Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
Глава 2. Собственные исследования 38
2.1. Материалы и методы 38
2.2. Результаты исследований 69
2.2.1. Антибактериальная активность тиамулина и доксициклина 69
2.2.2. Химико-фармацевтические исследования 76
2.2.2.1. Разработка методов стандартизации и контроля качества препарата 76
2.2.2.2. Изучение стабильности препарата 79
2.2.3. Изучение токсичности комплексного препарата в опытах на лабораторных животных и свиньях 82
2.2.3.1. Результаты изучения острой токсичности в опытах на мышах и крысах 82
2.2.3.2. Результаты изучения субхронической токсичности препарата в опытах на лабораторных животных 83
2.2.3.3. Результаты изучения субхронической токсичности препарата в опытах на свиньях 91
2.2.4. Изучение фармакокинетики доксициклина и тиамулина в организме поросят 94
2.2.4.1. Разработка методов для определения доксициклина и тиамулина в сыворотке крови 94
2.2.4.2. Фармакокинетика доксициклина и тиамулина в организме поросят после однократного перорального введения 100
2.2.4.3. Фармакокинетика доксициклина и тиамулина в организме поросят после курсового введения препарата 101
2.2.5. Определение сроков выведения остаточных количеств антибиотиков из организма поросят 103
2.2.5.1. Определение сроков выведения остаточных количеств тиамулина из организма поросят 103
2.2.5.2. Определение сроков выведения остаточных количеств доксициклина из организма поросят 105
2.2.6. Изучение терапевтической эффективности препарата 108
Глава 3. Обсуждение результатов 117
Выводы 137
Практические предложения 139
Список литературы 140
Приложения 161
- Обзор литературы
- Антибактериальная активность тиамулина и доксициклина
- Разработка методов для определения доксициклина и тиамулина в сыворотке крови
- Изучение терапевтической эффективности препарата
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Анализ структуры заболеваемости свиней по отдельным регионам Российской Федерации и в целом по стране показывает, что ежегодно более чем у 70% поросят регистрируют различные синдромы нарушения функций органов пищеварения и дыхания. Возможности развития свиноводства существенно ограничивают желудочно-кишечные и респираторные заболевания, среди которых большой удельный вес имеют дизентерия и энзоотическая пневмония (О.П. Татарчук, 2006; Голиков А.В., Скворцов В.Н., Прасолов А.А., 2001). Во многих хозяйствах страны по причине бактериальной патологии падеж поросят составляет 20-30% от общего числа поголовья (Сидоркин В.А., 2001). Цикличность промышленного свиноводства приводит к персистенции бактерий и вирусов и появлению инфекций, устойчивых к химиотерапевтическим препаратам и трудно поддающихся лечению (Martelli P., Balarini G., 2002). Наиболее часто инфекционные заболевания протекают в смешанной форме, что осложняет течение болезни и выбор эффективного лекарственного средства.
Для лечения таких ассоциированных инфекций часто недостаточно использование монопрепаратов, т.к. практически не существует антибиотиков активных против всего спектра микроорганизмов. Поэтому целесообразно применять комбинированные лекарственные средства, обладающие максимально широким спектром действия и активных в отношении как первичного этиологического фактора, например, брахиспир или микоплазм, так и в отношении вторичной бактериальной инфекции, например, эшерихий, стрептококков, стафилококков, гемофилюсов.
Одновременно с ростом количества антибактериальных препаратов, применяемых в свиноводстве, увеличивается количество возбудителей, устойчивых к антимикробным средствам. Применение научно-обоснованных комбинаций антибактериальных веществ является важным направлением современной химиотерапии бактериальных инфекций, позволяющим не только преодолеть проблему антибиотикорезистентности, но и значительно расширить спектр антимикробного действия. Исходя из анализа данных отечественных и зарубежных исследователей, нам представлялось актуальным разработать удобный в применении и безопасный комплексный антибактериальный препарат, использование которого позволит повысить эффективность лечения широкого спектра смешанных форм инфекционных заболеваний свиней, в том числе энзоотической пневмонии и дизентерии.
В настоящее время наибольшей активностью в отношении основных возбудителей респираторных и желудочно-кишечных инфекций обладают антибиотики из группы макролидов, особенно производные плевромутилина (Голиков А.В., Скворцов В.Н., Прасолов А.А., 2001; A. Cizek et al, 2004; Aarestrup F.M., Friis N.F., 1998; Kobayashi H., 1996; Barigazzi G. et al, 2001; Kinyon J. M. et al., 2002; Hannan P.C.T. et al, 1997). Поэтому в качестве одного из компонентов препарата нами был выбран антибиотик из этой группы - тиамулин, который обладает высокой активностью в отношении основных возбудителей дизенте-
рий и энзоотической пневмонии (микоплазм, серпулин, гемофилюсов, пасте-релл, бордетелл, стафилококков, стрептококков и др.), однако не действует на энтеробактерии, которые часто осложняют течение заболевания.
