Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Бактериальные инфекции птиц:
2.1.1. Колибактериоз 10
2.1.2. Сальмонеллез 13
2.2. Антимикробные лекарственные средства и их комбинации, применяемые для лечения колибактериоза и сальмонеллеза птиц 15
2.2.1 Доксициклин 20
2.2.2. Линкомицин 27
2.3. Заключение 32
3. Материалы и методы исследований 33
4. Результаты собственных исследований :
4.1. Фармакологические исследования комплексного антибактериального препарата на основе доксициклина и линкомицина, определение требований " к его качественным и количественным характеристикам 48
4.2. Изучение стабильности комплексного антибактериального препарата на основе доксициклина и линкомицина 51
4.3. Изучение острой токсичности комплексного антибактериального препарата на основе доксициклина и линкомицина в опыте на белых мышах 52
4.4. Изучение острой токсичности комплексного антибактериального препарата на основе доксициклина и линкомицина в опыте на цыплятах 53
4.5. Изучение субхронической токсичности комплексного антибактерального препарата на основе доксициклина и линкомицина в опыте на мышах
4.6. Изучение субхронической токсичности комплексного антибактериального препарата на основе доксициклина и линкомицина в опытах на цыплятах 58
4.7. Изучение фармакокинетики доксициклина и линкомицина в организме птиц при однократном пероральном введении комплексного антибактериального препарата 63
4.8. Изучение фармакокинетики доксициклина и линкомицина в организме цыплят при пятидневном применении комплексного антибактериального препарата 65
4.9. Изучение сроков выведения остаточных количеств доксициклина и линкомицина из организма цыплят после курсового применения комплексного антибактериального препарата 66
4.10. Терапевтическая эффективность комплексного антибактериального препарата при колибактериозе и сальмонеллезе птиц в производственных условиях 67
5. Обсуждение результатов 76
6. Выводы 92
7. Практические предложения 94
8. Список использованной литературы
- Антимикробные лекарственные средства и их комбинации, применяемые для лечения колибактериоза и сальмонеллеза птиц
- Линкомицин
- Изучение стабильности комплексного антибактериального препарата на основе доксициклина и линкомицина
- Изучение фармакокинетики доксициклина и линкомицина в организме птиц при однократном пероральном введении комплексного антибактериального препарата
Антимикробные лекарственные средства и их комбинации, применяемые для лечения колибактериоза и сальмонеллеза птиц
Основным источником инфекции является больная или переболевшая птица, которая остается носителем возбудителя до 6 месяцев. Выделяемые птицей патогенные Escherichia coli - потенциальный источник заболеваний людей и различных видов животных (66, 129, 137, 176).
Наиболее восприимчив к колибактериозу молодняк птиц в возрасте от 3 до 140 дней, гибель может составлять от 2 до 40% и более. Взрослая птица подвержена заболеванию в период интенсивной яйцекладки, при этом чаще инфекция носит хронический характер (12, 16, 84). Степень поражения, тяжесть течения заболевания зависят от возраста птицы, условий содержания, кормления, наличия других инфекций, резистентности организма. Заражение обычно происходит через поврежденные слизистые оболочки алиментарным или аэрогенным путем, чему способствует наличие у птицы других бактериальных или паразитарных заболеваний, отсутствие нормальной микрофлоры, снижение фагоцитарной активности, неполноценное кормление, токсичные корма (13, 42, 94).
В настоящее время насчитывается 173 серотипа Escherichia coli среди которых 48% вызывают развитие колибактериоза и могут вызывать гибель эмбрионов и 3-недельных цыплят. При бактериологических исследованиях чаще выделяют патогенные E.coli серотипов 01, 02, 035, 078, реже - серотипов 04, 08,0127,0138(2,85,145).
Патогенные и непатогенные штаммы Е. coli не отличаются друг от друга морфологически, имеют сходные биохимические свойства и чувствительность к лекарственным средствам (100, 130).
Патогенность штаммов Е. coli обусловлена способностью вырабатывать экзотоксины, наличием термолабильных и термостабильных эндотоксинов, наличием полисахаридных адгезивных и капсульных антигенов, гемолизина. (90, 100, 136).
