.
Для дифференцировки в Ig - синтезирующие клетки В-лимфоцит должен получить сигнал в виде антигенной стимуляции, однако на большинство антигенов необходима дополнительная стимуляция В-клеток со стороны Т-лимфоцитов, которые либо повышают, либо супрессируют синтез иммуноглобулинов (Р.В. Петров, 1982; Е.И. Соколов, 1998; J.H. Plaifair, 1999).
Т-лимфоциты прямо или опосредовано участвуют в различных аспектах реализации клеточного иммунитета. Одни из них обладают способностью убивать клетки, то есть проявлять цитотоксичность, другие - продуцировать лимфокины, влияющие на различные проявления иммунного ответа. Кроме лимфоцитов в обеспечении индивидуальности и целостности организма, элиминации чужеродных агентов как экзогенной, так и эндогенной природы принимают участие фагоциты, пул которых представлен моноцитами, нейтрофилами и макрофагами (П.А. Емельяненко, 1985; В.Н. Сюрин с соавт., 1985; W. К. Contrib, 1984; Т. V. Davidova, 1995; F. Dieli, 1994).
Моноциты крови и тканевые макрофаги занимают центральное место в защите организма от вирусных и бактериальных болезней. Они являются доминирующими клетками мононуклеарной фагоцитарной системы и обеспечивают повышение фагоцитарной и микробоцидной активности, увеличение экспрессии рецепторов клетки, активацию метаболизма и механизмов киллинга, удаление продуктов разрушенных клеток, захват и переработку антигена для представления Т-лимфоцитам в "удобной" форме. Особое значение для иммунной системы имеет синтез макрофагами интерлейкина-1 и дополнительных растворимых факторов, которые могут подключать и активировать другие клетки, в частности, покоящиеся Т-клетки. Кроме того, через синтез интерферона, они регулируют резистентность организма к вирусной инфекции (А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский, 1979, 1989; Ю.Н. Федоров, О.А. Верховский, 1996; С.А. Луговская, 1997; Е.И. Соколов, 1998; P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, 1980, 1999; А.Н. Rovid, S. Carpenter, J.A. Roth, 1995 и др.).
Важным компонентом фагоцитарного звена иммунитета являются нейтрофилы - клетки, первые реагирующие на введение большинства антигенов, вслед за которыми в иммунные реакции вовлекаются макрофаги и лимфоциты (И.И. Долгушин, А.В. Зурочка, Л.Я. Эберт, 1992; Я. Мацнер, 1993; Д.В. Стефани, Ю.Е. Вельтищев,1996; M.Raz, R.A. Robbins et al.,1993).
Иммунокорригирущие препараты, используемые в ветеринарии
В настоящее время установлена необходимость выявления потенциально опасных для здоровья животных факторов и целесообразность интенсивного поиска эффективных средств фармакологической защиты от негативных воздействий среды, что будет способствовать восстановлению гомеостаза в целом и функции иммунной системы в частности (В.А. Антипов, 1991; В.Т. Самохин, 1983; А.Г. Шахов, 1989; К.Х. Папуниди, 2001; B.C. Бузлома, 2001).
Достижения иммунофармакологии последних лет позволяют по-новому подойти к проблеме неспецифической иммуностимуляции. Выяснилось, что наряду с активацией иммунной системы различные стимуляторы в неодинаковой степени влияют на различные компоненты и этапы иммунного ответа (макрофаги, Т-и В- клетки и субпопуляции, естественные киллеры, процессы миграции и кооперации и т.д. (В.Я. Арион, 1981, 1999).
В настоящее время становится ясно, что применение моноиммуномодулирующеи терапии оказывается недостаточным и на повестку дня выходит комбинированная иммунокоррекция, возможности которой существенно шире (Д.Н. Лазарева, Е.К. Алехин, Е.А. Лебедева с соавт., 1985; Л.М. Тихомирова, 1992; О.Г. Шведов с соавт., 1992; A.M. Земсков с соавт, 1994; Г.В. Базекин, 2000; А.Е. Белов, 2000; О.А. Запровальская, 2002; А.Р. Аносова, 2003 и др.).
Селективная модуляция тех или иных звеньев иммунитета целесообразна при иммунодефиците, некоторых аутоиммунных болезнях, инфекционных заболеваниях (И.Л. Миронов, Л.И. Ратникова, 1997).