Антибиотики тетрациклинового ряда активны в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, но не активны или слабо активны в отношении внутриклеточных возбудителей, таких как микоплазмы. (Aranson А., 1980; Pijpers A., Van Klingeren В., Schoevers E.J., Verheijden J.H.M., Van Miert A.S.J.P.A.M., 1989; Hong-Bum Koh et al, 1994; Stipkovits L., Miller D.J.S., 1994; Burch D.G.S. et al, 1986; Stipkovits L. et al, 1992; GuilmotoH., 1996).
Доксициклин, являясь представителем группы тетрациклинов, по сравнению с другими антибиотиками этого ряда обладает более высокой биодоступностью при пероральном введении (более 90%) и способностью за счет своих липофильных свойств лучше проникать в микробную клетку (Aranson А., 1980).
Основываясь на результатах собственных исследований in vitro и анализа литературных данных, нами был предложен комплексный антибактериальный препарат на основе тиамулина и доксициклина для лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней свиней бактериальной этиологии.
Цели и задачи исследования.
Разработать на основе тиамулина и доксициклина новый комплексный антибактериальный препарат для лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекций свиней бактериальной этиологии.
Для этого было необходимо:
изучить антибактериальную активность доксициклина и тиамулина, обосновать состав и разработать лекарственную форму комплексного антибактериального препарата на основе этих двух антибиотиков;
разработать требования к качеству препарата и методы его контроля;
изучить стабильность препарата в процессе хранения;
определить параметры острой токсичности препарата в опытах на лабораторных животных;
изучить субхроническую токсичность препарата в опытах на лабораторных животных и поросятах;
изучить фармакокинетику тиамулина и доксициклина в организме поросят после применения препарата;
установить сроки выведения остаточных количеств тиамулина и доксициклина из организма поросят после курсового применения препарата;
определить оптимальную терапевтическую дозу и изучить терапевтическую эффективность комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина в производственных условиях и разработать схему его применения для лечения бактериальных инфекций свиней.
Научная новизна.
Теоретически и экспериментально обоснован состав антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина, установлено взаимоусили-вающее действие комбинации антибиотиков на стафилококки; определены
фармако-токсикологические свойства, доказывающие возможность безопасного использования лекарственного средства в терапевтических дозах; обоснованы сроки возможного использования в пищу человека мяса и субпродуктов после применения комплексного препарата; подобрана оптимальная схема применения комплексного антибактериального препарата и проведена оценка эффективности лечения бактериальных инфекций свиней.
Практическая значимость работы.
Разработан и предложен для ветеринарной практики новый комплексный антибактериальный препарат на основе тиамулина и доксициклина для лечения бактериальных инфекций желудочно-кишечного и респираторного тракта свиней.
Разработаны методы контроля качества комплексного антибактериального препарата и установлен срок его годности.
Определены сроки возможного использования в пищу человеку мяса и субпродуктов свиней после применения комплексного антибактериального препарата.
Разработана схема применения комплексного антибактериального препарата при лечении бактериальных инфекций свиней.
Разработана нормативная документация и инструкция по применению комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
научное обоснование состава комплексного антибактериального препарата.
качественные и количественные методы контроля комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина.
результаты изучения стабильности комплексного антибактериального препарата при хранении.
результаты изучения острой и субхронической токсичности комплексного антибактериального препарата в опытах на лабораторных животных и свиньях.
результаты изучения фармакокинетики тиамулина и доксициклина и определения сроков выведения остаточных количеств антибиотиков из организма поросят после применения препарата.
результаты определения терапевтической эффективности комплексного антибактериального препарата при лечении дизентерии и энзоотической пневмонии свиней.
практические предложения по применению комплексного антибактериального препарата на основе тиамулина и доксициклина.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 3 научные работы.
Структура и объем диссертации.
Обзор литературы
Массовые желудочно-кишечные и респираторные заболевания поросят существенно ограничивают возможности развития свиноводства, являясь серьезной проблемой ветеринарной практики. Во многих хозяйствах страны по этой причине падеж поросят составляет 20-30% от общего поголовья (16; 38; 143). Особо «коварными» являются хронические инфекционные заболевания, не имеющие явно выраженных клинических проявлений, что делает невозможным оперативную постановку диагноза и своевременное проведение лечебно-профилактических мероприятий. Анализируя данные свиноводческих хозяйств России, можно отметить, что наиболее часто встречаются такие хронические бактериальные инфекции свиней, как дизентерия и энзоотическая пневмония. Общими проявлениями этих инфекций являются: снижение продуктивности в периоды доращивания и откорма; неоднородность поголовья (в частности, появление «сохнущих» поросят); ухудшение конверсии корма; резкое снижение показателей сохранности (43; 143).