Основными условиями возникновения и распространения инфекции являются: скученное содержание, недостаточная санация птичников, инкубатора, оборудования, инвентаря, производственной территории, транспортных средств, инкубационных яиц, плохая вентиляция, авитаминозы, контаминиро-ванные корма и вода, отсутствие или недостаточная дезинсекция, повышенная влажность, повышенная концентрация аммиака, сильные стрессы. Сопутствующие заболевания - инфекционный вирусный бронхит цыплят, геморрагический, вирусный энтерит индюшек, микоплазмозная инфекция, усугубляют течение эшерихиоза (20, 84, 94, 130, 161, 180).
Клиническая картина болезни имеет разнообразное проявление, регистрируется у цыплят, уток и индюшек. У одной и той же птицы штаммы Е. coli, выделенные из кишечника и из перикардиального мешка, не всегда идентичны. При колибактериозе имеет место трансмиссия возбудителя в яйцо, с чем связана высокая гибель эмбрионов и цыплят первых дней жизни.
Диагноз на колибактериоз устанавливают на основании клинических признаков, эпизоотических данных, патологоанатомических изменений и бактериологического исследования. При установлении диагноза проводят комплекс про-тивоэпизоотических и ветеринарно-санитарных мероприятий (2, 84, 100, 175). В целях профилактики и борьбы с колибактериозом используют различные антимикробные средства (15, 39). Имеются сведения о высокой эффективности фторхинолонов (энрофлаксин, норфлоксалин) при колибактериозе птиц (111).
Применение общих мер, а также использование лекарственных средств антимикробного действия (антибиотиков, сульфаниламидов, нитрофуранов) является в настоящее время наиболее доступными и эффективными способами борьбы с колибактериозом, несмотря на устойчивость возбудителя ко многим антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам. 2.1.2. Сальмонеллез
Серьезную проблему в современном птицеводстве представляют сальмо-неллезы - опасные токсикоинфекции многих видов животных, птиц и человека. По заключению экспертов Всемирной организации здравоохранения, сальмо-неллез как зооантропонозная инфекция, не имеет себе равных по сложности эпизоотического процесса и трудностям борьбы с ним (49, 80).
Заболевание протекает остро или хронически в виде септицемии и сим-птомокомплексом диареи у молодняка и скрытого бактерионосительства у взрослых. Заболевание вызывается бактериями рода Salmonella семейства Епerobacteriaceae, которое включает более 2300 серотипов (10% из них выделено у домашней птицы). Сальмонеллы - грамотрицательные палочки, неспорообра-зующие, подвижные; являются факультативными анаэробами, растут на простых питательных средах, имеющих в составе углерод и азот, ферментируют глюкозу, мальтозу, дульцитол, маннит, не ферментирует лактозу, сахарозу, ма-лонат и салицин (30, 138).
Подвижные серотипы рода Salmonella относят к группе паратифозных сальмонелл. Инфицированность последними приводит к развитию болезни или бессимптомному носительству. Патогенность сальмонелл определяется следующими категориями токсинов: эндотоксин, термолабильный энтеротоксин и устойчивый к высокой температуре цитотоксин (125, 150, 157, 184).
Птица, выращенная на предприятиях промышленного типа, является наиболее значимым резервуаром сальмонелл, которые могут попасть в продукты питания человека. Заболеваемость среди людей в основном вызывается инфицированным мясом птицы и яйцами. Так как в последнее время во многих странах мясо птицы стало главным источником белка, распространение сальмонел-леза среди птицы и, как следствие, контаминация продуктов питания, имеют глобальное значение для экономики и здравоохранения (5,14, 55).
Установлено, что для птиц патогенными и наиболее часто выделяемыми серотипами сальмонелл являются S.typhimurium, S.enteritidis и S.gallinarum-pullorum. Распространению сальмонеллеза способствуют другие инфекционные и неинфекционные заболевания, некачественный корм, нерациональное применение антибиотиков, химических препаратов, воздействие которых ведет к усилению вирулентных свойств микроорганизмов, и в то же время делает их устойчивыми к применяемым лекарственным средствам (31, 124).