Такая избирательность в действии иммуностимуляторов, с одной стороны, и определенная селективность в действии иммунодепрессоров с другой, служит теоретической основой для разработки комбинаций препаратов обеих групп и режимов их использования с целью одновременного или последовательного выключения одних механизмов иммунитета и активации других (А.В.Яшин, 1992).
Необходимость сочетанного применения иммуностимуляторов продиктована слабостью стимулирующего -действия некоторых препаратов или стремлением снизить их дозу для уменьшения вреда от побочных явлений. Выгодность такой комбинации очевидна, поскольку позволяет существенно снижать побочные эффекты препаратов и одновременно обеспечивать иммунокоррекцию ключевых звеньев, что позволяет добиваться высокой клинической эффективности подобной терапии. Поэтому все чаще используют комбинированное применение иммуностимулятров с вакцинами, что дает возможность повышения иммунного ответа на слабые антигены, снижения кратности вакцинации (Я.Э. Кенигсберг, 1985, Е.Ф. Касьяненко, А.В. Соколов, 1992, СВ. Перчаткин, 2001, 2002). Выбор иммуностимулятора должен быть прицельным и для его назначения служат данные иммунного статуса больного животного. Применение иммуностимулятора должно опираться на принцип осторожной коррекции дисбаланса иммунной системы (Б.В. Пинегин с соавт, 1990, И.М. Донник, 1997, Е.И.Соколов, 1998).
С целью коррекции иммунного ответа в нашей стране и за рубежом проводятся многочисленные исследования биологически активных веществ, получаемых синтетическим путем и на основе природного сырья (М.В. Михайлова, 1999, В.Д.Соколов, А.В.Соколов, Н.Л.Андреева, 1992, Степовой И.В. и соавт., 2000).
Из биологически активных соединений, продуцируемых иммунной системой, интерес вызывают производные тимуса -тималин и тимоген. По данным В.Д. Соколова, Н.Л. Андреевой, А.В. Соколова (1995) тималин регулирует количество Т- и В-лимфоцитов, стимулирует клеточный иммунитет, усиливает фагоцитоз, а также процессы регенерации.
В животноводстве тимоген нашел применение в качестве биостимулятора для лечения и профилактики инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии, повышения эффективности иммунизации и увеличения прироста живой массы животных (В.П. Волгин, 1994).
По данным В.М. Земскова (1991) применение тималина индуцирует экспрессию Т-клеточных маркеров и активирует Т-клетки, усиливает продукцию интерлейкина. Одним из перспективных иммуномодуляторов является Т-активин, полученный экстракцией из тимуса крупного рогатого скота. Установлено, что препарат интенсивно активирует фагоцитоз, особенно процессы переваривания (В.И. Беляев, Е.И. Сартасов, 1992, Д.А. Адамбеков, 1994 В.Я.Арион с соавт, 1994; Л.А. Новикова, 1989). Из костного мозга был выделен миелопептид, стимулирующий выработку антител на пике иммунного ответа (Р.В. Петров, 1983). На его основе разработан препарат В-активин, усиливающий образование антител за счет включения неактивных В-клеток. Доказано, что В-активин повышает титры антител при лептоспирозе и сальмонеллезе, а также стимулирует фагоцитарную активность макрофагов (В.А. Кирпиченок, 1989, Л.Д. Сорокина, 1994). А.И. Федоров с соавт. (1992) испытали на телятах иммуностимулятор достим, который по их данным повышает устойчивость животных к действию инфекционных агентов, активизирует фагоцитоз, систему комплимента и Т-лимфоцитоз и по своему действию превышает тимоген и Т-активин. Из группы полисахаридных препаратов в качестве иммуностимуляторов нашли применение сальмозан, пирогенал, продигиозан, зимозан (А.Б. Бакиров, 1979;. А.Б. Баширов, 1980; А.Е. Белов, 2000). Установлено, что зимозан оказывает стимулирующее влияние на Т- и, в меньшей степени, на В-систему иммунитета (Х.Ф. Басс-Шадха, 1970, В.Э. Лиспа с соавт., 1979). Открытие иммуностимулирующих свойств у мураминовой кислоты, содержащейся в стенке клеток E.coli и получение синтетического препарата мурамилдипептида (МДП) явилось новым этапом в исследовании иммуностимуляторов. Установлено, что непирогенный синтетический МДП в виде солевых и водных растворов обладает иммуностимулирующими свойствами, что позволило применять его на практике. К одним из известных стимуляторов относят левамизол, который с успехом применяли для повышения клеточного и гуморального иммунитета у цыплят. По данным А.П. Жигульцова, Л.В. Ковальчук, А.Н Чередеева (1985) применение левамизола вызывает индукцию иммунодепрессии при направленной дозировке или даче препаратов на определенных стадиях патологического процесса. Однако, длительное или повторное его применение вызывает аллергию и стойкий агранулоцитоз.