В последние десятилетия частота смешанных форм инфекционных заболеваний свиней существенно возросла. Развитие патологического процесса в этом случае обусловлено одновременным или последовательным воздействием на макроорганизм двух или более инфекционных агентов: вирусов, бактерий, микоплазм, хламидий, риккетсий, грибков, спирохет и простейших. Частным случаем смешанной инфекции является вторичная инфекция, когда к уже развивающемуся патологическому процессу присоединяется новое заболевание (143).
Клинические проявления смешанных инфекций разнообразны. Как правило, они не характеризуются суммой симптомов, специфичных для каждого из составляющих их заболеваний, а чаще сопровождаются активизацией патологического процесса (140; 143; 152; 198). Имеющиеся в литературе данные последних лет свидетельствуют том, что основная роль в патологии поросят в послеотъемныи период принадлежит брахиспирам (дизентерия), микоплазмам (энзоотическая пневмония), гемофи-лезным бактериям (гемофилезный полисерозит, гемофилезная плевропневмония), гемолитическим штаммам E.coli (отечная болезнь свиней, колибактериоз поросят), сальмонеллам, пастереллам, стафилококкам, стрептококкам и пневмококкам (38; 143).
Следует отметить, что средняя летальность при инфекционных болезнях свиней, по данным за последние пять лет, была равна примерно 28,5%. В тоже время при многих бактериальных болезнях гибель животных значительно выше. Так, при гемофилезном полисерозите смертность составила 76,4%, при пас-тереллезе - 32,7%, при эшерихиозе - 29,9%, при дизентерии - 9,1% (38).
В инфекционной патологии желудочно-кишечного тракта свиней более 50% случаев приходится на заболевания бактериальной этиологии, средикото-рых важную роль играет дизентерия.
Дизентерия свиней (Dizenteria suurn)- инфекционная болезнь, характеризующаяся геморрагической диареей и катарально-геморрагическим воспалением толстого отдела кишечника с некротическими изменениями слизистой оболочки (12; Пі). ч
Возбудитель дизентерии Brachyspira hyodysenteriaотносится к семейству Spirochaetaceae роду Treponematidae. Br. hyodysenteria — анаэроб, при микроскопии в темном поле имеет форму подвижных нитей с ровными, правильно расположенными завитками и острыми концами размером (7-20)х(0,3-0,4) мкм. Спор и капсул брахиспиры не образуют. Хорошо окрашиваются анилиновыми красителями, в окрашенных по Граму препаратах видны грамотрицательные извитые клетки (28). Возбудитель дизентерии культивируется на специальных средах, в состав которых входит трипсин и кровь крупного рогатого скота, рН 7,4-7,6 (12; 28). 10
Брахиспиры обладают гемолитическими свойствами, а также могут продуцировать эндотоксины. Такие патогенные штаммы вызывают тяжело протекающие мукогеморрагические колиты у поросят (91).
Как правило, дизентерия протекает в виде смешанной инфекции, так как одновременно с обнаружением брахиспир выделяют и другие микроорганизмы, такие как Bacteroides vulgatus, Fusobacterium necroforum, Campilobacter coli, E. coli, Salmonella spp. (110; 111; 195). Заражение только культурой Br. hyodysente-riae гнотобиотических поросят не приводит к развитию дизентерии, что подтверждает полиэтиологическую природу этого заболевания (143).
К Br. hyodysenteria восприимчивы свиньи всех пород и половозрастных групп, но особенно поросята до 5-6 месяцев, особенно молодняк в послеотъем-ный период, заболеваемость которого может составлять до 90% при гибели 30-50% заболевших животных. Источником инфекции являются больные, латентно больные или переболевшие животные-носители (25; 38). В фекалиях переболевших поросят возбудитель может обнаруживаться до 70 дней (139).
Помимо Br. hyodysenteria при дизентерии часто выделяют Br. pilosicoli (85; 91; 143). В Швеции до 40% стад поражены этим возбудителем, в США — до 50% (63). В. pilosicoli вызывает водянистую диарею со слизью, но без крови. Клиническое выздоровление обычно наступает спонтанно в течение 7-10 дней, но сопровождается уменьшением среднесуточных привесов. В исследовании, проведенном Dunser М. и Schweighardt Н. (1998) в Австрии, было отмечено, что в 30% случаев В. pilosicoli выделяется вместе с Lawsonia intracellular!s (87). L. intracellularis может самостоятельно вызывать заболевание, известное под названием пролиферативный илеит (пролиферативная энтеропатия), а также часто встречается при смешанных инфекциях (1387; 140; 149; 150; 152; 198; 199).