Проблему сальмонеллезов следует рассматривать не только как ветеринарную, но и как медико-экологическую. Способность сальмонелл персистиро-вать в организме птиц без выраженного клинического проявления создает возможность контаминации сальмонеллами яиц и тушек птицы. Ввиду того, что основным фактором патогенности сальмонелл является токсигенность, то при нарушении правил переработки и хранения продукции происходит размножение сальмонелл и накопление токсинов, что в конечном итоге может привести к заболеванию людей (25, 66, 67).
Передача возбудителя происходит горизонтальным (от птицы к птице) или вертикальным (потомству от инфицированного племенного стада) путями. Вспышки заболевания возникают при заносе возбудителя птицами - бактерионосителями, с инкубационным яйцом, с кормами и усугубляются стрессовыми ситуациями (4, 11, 55).
Линкомицин
Гексенал белым мышам вводили внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг массы тела. Учет времени сна начинали с момента принятия мышами бокового положения и заканчивали при появлении координированных движений.
В эти же сроки на 10 других белых мышах из каждой группы ставили пробу с плаванием по методике описанной Рыловой М.Л. (1964 г.), после чего у животных определяли весовые коэффициенты внутренних органов -печени, почек, легких, сердца, селезенки.
Изучение субхронической токсичности комплексного антибактериального препарата в опыте на цыплятах. Субхроническую токсичность комплексного антибактериального препарата изучали на 40 цыплятах с начальной живой массой птицы 600-650 г. Цыплят по принципу аналогов разделили на 4 группы по 10 голов в каждой.
Цыплятам комплексный антибактериальный препарат выпаивали разведенным в воде в течение 20 суток в дозах: 1 группа - 4 мл/л воды (четырехкратная терапевтическая доза); 2 группа - 2 мл/л воды (двукратная терапевтическая доза); 3 группа - 1 мл/л воды (терапевтическая доза); IV группа - контроль. Вода с растворенным в ней комплексным антибактериальным препаратом (для опытных групп) являлась единственным источником питья для птицы. Птица контрольной группы получала воду, которая не содержала лекарственных средств.
Наблюдение за клиническим состоянием птицы вели на протяжении 31 суток от начала опыта. Определение живой массы цыплят проводили до начала введения препарата и на 10, 20 и 30 сутки опыта.
На 21 сутки от начала опыта изучали морфологические (количество эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу) и биохимические (альбумины, глюкозу, мочевину, креатинин, щелочную фосфатазу, общий белок, аспартатаминотрансферазу) показатели крови и определяли относительную массу (весовые коэффициенты) внутренних органов птицы - печени, легких, почек, сердца, селезенки. Изучение фармакокинетики доксициклина и линкомицина в опыте на цыплятах. Фармакокинетику доксициклина и линкомицина после однократного перорального введения комплексного антибактериального препарата изучали на 45 цыплятах живой массой 540-660 г. В течение часа до начала эксперимента птица не получала корм и воду. Комплексный антибактериальный препарат птице вводили разведенным водой через зонд в зоб в терапевтической дозе (14 мг суммы действующих веществ на 1 кг массы тела). Через 1; 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21; 24 часа после введения препарата птицу умерщвляли и отбирали образцы органов и тканей (сыворотка крови, печень, легкие, почки, скелетная и сердечная мышца). В каждый срок исследовали образцы от 5 цыплят.
Определение содержания доксициклина и линкомицина в биосубстратах проводили микробиологическим методом диффузии в агар (Ковалев В.Ф. и др., 1988). Чувствительность метода составляла для доксициклина - 0,03 мкг/г(мл), а для линкомицина - 0,1 мкг/г(мл).
Образцы органов и тканей птицы в количестве 2 г измельчали ножницами и растирали в ступке с добавлением стерильного кварцевого песка. К гомогенату добавляли буферные растворы в соотношении 1:1 (для определения линкомицина - фосфатный буфер № 4 с рН 7,8-8,0; для определения доксициклина - цитратно-солянокислый буфер № 2 с рН 5,8-6,0), и тщательно перемешивали. Затем гомогенат переносили в пробирки и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливали в пробирки и использовали для определения содержания антибиотиков.