Т.Е. Соловьева (1991) в качестве иммуностимулятора применяла натриевую соль дрожжевой РНК. По ее данным под действием указанного препарата усиливается фагоцитарная активность лейкоцитов, их поглотительная способность и продукция Т- и В-лимфоцитов, повышается в молозиве содержание специфических антител.
Изучение влияния глутоксима на состояние иммунной системы супоросных свиноматок
Прежде, чем приступить к изучению влияния глутоксима на иммунную систему новорожденных поросят, были проведены опыты на супоросных свиноматках, у которых в крови ИФА выявляли антиген парвовируса. Это было сделано с несколькими целями. Во-первых, считается (А.А. Новых с соавт., 1996; Б.Г. Орлянкин, 1986;; О.Г. Петрова с соавт., 1995; В.А. Сергеев, Б.Г. Орлянкин,1991; С.М.Усов, 1998), что вирус способен проходить через гемато-плацентарный барьер, поэтому большинство поросят рождается уже инфицированными, что и приводит к их значительной ранней летальности. Во-вторых, как правило, взрослые свиньи не имеют клинических признаков болезни, но являются носителями этого вируса. В-третьих, необходимо было выяснить возможные негативные последствия глутоксима на животных в период супоросности. С учетом вышесказанного сформировали две группы: опытную и контрольную (по 10 животных в каждой). Опытным свиноматкам за 1 месяц до предполагаемого опороса внутримышечно один раз в сутки вводили глутоксим в дозе 0,1 мкг/кг массы в течение 5 дней, контрольным - физиологический раствор натрия хлорида в том же объеме (для исключения реакции на процесс введения). За животными вели наблюдение, в процессе которого учитывали их общее состояние, количество народившихся от них поросят: относительно здоровых, слабых, мертвых. В качестве дополнительного критерия эффективности действия препарата определяли наличие антигена вируса в крови у родившихся живыми поросят.
Наблюдения показали, что введение глутоксима супоросным свиноматкам не вызывало видимых отклонений в их общем состоянии и поведении. От них родились поросята живыми, в то время как в контроле 16% - мертвыми. Проведенная оценка обсемененности выживших поросят составила в опыте 42, а в контроле -100%. В течение первого месяца жизни в опытной группе свиноматок погибло 5% поросят, а в контрольной - 28%. Таким образом, применение глутоксима супоросным свиноматкам не оказало негативного действия на плод, а, наоборот, в условиях развития вирусной инфекции, снижало показатели мертворожденное, обсемененности и гибели потомства. Полученные данные позволили предположить, что положительный эффект после применения глутоксима возможно связан с его действием на иммунную систему свиноматок. Проведенные в этом направлении исследования подтвердили наши предположения. Так, при отсутствии существенных изменений в формуле крови (табл. 1) у опытных свиноматок по сравнению с контролем, за исключением снижения процентного содержания базофилов и эозинофилов, отмечено достоверные изменения в показателях лимфоцитарного звена иммунитета. Так, если в контрольной группе свиноматок процентное содержание Т-лимфоцитов составляло 28,7 + 1,34, а Т-лимфоцитов и Т-цитоксических - 24,9 ± 1,07 36,9 ± 1,02 соответственно, то после проведенного курса лечения глутоксимом содержание Т-лимфоцитов возросло до 34,3 ± 1,45 или на 19,5%, Т-хелперов до 28,9 ± 0,93 или на 16,0%, то количество Т-цитоксических клеток, наоборот снижалось с 36,9 + 1,02 до 30,9 ± 0,84 или на 16,3% (табл.2л рис.2.).