Попав в организм свиней алиментарным путем, брахиспиры попадают в толстый кишечник, где фиксируются на слизистой оболочке. Здесь часть бактерий погибает, из них освобождаются вазомоторные субстанции, сенсибилизирующие слизистую оболочку толстого кишечника и повышающие ее проницаемость (28). Это способствует проникновению возбудителя в подслизистую ткань и лимфатические фолликулы слизистой оболочки. В результате происходит закупорка капилляров и сосудов, расположенных на слизистой оболочке толстого отдела кишечника, что ведет к отеку и гиперемии слизистой оболочки и подслизистого слоя. Слизь вызывает расширение крипт и протоков желез, что приводит к развитию дистрофии и некроза со слущиванием эпителиальных клеток, ворсинок и крипт. На слизистой оболочке откладывается фибрин. Образующиеся при разрушении бактерий токсические продукты, проникают в кровь через пораженные ткани кишечника, что обуславливает общую интоксикацию организма, дистрофию и функциональные расстройства (28).
Основные признаки дизентерии — кровавый понос, наличие в испражнениях слизи или слизи с кровью, а при серьезных поражения слизистой кишечника фекалии становятся жидкими и приобретают цвет какао, а затем цвет цемента (3; 16).
У переболевших дизентерией свиней иммунитет не формируется, обнаруживают лишь сывороточные антитела к Br. hyodysenteria и некоторую степень резистентности к реинфекции (28).
Часто желудочно-кишечные инфекции возникают на фоне респираторных и наоборот. Существенную роль в патологии свиней также играют инфекционные пневмонии, которые объединяет ряд весьма сходных по эпизоотологиче-скому, клиническому и патологоанатомическому проявлению заболеваний, вызываемых отдельными микроорганизмами и их ассоциациями (16).
Основными возбудителями респираторных заболеваний свиней инфекционной этиологии можно назвать вирусы (адено-, миксо-, герпес- и др.), мико-плазмы (Mycoplasma hyopneumoniae и hyorhinis), бактерии (P. multocida, Acti-nobacillus pleuropneumoniae, B.bronchiseptica, стрептококки и стафилококки) которые наиболее часто выделяются из легких больных животных (29; 30; 35; 69; 170; 196).
Хроническая пневмония свиней, вызванная микоплазмами и осложненная бактериальной инфекцией (P. multocida, В. bronchiseptica, Str. suis, Н. parasuis, A. pyogenes), известна под названием «энзоотическая пневмония» (97). M.hyopneumoniae - микроорганизм класса Mollucutes, семейства Му-coplasmataceae, рода Mycoplasma. Основным отличием всех микоплазм от бактерий является то, что вместо клеточной стенки они имеют цитоплазматиче-скую мембрану. M.hyopneumoniae морфологически может обнаруживаться в мазках в виде кокковидных, звездчатых нитевидных и др. форм.
Антибактериальная активность тиамулина и доксициклина
Все изученные изоляты стафилококков, за исключением 3, были чувствительны к доксициклину (МПК 1 мкг/мл). Резистентные к доксициклину изоляты были также устойчивы и к другим тетрациклинам, при этом уровень устойчивости к ТЦ, ХТЦ и ОТЦ был соответственно выше в 10, 20 и 2 раза. МГЖ доксициклина в отношении большинства чувствительных изолятов была такой же, как и у хлортетрациклина (0,1-0,2 мкг/мл), в то время как тетрациклин и ок-ситетрациклин оказались менее активными (0,1-0,5 мкг/мл). Изоляты 14, 18, 19 и 20 были чувствительны к доксициклину, а к другим антибиотикам тетрацик-линового ряда оказались устойчивы. Чувствительность изолятов 22, 23 и 24 к доксициклину была умеренной (МПК=5 мкг/мл), однако она была в 2 раза выше, чем у хлортетрациклина, и соответственно в 10 и 20 раз выше, чем у тетрациклина и окситетрациклина.
Грамотрицательные микроорганизмы оказались менее чувствительны к тетрациклинам, чем стафилококки (табл. 4).
Только около 50% изученных изолятов сальмонелл и эшерихий, выделенных от больных животных, были чувствительны к доксициклину. В отношении 16% изолятов эшерихий МПК доксициклина была в 5-10 раз ниже, чем МПК хлортетрациклина, тетрациклина и окситетрациклина. 52% эшерихий и 23% сальмонелл оказались устойчивы к доксициклину и другим антибиотикам тетрациклинового ряда (МПК 10 мкг/мл), 13% культур проявили умеренную чувствительность (МПК 2,5-5 мкг/мл). МПК доксициклина в отношении умеренно-чувствительного изолята Salm.enteritidis 1 была в 30 раз ниже, чем тетрациклина, и более чем в 40 ниже, чем МПК окситетрациклина и хлортетрациклина.