В исследованиях сыворотку крови цыплят использовали без разведения. В опыте использовали два вида сред: для определения доксициклина среду № 5 (по ГФ X стр. 948) и для определения линкомицина среду следующего состава: 6,0 г пептона; 4,0 г панкреатического гидролизата казеина сухого; 3,0 г дрожжевого экстракта сухого; 1,5 г мясного экстракта сухого; 20,0 г агар-агара и дистиллированная вода до 1000 мл (рН среды после стерилизации 8,0-8,2). Питательную среду для определения доксициклина расплавляли на водяной бане и охлаждали до 65 С. Затем в нее добавляли взвесь спор культуры Bacillus subtilis var. L2 из расчета 2 мл одномиллиардной взвеси и 2 мл стерильного 40% раствора глюкозы на каждые 100 мл среды, тщательно перемешивали и разливали по 15 мл в чашки Петри. После застывания питательной среды в ней стерильным цилиндром из нержавеющей стали вырезали по 6 лунок диаметром 8 мм расположенных под углом 60 друг к другу на расстоянии около 28 мм от центра чашки.
Питательную среду для определения линкомицина расплавляли на водяной бане и охлаждали до 48-52 С. Далее в нее добавляли по 2 мл стерильного 40% раствора глюкозы на каждые 100 мл среды и суспензию суточной культуры Micrococcus luteus АТСС 9341 из расчета 20 млн. микробных тел на 1 мл среды, тщательно перемешивали и разливали по 15 мл в чашки Петри. После застывания питательной среды в каждой чашке стерильным цилиндром из нержавеющей стали вырезали по 6 лунок диаметром 8 мм. Постановка опыта осуществлялась параллельно с построением стандартных кривых. При определении доксициклина, навеску стандартного образца доксициклина (около 20 мг) растворяли в 0,01 N растворе соляной кислоты до концентрации 1000 мкг/мл. Далее буфером № 2 разводили этот раствор до концентрации 10 мкг/мл. Из этого раствора на контрольной сыворотке цыплят готовили 5 растворов антибиотика с концентрацией 0,3; 0,4; 0,5; 0,75 и 1 мкг/мл.
При определении линкомицина, навеску стандартного образца линкомицина (около 20 мг) растворяли в фосфатном буфере № 4 и доводили концентрацию раствора до 10 мкг/мл. Из этого раствора на контрольной сыворотке цыплят готовили 5 растворов антибиотика с концентрацией 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 мкг/мл.
Изучение стабильности комплексного антибактериального препарата на основе доксициклина и линкомицина
Анализируя публикации как отечественных, так и зарубежных авторов (12, 48, 50, 95, 100, 112, 129, 130, 190), данные статистики, можно констатировать, что инфекционные болезни желудочно-кишечного тракта птицы, имеют широкое распространение и наносят значительный экономический ущерб.
Среди бактериальных заболеваний наиболее серьезный ущерб, особенно бройлерным хозяйствам, наносит колибактериоз и сальмонеллез.
Убытки, причиненные этими болезнями, складываются из значительного отхода цыплят вследствие высокой смертности, отставания в росте, потери привесов птицы, затрат на лечение и профилактику заболевания.
В целях борьбы с колибактериозом и сальмонеллезом птиц проводят комплекс ветеринарно-санитарных мероприятий, включающих дезинфекцию помещений, инкубационных яиц, создание благоприятного микроклимата, соблюдение норм посадки птиц в клетку и ряд других.
К сожалению, проведение общих мероприятий не всегда обеспечивает защиту птицы от инфекционных заболеваний. Поэтому для сохранения птицы и для терапии инфекций бактериальной этиологии вынуждены применять различные химиотерапевтические лекарственные средства: антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны, фторхинолоны и другие (15,134).
В то же время длительное и бессистемное применение химиотерапев-тических лекарственных средств приводит к развитию устойчивости штаммов микроорганизмов, называемой антибиотикорезистентностью, которая является серьезной проблемой при терапии бактериальных инфекций (75, 91, 191).