Со стороны гуморального звена иммунной системы под влиянием глутоксима при некотором росте В-лимфоцитов происходило снижение показателей Ig А, М и G, активности комплимента СН50 и возрастание циркулирующих иммунных комплексов.Так содержание иммуноглобулина А в контроле составляло 2,64 ± 0,46 г/л, а в опыте -1,62 ± 0,15 г/л или произошло его снижение на 62,1% (р 0,05), иммуноглобулинов М и G соответственно на 10,8 и 16,3%. В тоже время показатели ЦИК возрастали с 16,4 ± 1,49 до 34,3 ±2,13 усл. ед. или в l раза, а показатели СН50 комплимента снизились с 69,3 ± 3,94 до 43,9± 1,41 уел ед. или на 36,7% (р 0,01), (табл. 3., рис- Ъ.).
Более существенные изменения под влиянием глутоксима были отмечены со стороны фагоцитарных реакций нейтрофилов: снижались активность и интенсивность фагоцитоза, их фагоцитарное число, спонтанная НСТ-активность и возрастала индуцированная НСТ-реактивность. Так в опытной группе, где свиноматкам вводили глутоксим активность фагоцитоза нейтрофилов по сравнению с контролем снизилась на 8,8%, интенсивность - на 24,4%, а фагоцитарное число на 0,88 усл.ед. Спонтанная НСТ активность снизилась на 8,0%, а интенсивность -на 0,6%. В тоже время показатели НСТ индуцированной активности и интенсивности возрастали на 3,9% и 0,12 усл. ед. соотвественно, а показатели ЦИК возрасли в 2 раза, а СН50 комплимента снизились на 36,7%. Ста.бл.4., рис. 4«. 5).
Отмеченные изменения в изучаемых показателях свидетельствуют о повышении бактерие - и вирусоцидном потенциале фагоцитарных клеток, снижении воспалительной реакции, улучшении процессов регуляции иммунной системы, усилении биоцидного их потенциала. В тоже время остается ряд вопросов, которые требуют формирования дополнительных подходов.
Оценка влияния глутоксима на иммунную систему поросят, зараженных парвовирусом in vivo
Полученные данные о влиянии глутоксима на иммунную систему больных поросят in vitro, поставили перед нами следующий вопрос - осуществляет ли глутоксим подобное действие после его применения in vivo и положительны или отрицательны полученные данные о снижении активности иммунной системы у поросят с парвовирусной инфекцией?
Кроме того, необходимо было оценить клиническую и иммунологическую эффективность глутоксима на поросятах, а также разработать критерии диагностики иммунотропного действия глутоксима, путем сопоставления изменений в иммунной системе in vitro и in vivo.
Для этого подобрали по принципу аналогов две группы больных поросят (по 10 в каждой): опытную и контрольную. Опытной группе животных ежедневно внутримышечно вводили глутоксим из расчета 0,05 мкг/кг массы в течение 10 дней, контрольной - физиологический раствор натрия хлорида в том же объеме. За животными вели кинические наблюдения, учитывали их общее состояние, развитие, прирост живой массы, процент выживаемости. После окончания курса введения глутоксима брали кровь для проведения иммунологического анализа.
Введение глутоксима предотвращало гибель инфицированных поросят в течение периода наблюдения (3 месяца). В этой группе клинически не выявляли "..-. диареи, в то время как в контрольной группе у 40% поросят отмечали явления энтерита. Было выявлено, что введение глутоксима поросятам привело к снижению вирусемии, что не могло не сказаться на приросте их живой массы. К концу периода наблюдения прирост живой массы в опытной группе поросят превысил контроль в два раза .
Проведенные иммунологические исследования показали, что при многократном введении глутоксима формула крови также существенно не изменяется (табл.10). В то же время отмечено, снижение количества Т-хелперов и Т-цитоксических клеток в 2 раза по сравнению с контролем, а также снижение индекса Тх\Тс, в основном за счет снижения числа цитотоксических лимфоцитов (табл. 11, рис. В). Со стороны гуморального звена иммунитета отмечено четкое отличие, - - in vitro. Здесь, наоборот, наблюдали падение ЦИК и повышение активности С1-С5 компонентов комплемента (табл. 12, рис. Э и 10).