Результаты сравнительного изучения чувствительности стафилококков к тиамулину, тилозину и линкозамидам представлены в таблице 5: Все изученные изоляты стафилококков были чувствительны к тиамулину (МПК 0,075-0,5), только 3 из них проявили умеренную чувствительность - МПК 2,5 мкг/мл.
Из всех изученных антибиотиков тиамулин оказался наиболее эффективным: в большинстве случаев его МІЖ была такой же или ниже МІЖ клинда-мицина и линкомицина, и в 2-10 раз ниже МІЖ тилозина. Изоляты, устойчивые к тилозину (МПКМОО мкг/мл), оставались чувствительными к тиамулину (МПК 0,5-0,75 мкг/мл). Только 3 изолята были более чувствительны к клинда-мицину, чем к тиамулину (МПК 1 и 2,5 мкг/мл соответственно). 17% изолятов оказались более чувствительны к линкомицину, чем к тиамулину (МПК 0,1 и 0,5 мкг/мл соответственно); при этом к клиндамицину эти изоляты были устойчивы (МПК 25 мкг/мл). Для сравнения антибактериальной активности доксициклина и тиамулина с другими широко используемыми в ветеринарной практике антибиотиками были определены их минимальные подавляющие концентрации для различных изолятов эшерихий, сальмонелл и стафилококков, выделяемых при различных инфекционных патологиях (табл. 6).
Наибольшую чувствительность полевые изоляты стафилококков, эшерихии и сальмонелл проявили к цефтиофуру. Только один изолят эшерихии и один изолят стафилококка были устойчивы к действию этого антибиотика (МПК 50 мкг/мл). МПК остальных изолятов находилась в пределах 0,1-2,5 мкг/мл (табл. 6). Более половины изученных изолятов энтеробактерий были устойчивы к действию энрофлоксацина (МПК 2,5-25 мкг/мл). МПК флорфенико-ла в отношении эшерихии и сальмонелл находилась в пределах 5-25 мкг/мл, а в отношении стафилококков - 3,12-12,5 мкг/мл. Только один изолят стафилококка оказался устойчивым к действию этого антибиотика (МПК 50 мкг/мл). МПК гентамицина в отношении большинства энтеробактерий составила 1-2,5 мкг/мл, а в отношении стафилококков - 0,05-0,62. Амоксициллин проявил слабую активность в отношении исследованных эшерихии и сальмонелл: только 3 изоля-та были чувствительны к его действию (МПК 0,5 мкг/мл), МПК в отношении остальных изолятов была выше 10 мкг/мл.
По сравнению с эшерихиями стафилококки были значительно более чувствительны к действию антибактериальных соединений. МПК амоксициллина и цефтиофура в отношении большинства изученных изолятов стафилококков составила 0,1-0,8 мкг/мл и находилась примерно на уровне МПК доксициклина. МПК гентамицина и энрофлоксацина была существенно ниже 0,025-0,25 мкг/мл. МПК энрофлоксацина (1,25-2,5 мкг/мл) и гентамицина (0,62 мкг/мл) в отношении 16% изолятов стафилококков была выше, чем МПК доксициклина (0,25 мкг/мл) и тиамулина (0,5 мкг/мл).
В дальнейших исследованиях нами было изучено действие комбинации доксициклина и тиамулина на стафилококки и энтеробактерий, для выявления возможного характера одновременного действия двух антибиотиков на микроорганизмы (табл. 7).
Взаимоусиливающие действие проявилось в отношении стафилококков, при этом МПК доксициклина и тиамулина удалось снизить в 2-5 раза. Для 50% изолятов МПК доксициклина уменьшилась,в 10 раз (с 0,1-0,2 мкг/мл до 0,01-0,025 мкг/мл), а для 12,5% - в 20 раз (с 0,2 до 0,01 мкг/мл). МПК тиамулина в отношении этих изолятов снизилась в 2 раза. В отношении трех изолятов стафилококков МІЖ тиамулина снизилась в 5 раз, а МІЖ доксициклина - в 3-4 раза. Воздействие комбинации доксициклина и тиамулина на эшерихии и сальмонеллы не привело к существенному снижению МІЖ этих антибиотиков. На основании данных по фармакокинетике доксициклина и тиамулина в организме свиней и результатов изучения специфической активности этих антибиотиков в отношении некоторых возбудителей желудочно-кишечных и респираторных инфекций свиней бактериальной этиологии был предложен комплексный антибактериальный препарат в форме порошка, содержащий в качестве действующих веществ 5% тиамулина и 5% доксициклина.