В ряде публикаций авторы сообщают, что процент устойчивых штаммов кишечной палочки, выделенных от птицы, может достигать 90% и более. Так, по данным С.А. Артемьевой (1977) к тетрациклинам были устойчивы 91,2-92,7%, к окситетрациклину - 50%, к левомицетину - 9,7% выделен 77 ных штаммов. Аналогичные данные приведены в работах Н.А. Радчук (1990), B.W. Calnek (2003) и других авторов. Борьба с лекарственно-устойчивыми бактериями ведется по нескольким направлениям. Это получение новых хи-миотерапевтических препаратов, которые отличаются от существующих механизмом действия (например, фторхинолоны, воздействующие на ДНК-гидразу микробной клетки). Другой путь - химическая модификация известных антибиотиков, защищающая их от воздействия бактериальных ферментов, инактивирующие активные центры антибиотиков или разрушающие их. Третий путь, заключается в применении ингибиторов, подавляющих активность бактериальных ферментов инактивирующих антибиотики с соответствующими антибактериальными препаратами.
Однако перспективным и наиболее реальным путем предупреждения развития резистентности у микроорганизмов и повышения терапевтической эффективности антибиотиков является применение научно-обоснованных комбинаций антимикробных препаратов обладающих синергидным или аддитивным действием.
Благодаря взаимоусиливающиму действию сочетаний антибактериальных веществ и достижению терапевтического эффекта меньшими дозами, появляется возможность снижения токсичности отдельных компонентов препарата, что имеет немаловажное значение при использовании соединений, обладающих нефрототоксическим (аминогликозиды, полимиксины, сульфаниламиды), гепатотоксическим (тетрациклины, нитрофураны) а также неблагоприятным воздействием на кроветворную систему (левомицетин, сульфаниламиды) и желудочно-кишечный тракт (тетрациклины, эритромицин, нитрофураны, линкомицин) (44, 74).
В том случае, когда комбинирование антибактериальных препаратов не приводит к синергидному эффекту, а ограничивается лишь суммирующим аддитивным действием, оно расширяет антибактериальный спектр действия такого препарата, что особенно важно при смешанных инфекциях бактериальной этиологии (44). Во Всероссийском государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ «ВГНКИ») в прошлые годы было установлено, что антибиотик тетрациклинового ряда доксициклина гидрохлорид и антибиотик линкомицина гидрохлорид при совместном применении обладают взаимоусиливающим действием в отношении многих микроорганизмов. Было показано, что при одновременном использовании доксициклина и линкомицина, минимальную подавляющую концентрацию каждого антибиотика удается снизить в 2-16 раз в зависимости от вида и штамма микроорганизма. Отмечая перспективность полученных результатов, нами был предложен комплексный антибактериальный препарат на основе доксициклина и линкомицина, разработана его лекарственная форма, проведены необходимые фармакотоксикологические исследования для регистрации лекарственного средства в Российской Федерации.
Соединения тетрациклина нашли активное применение в медицине и ветеринарии, благодаря широкому спектру антимикробного действия. Они высокоактивны в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, риккетсий, некоторых вирусов (44, 65, 76). В низких концентрациях они действуют бактериостатически, и только в высоких дозах оказывают бактерицидное действие. Механизм их влияния объясняется торможением белкового синтеза в микроорганизмах за счет нарушения связывания амино-цил-т-РНК рибосом.
Отдельные тетрациклины различаются по степени антибактериальной активности, фармакокинетики и некоторым фармакологическим свойствам. Доксициклин является одним из наиболее эффективных препаратов тетрациклинового ряда, так как обладает хорошей всасываемостью и длительным сохранением в организме терапевтической концентрации (44, 65).
Изучение фармакокинетики доксициклина и линкомицина в организме птиц при однократном пероральном введении комплексного антибактериального препарата
Проведенные исследования свидетельствуют, что к препарату существует видовая чувствительность и токсические дозы для птиц меньше, чем для грызунов. Так для цыплят по показателю ЛД5о лекарственное средство в 7,7 раза токсичнее, чем для белых мышей.
Разница между максимально переносимой (1350 мг/кг) и суточной терапевтической дозой (14 мг/кг) составляет 1336 мг/кг. При этом терапевтическая широта (отношение LD5o к терапевтической дозе) лекарственного средства составляет 104, то есть даже при случайном передозировании невозможно будет вызвать гибели птицы.