При оценке фагоцитарной реакции нейтрофилов также выявлены некоторые отличия: при отсутствии изменений в фагоцитарных реакциях, наблюдается четкое снижение спонтанной и индуцированной НСТ реактивности фагоцитов и снижение их лизосомальной активности (табл. 13, рис 11).
После 10-кратного введения глутоксима инфицированным поросятам содержание д$ А по сравнению с контролем снизилось с 0,26±0,03 до 0,18 ± 0,04 г/л или 30,8%, циркулирующих иммунных комплексов - с 186,4 ± 10,9 до 126,5 ± 8,94 усл.ед. или на 32,2% (р 0,05-0,01). При несущественных изменениях в показателях СН5о комплимента значительно возрастали показатели отдельных его фрагментов. Таким образом, полученные данные о влиянии глутоксима на иммунокомпитентные клетки крови in vitro и vivo имеют ряд схожих черт и ряд явных отличий. С чем это может быть связано?
Во-первых, глутоксим in vitro действует кратковременно, a in vivo - длительно и возможно в результате он оказал действие на различные механизмы иммунной системы. Так, in vitro его действие связано с подавлением лимфоцитарного звена и частично фагоцитарного, вследствие чего снижается активность гуморального звена иммунной системы и в целом достигается депрессивный эффект (по-видимому, связанный с регуляцией редокс-системы). Второй момент может быть связан с уходом инфицированных клеток в апоптоз (второй механизм действия глутоксима), а в условиях in vitro, нет выхода новых (неинфицированных клеток) из костно-мозгового депо, тимуса и других органов кроветворения.
За эту гипотезу свидетельствует и тот факт, что и in vivo так же отмечается снижение числа Т-хелперов и НСТ активности фагоцитов. Но в отличие от in vitro, имеет место активация системы комплемента, снижение ЦИК, что, по-видимому, связано с элиминацией вируса из крови, что, естественно, не может произойти за 1 час инкубации крови с препаратом in vitro.
Одновременно следует отметить и тот факт, что в целом отмечается снижение активности клеточного звена иммунной системы как in vivo, так и in vitro. Такое снижение, по-видимому, связано с уменьшением воспалительного процесса у поросят. Так как клинически отмечено снижение вирусемии и летальности, очевидно "депрессивное" действие глутоксима, по-видимому, свидетельствует о нормализации состояния иммунной системы поросят, то есть глутоксим ведет себя in vitro и in vivo как истинный "иммуномодулятор" (что подтверждается и данными, полученными нами при исследовании свиноматок). При повышении показателей иммунной системы он их снижает, а при понижении — повышает. Кроме полученных ранее данных о механизмах действия глутоксима in vitro и in vivo, просматривается и ещё одно важное решение, полученное нами, а именно, об однотипности действия глутоксима на Тх и НСТ-реакции нейтрофилов in vitro и in vivo. На наш взгляд, эти иммунологические параметры могут служить критериями для назначения глутоксима после оценки его in vitro, для лечения животных с парвовирусной инфекцией. Итак, проведенные нами исследования показали, что глутоксим можно применять супоросным свиноматкам без ущерба последним и приплоду. Поросятам с парвовирусной инфекцией также можно применять глутоксим для достижения максимального клинического и иммунологического эффекта. Одним из иммунологических критериев положительного, пролонгированного иммунотропного действия глутоксима может служить оценка его иммунотропной активности in vitro по снижению количества Т хелперов и спонтанной и индуцированной НСТ реакции нейтрофилов, что можно использовать в качестве наиболее информативных тестов для иммунологической и клинической оценки лечебной эффективности препарата. Тесты оценки количества Т-хелперов и НСТ-активности нейтрофилов просты в исполнении и легко доступны в обычной ветеринарной лаборатории и могут быть успешно применены не только в крупных городских центрах, но и в отдаленных районах, так как для их выполнения требуется только термостат, центрифуга и обычный световой микроскоп.
Таким образом, проведенное исследование в целом позволило выявить клиническую и иммунологическую эффективность глутоксима и разработать дополнительные иммунологические критерии для его назначения у поросят с парвовирусной инфекцией.
Экономический ущерб, причиняемый болезнями животных, определяют с учетом особенностей изучаемой болезни, вида и половозрелой группы животных и производственного направления хозяйств, а также результатов собственных исследований.