Разработка методов для определения доксициклина и тиамулина в сыворотке крови
Определение концентрации доксициклина в сыворотке крови поросят при однократном пероральном введения в ориентировочной терапевтической дозе 120 мг/кг массы тела проводили микробиологическим методом диффузии в агар и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Микробиологический метод разрабатывали на основе метода определения тетрациклина, изложенного в ГФ XI вып.2. В качестве тест-культур были испытаны Bacillus cereus 11778 и Bacillus subtilis var. L2. Тест-культуру Bacillus cereus 11778 вносили в среду из расчета 0,5-1 млн микробных тел на 1 мл среды, a Bacillus subtilis var. L2 - 5 млн микробных тел на 1 мл среды. При использовании тест-культуры Bacillus cereus 11778 были получены более четкие зоны задержки роста, поэтому в дальнейших исследованиях мы работали с этим изолятом.
Чашки с внесенной сывороткой выдерживали для преддиффузии в течение 2 и 12 часов при комнатной температуре, а затем помещали в термостат, отрегулированный на 37 С, на 3 часа. Увеличение длительности преддиффузии позволило повысить чувствительность метода более чем в 2 раза (табл.25). Предложенный метод позволяет определять концентрацию доксициклина 0,05 мкг/мл (зоны задержки роста порядка 12,5 мм).
С учетом литературных данных и собственных исследований были подобраны оптимальные условия хроматографии для определения доксициклина в сыворотке крови (167; 59; 199; 175; 162; 163; 111; 143). Наиболее четкие пики доксициклина были получены при использовании в качестве подвижной фазы смеси растворителей метанол : ацетонитрил : 0,7% водный раствор гептансульфоновой кислоты (рН 2,0-2,2) в соотношении 165,8:42,5:100, а в качестве неподвижной фазы - колонки Synergy Hydro RP 250x4,6 мм с размером частиц 5 дт. Для определения оптимальных условий анализа мы хроматографировали стандартные растворы доксициклина при разных длинах волн, так как согласно литературным данным доксициклин имеет несколько максимумов поглощения (59) (рис. 1).
При проверке селективности метода было установлено, что время выхода пиков других антибиотиков тетрациклинового ряда (тетрациклин, окситетрациклин и хлортетрациклин) и 4-эпи-доксициклина отличается от времени выхода пика доксициклина (рис. 2) (пики окситетрациклина и тетрациклина совпадают).
Наибольший максимум поглощения отмечали при длине волны 270 нм, однако для определения доксициклина в сыворотке использовали длину волны 345 нм, при которой был ниже уровень «шума».
Доксициклин в значительной степени связывается с белками плазмы, поэтому требовалось подобрать оптимальный растворитель, который обеспечивал бы наиболее полную экстракцию антибиотика из сыворотки крови. Для этого к пробам контрольной сыворотки, в которую предварительно вносили стандарт доксициклина известной концентрации, добавляли различные растворители (ацетонитрил, подкисленный метанол, 0,01 М раствор соляной кислоты, водные буферные растворы). При экстракции ацетонитрилом и подкисленным метанолом пик, соответствующий доксициклину, был почти в 2 раза меньше, чем на хроматограмме стандарта такой же концентрации. Это можно объяснить тем, что при добавлении ацетонитрила или метанола белки сыворотки осаждаются вместе со связанным антибиотиком, и большая его часть удаляется в ходе последующей очистки пробы. В дальнейшем для экстракции доксициклина мы использовали различные буферные растворы: 0,01 М раствор соляной кислоты; 0,03 М раствор натрия фосфата однозамещенного; буфер McLLvaine буфер (10 частей 0,1 М лимонной кислоты и 6,25 частей 0,2 М натрия фосфата двузамещенного); цитратно-солянокислый буфер №2, приготовленный поГФХ1,срН4,75.
Добавление соляной кислоты вызывало разложение доксициклина, увеличивался пик, соответствующий 4-эпи-форме, и появлялись дополнительные пики на хроматограмме. При добавлении к пробам цитратно-солянокислого и McLLvaine буферов степень экстракции составила 91-95%, поэтому дальнейшие исследования продолжали с цитратно-солянокислым буфером, рН которого доводили до 4,75 (табл. 27).
Для определения процента экстракции, линейности и воспроизводимости метода в контрольные пробы сыворотки вносили стандарт доксициклина, чтобы получить концентрацию в сыворотке 0,1; 0,25; 0,5; 1 и 2 мкг/мл. С каждой концентрацией готовили по три пробы. На основании полученных результатов строили калибровочную кривую (рис 3.).
Процент экстракции рассчитывали, сравнивая площадь пика доксициклина на хроматограмме опытной пробы с площадью пика на хроматограмме стандарта. В среднем процент экстракции доксициклина из сыворотки крови составил 92,36%, а величина достоверности аппроксимации R2=0,9966 (табл. 28, рис. 3).