По общепринятым параметрам в соответствии с ГОСТ 12.1.007.76 комплексное лекарственное средство относится к 4 классу опасности - вещества малоопасные (для белых мышей ЛД5о при введении в желудок 5000 мг/кг).
Изучение субхронической токсичности комплексного антибактериального препарата в опытах на белых мышах показало, что при введении лекарственного средства в дозах 1/5 ЛД5о, 1/10 ЛД5о и 1/20 ЛД5о гибели животных не отмечали. Результаты исследования выявили закономерности влияния комплексного антибактериального препарата на рост и развитие мышей. Установлено, что изменения массы тела мышей в течение двадцати дней опыта носило дозозависимый характер. Самые высокие дозы на 21-й день опыта обеспечивали наибольшее увеличение живой массы у животных, что, видимо, связано с наличием в составе лекарственного средства антибиотиков, обладающих стимулирующим действием
Увеличение времени плавания мышей (Р 0,05), получавших наибольшие дозы препарата (1/5 и 1/10 ЛД5о), по сравнению с контролем сразу после окончания опыта может быть связано с мобилизацией защитных сил организма под воздействием антибиотиков.
Еще одним подтверждением увеличения адаптивно-компенсаторных реакций организма на введение препарата стало уменьшение времени медикаментозного сна (таблица 10) в опытных группах по сравнению с контролем. Ускорение метаболизма гексенала в печени мышей, видимо, связано с индуцированием препаратом микросомальных ферментов.
После отмены препарата происходило истощение защитных сил организма, что проявлялось в увеличении времени гексеналового сна и снижении продолжительности времени плавания мышей в группах, получавших лекарственное средство в максимальных дозах.
При оценке безопасности лекарственного средства для птиц при длительном двадцатидневном введении в терапевтической дозе и дозах, превышающих терапевтическую в 2 и 4 раза (соответственно 14, 28 и 56 мг/кг массы тела) гибели птицы не отмечали.
Клиническое состояние цыплят в течение всего опыта находились в пределах физиологической нормы. Птица всех групп была активна, подвижна и охотно потребляла корм. Некоторые отклонения в приросте массы птицы, получавшей препарат в терапевтической дозе, достоверно не отличалось между собой и контрольной группе. В тоже время применение препарата в максимальной дозе приводило в первой половине опыта к достоверному снижению интенсивности роста. Но уже, через 10 суток после отмены лекарственного средства привес цыплят в этой группе хотя и был несколько ниже, но достоверно не отличался от контрольной группы, что свидетельствует об адаптации птицы к повышенной дозе препарата.
Клиническая и биохимическая картина крови цыплят опытных групп, получавших длительный период в течение 20 суток препарат в повышенных и терапевтической дозах, достоверно не отличалась от картины крови птицы опытной группы и соответствовала биологической норме. Физиологический уровень аспартатаминотрансверазы в сыворотке крови опытных цыплят свидетельствует об отсутствии гепатотоксического действия, а уровень мочевины и креатинина в сыворотке крови - об отсутствии нефрототоксического действия препарата.
Некоторые изменения в относительной массе печени и почек цыплят, получавших максимальные дозы препарата, указывают о большой нагрузке пришедшейся на эти органы, связанной с метаболизмом и выделением больших количеств доксициклина и линкомицина из организма.
При оценке кумулятивных свойств учитывали, что суммарно введенная мышам и птицам доза комплексного антибактериального препарата составила соответственно 46000 и 5736 мг/кг массы тела и не приводила к гибели животных. Это не позволило рассчитать коэффициенты кумуляции по показателю «смертельный эффект».
Таким образом, при оценке безопасности комплексного антибактериального препарата при длительном двадцатидневном введении в опытах на лабораторных животных установлено, что максимальные дозы лекарственного средства вызывают обратимые изменения в организме мышей. Применение препарата в дозе 1/20 ЛД5о лабораторным животным и терапевтической, двукратной терапевтической и четырехкратной терапевтической дозе цыплятам не вызывает функциональных изменений в организме животных.
Изучение фармакокинетики доксициклина и линкомицина на цыплятах после однократного введения комплексного антибактериального препарата в терапевтической дозе с водой показало, что действующие вещества быстро всасываются из желудочно-кишечного тракта птицы и распространяются по всем органам и тканям организма.