На основании полученных данных строили калибровочную кривую стандарта доксициклина, по которой затем рассчитывали содержание доксициклина в опытных пробах.
При анализе проб контрольной сыворотки доксициклин в них не обнаруживали.
Для определения стабильности антибиотика в сыворотке крови при замораживании, пробы с внесенным стандартом доксициклина (0,5 и 1 мкг/мл) хранили при температуре -18 С в течение 2 месяцев и по истечении этого срока пробы анализировали по разработанной методике. Было установлено, что доксициклин практически не разлагается в сыворотке при замораживании, его концентрация была на уровне 0,436 и 0,84 мкг/мл соответственно. Потеря активности составила 13 и 16% соответственно.
Концентрацию тиамулина в сыворотке крови поросят определяли только микробиологическим методом, так как этот метод позволяет определить активный тиамулин, а не его метаболиты, которые не обладают микробиологической активностью. В качестве тест-культуры использовали Micrococcus luteus АТСС 9341. Степень экстракции тиамулина из сыворотки крови и стабильность антибиотика в процессе замораживания определяли путем внесения в контрольную сыворотку известных концентраций стандарта тиамулина (0,05; 0,1; 0,25; 0,5 и 1,0 мкг/мл). В среднем процент экстракции составил 83%, метод был линеен в указанном диапазоне (табл. 29).
Изучение терапевтической эффективности препарата
Терапевтическую эффективность лекарственного средства на основе тиамулина и доксициклина при дизентерии и энзоотической пневмонии поросят испытывали в хозяйствах Курской, Белгородской, Новгородской и Воронежской областей.
Определение оптимальной терапевтической дозы препарата при дизентерии свиней проводили в двух хозяйствах Белгородской области.
Первый опыт проводили в июле-августе 2007 года в колхозе им. Фрунзе Белгородского района Белгородской области. У животных отмечали диарею с кровью и слизью, истощение, у некоторых поросят была рвота и повышалась температура. При патологоанатомическом исследовании обнаруживали геморрагическое воспаление в толстом отделе кишечника. Диагноз подтверждали результатами лабораторных исследований (положительная РИФ мазков из фекалий свиней и микроскопия). При бактериологическом исследовании были выделены Brachyspira hyodysenteria.
Проведенные исследования показали, что препарат на основе тиамулина и доксициклина эффективен (91%) при дизентерии свиней даже в наименьшей изученной дозе - 2 кг/т корма (100 мг/кг массы тела) (табл. 38).
Эффект от применения препарата в более высокой дозе - 2,5 мг/т корма (ПО мг/кг) существенно не отличался от первой опытной группы и составил 91,45%. Применение препарата в этих дозах оказалось эффективней, чем использование тилозина, который обычно применяли в этом хозяйстве для лечения дизентерии. Наибольшего терапевтического эффекта удалось достичь при введении препарата в дозе 3 кг/т корма (94,26%). Среднесуточные привесы в этой группе также были выше и достоверно (р 0,05) отличались от контроля.
Другой аналогичный опыт проводили в ЗАО «Скороднянское» Губкинского района Белгородской области в январе-феврале 2008 года. У поросят отмечали кровянистый понос со слизью, потерю аппетита, угнетение, повышение температуры. При патологоанатомическом вскрытии в желудке и , толстом отделе кишечника отмечали геморрагическое воспаление: и некроз; поверхность слизистых была покрыта пленками фибрина, слизистая толстого кишечника была ярко-красного цвета с кровоизлияниями; наблюдалось увеличение брыжеечных лимфатических узлов.. При бактериологическом: исследовании были выделены Brachyspira hyodysenteria:
Полученные результаты; совпали с данными, полученными ВІпредыдущем опыте.».. Применение{препарата на основе тиамулина и. доксициклина позволило-значительно сократить падеж животных. В опытных группах пало и было вынужденно; убито в 2,7 раза меньше поросят, чем в контрольной» группе (табл. 39).
Предложенная лекарственная, форма была более эффективна, чем. препарат сравнения тилозин: при применении испытуемого препарата выздоровело: соответственно;92,8;: 91,7;.93,4% поросят в группах, получавших препарат в дозах 2, 2,5 Ht 3; кг/т корма, а при введении препарата сравнения - только 80 7%. Однако в: этом- опыте, существенной разницы в? эффективности между опытными группами, получавшими» разные дозы препарата, не отмечали.
Третий опыт по изучению терапевтической эффективности препарата при дизентерии свиней в сравнении с метронидазолом проводили в АО «Гарант» Беловского района Курской области в октябре-ноябре 2007 года. У поросят отмечали диарею с кровью и слизью, истощение, рвоту и повышение температуры, при патологоанатомическом вскрытии наблюдали геморрагическое воспаление в толстом отделе кишечника; лабораторные исследования подтвердили поставленный диагноз на дизентерию (положительная РИФ мазков из фекалий свиней и микроскопия).
Проведенные исследования» показали, что лекарственная форма на основе тиамулина и доксициклина эффективна при лечении дизентерии свиней в. испытанной дозе 2 кг/т корма и превосходит по эффективности препарат сравнения метронидазол (табл. 40). В опытной группе только 4 поросенка были вынужденно убиты, в то время как в контрольной пало 2 животных и 6 были вынужденно убиты. Эффективность лечения в опытной группе была значительно выше — 92,85% по сравнению с контрольной группой - 84,31%.
Учитывая, что течение дизентерии зачастую осложняется вторичной инфекцией, нами были проведены исследования терапевтической, эффективности препарата при-различных желудочно-кишечных заболеваниях поросят. Опыт проводили в «Ракитянском свинокомплексе» Белгородской области в апреле-мае 2008 года. На основании клинических признаков (повышение температуры, потеря аппетита, угнетение, диарея) и бактериологического исследования поросятам был поставлен диагноз колибактериоз.
Проведенные исследования показали, что изученное лекарственное средство обладает высокой терапевтической эффективностью при лечении колибактериоза и не уступает препарату сравнения колистину (99 и 98% соответственно). В опытной группе отмечали более высокие привесы по сравнению с контрольной группой (таб. 41).
Использование предложенной лекарственной формы на основе тиамулина и доксициклина для лечения дизентерии и желудочно-кишечных болезней свиней было эффективно в дозах 2-3 кг на 1 тонну корма и не уступало препаратам сравнения - метронидазолу, тилозину и колистину. На основании проведенных испытаний можно рекомендовать применять препарат для лечения бактериальных инфекций желудочно-кишечного тракта.
Оптимальную дозу препарата на основе тиамулина и доксициклина для лечения энзоотической пневмонии свиней определяли в двух опытах. Первый опыт проводили в январе-феврале 2007 года в колхозе им. Фрунзе Белгородского района Белгородской области. В опыте участвовали 344 поросенка, которым был поставлен диагноз энзоотическая пневмония. Клиническая картина заболевания проявлялась повышением температуры, кашлем, одышкой, угнетением и потерей аппетита. При бактериологическом исследовании патологического материала от больных животных были выделены микоплазмы и гемолитические стрептококки.
Наиболее высокая терапевтическая эффективность была получена в группе, получавшей препарат в максимальной дозе - 3 кг/т корма, а самая низкая - в группе, получавшей тилозин (табл. 42). Также в опытных группах отмечали более высокие по сравнению с контролем привесы. В опытной группе, получавшей максимальную дозу препарата, пало только 3% животных, а 10% понадобилось лечение другим лекарственным средством. В контрольной группе пало 9% животных и 16% потребовалось дополнительное лечение.
Второй опыт ДЛЯІ установления оптимальной терапевтической дозы проводили в ЗАО «Скороднянское» Губкинского района Белгородской области в марте-апреле 2008 года. В опыт были отобраны поросята с клиническими признаками пневмонии: повышенная температура тела, кашель, в некоторых случаях затрудненное дыхание и одышка, угнетенное состояние. При бактериологическом анализе были выделены гемолитические стрептококки.
Наибольшей эффективности удалось достичь в группе, получавшей препарат в максимальной дозе - 3 кг/т корма (91%), другие испытанные дозы (2 и 2,5 кг/т корма) также были достаточно эффективны (82-85%), в группе, получавшей препарат сравнения, эффективность лечения была самой низкой (80%). В опытной группе, получавшей максимальную дозу препарата, было вынужденно убито только 2 животных, а 6 понадобилось дополнительное лечение. В контрольной группе пало 9 животных и 10 потребовалось дополнительное лечение (табл. 43).
Испытание терапевтической эффективности лекарственного средства на основе тиамулина и доксициклина при энзоотической пневмонии свиней проводили на базе ОАО Комбинат мясной «Калачаевский» в декабре 2006 года. ,У поросят отмечали повышенние температуры тела, покраснение век, в некоторых случаях затрудненное дыхание и одышку, потерю аппетита. При бактериологическом исследовании были выделены микоплазмы (Mycoplasma hyopneumoniae) и бактерии гемофилюс (Haemophillus).
Применение препарата на основе тиамулина и доксициклина позволило избежать гибели животных и получить более высокие привесы (табл. 44). Терапевтическая эффективность испытуемого лекарственного средства была на 2,7% выше, чем в контрольной группе, где использовали комплексный антибактериальный препарат спелинк 44 на основе спектиномицина и линкомицина.
