Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о патогенезе хронической сердечной недостаточности. Способы патогенетической терапии . 18
1.1 Хроническая сердечная недостаточность как типовой патологический процесс. 18
1.2 Концепции патогенеза ХСН и принципы патогенетической терапии . 21
1.3. Морфорегуляторная (структурная) функция иммунной системы 32
1.4 Дизрегуляция иммунной системы как индикатор и фактор прогрес-сирования деструктивных изменений в органах при хроническом дистрессе . 43
1.5 Использование клеток костного мозга для коррекции сердечной не-остаточности. 56
Глава 2. Общая характеристика клинического материала и методов исследования 64
2.1. Общая характеристика проведенных клинических и лабораторных исследований. 64
2.2. Клиническая характеристика больных ИБС с ХСН, получавших клеточную терапию . 68
2.3 Методы клинического обследования кардиохирургических больных, получающих лечение с применением МНК аутологичного КМ. 71
2.4 Метод индивидуального подбора иммуномодуляторов. 77
2.5 Технология получения, подготовки и применения аутологичных клеток КМ для трансплантации. 81
2.6Двухэтапная сцинтиграфическая визуализация расположения МНК КМ, трансплантированных в миокард. 88
2.7 Обработка материала и статистический анализ 89
Глава 3. Взаимосвязь функционального состояния клеток костного мозга и иммунной системы у больных с хронической сердечной недостаточностью . 90
3.1. Особенности показателей иммунного статуса у больных ХСН. 90
3.2 Характеристика свойств клеток костного мозга у больных с ХСН 96
Глава 4 Разработка способа прогнозирования резервов индивидуальной устойчивости организма к стрессорному воздействию для выбора методаадекватной терапии больных с ХСН . 102
4.1 Описание выполнения способа. 103
4.2 Оценка результатов применения способа 105
Глава 5. Пути восстановления биорегуляторной активности клеток аутологичного костного мозга для повышения терапевтической эффективности применения их у больных ишемической болезнью сердца с хронической сердечной недостаточностью. 112
5.1. Предварительное устранение дисбаланса иммунной системы в организме путем индивидуального подбора и применения иммуномоду-ляторов. 112
5.2 Повышение функциональной активности клеток костного мозга при проведении иммунокоррекции . 134
5.3. Культивирование мононуклеарных клеток костного мозга in vitro как дополнительный способ повышения их функциональной активности. 136
Глава 6 Внутрисердечная гемодинамика, насосная функция сердца и качество жизни больных ишемической болезнью сердца с хронической сердечной недостаточностью при использовании аутоло-гичных мононуклеарных клеток костного мозга предварительно реабилитированных (in vivo и ex vivo). 141
6.1 Этап «пилотных» исследований в клинике. 141
6.2 Этап накопления клинического опыта. Биорегуляторные возможности предварительного культивирования мононуклеарных клеток костного мозга. 153
6.3 Биорегуляторные эффекты применения полностью реадаптирован-ных ККМ путем иммунокоррекции in vivo индивидуально подобранными иммуномодуляторами и культивирования ex vivo в питательных средах (II этап исследования). 168
6.4 Влияние мононуклеарной фракции аутологичных клеток костного мозга на развитие иммунозависимых осложнений у кардиохирургиче-ских больных в после операционном периоде. 178
Заключение 184
Выводы 194
Практические рекомендации 197
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации 199
Список литературы 208
- Концепции патогенеза ХСН и принципы патогенетической терапии
- Клиническая характеристика больных ИБС с ХСН, получавших клеточную терапию
- Характеристика свойств клеток костного мозга у больных с ХСН
- Повышение функциональной активности клеток костного мозга при проведении иммунокоррекции
Введение к работе
Актуальность работы.
Современная статистика заболеваемости населения показывает, что хроническая сердечная недостаточность (ХСН), возникающая чаще всего в результате острого инфаркта миокарда, остается одной из главных проблем здравоохранения всех экономически развитых стран мира, причем в XXI столетии прогнозируется дальнейший рост численности таких больных [Hunt et al. 2005].
По данным американской ассоциации кардиологов в 2005 г. в США насчитывалось около 5 млн. человек с ХСН, тогда как по прогнозам к 2050г количество таких больных возрастет до 16 млн. человек [Robbins, 1998]. В России исследование «Эпоха» показало, что клинические признаки ХСН имеют более 8,2 млн. человек [Беленков Ю.Н. и др 2003].
В настоящее время для профилактики и лечения сердечной недостаточности используются 3 группы методов [Kirklin, Young , 2002], которые обеспечивают:
1- профилактику тромбозов и торможение развития атеросклероза путем применения диеты, медикаментозной терапии и пропаганды здорового образа жизни;
2- ограничение зоны повреждения и сохранения функциональной активности работоспособной зоны миокарда путем медикаментозной терапии (антиаггреганты, -блокаторы, ингибиторы ангиотензин превращающего фермента (АПФ)) и оперативного лечения (баллонная коронарная ангиопластика, операция аортокоронарного шунтирования);
3- замену несостоятельности сократительной функции сердца путем трансплантации сердца или имплантации искусственных аналогов левого желудочка.
Однако перечисленные методы не могут в полной мере снизить рост заболеваемости и обеспечить адекватную социальную адаптацию этих больных.
В связи с этим в последние годы получило развитие новое направление регенерационной терапии, направленное на стимуляцию регенерации миокарда путем возмещения дефицита функционально-активной ткани и/или стимуляции ее компенсаторной гипертрофии, а также стимуляции ангиогенеза с помощью современных клеточных технологий.
Трансплантация в миокард мышечных клеток – фетальных кардиомиоцитов [Sakai et al. 1999; Ю.Л. Шевченко 1999], скелетных миобластов [Atkins et al. 1999; Taylor et al. 1998; Reinecke et al. 2000], а также гладкомышечных клеток [Yoo et al. 2000, Li et al. 1996] не подтвердила заместительного механизма регенерационного действия этих клеток, но позволила выдвинуть концепцию биорегуляторного воздействия пептидов, продуцируемых трансплантированными клетками.
Именно поэтому предметом пристального изучения стали возможности восстановительной регенерации миокарда с помощью доступных и легитимных аутологичных стволовых и прогениторных клеток костного мозга (ККМ).
В настоящее время эти клетки, преимущественно клетки гемопоэтической фракции ККМ, используются для лечения острой [Straer et al. 2001-2003; Schachinger et al. 2004; Assmus et al. 2003] и хронической [Perin et al. 2004; Patel et al. 2004; Lian Ru 2006] сердечной недостаточности.
Улучшение насосной функции сердца после терапии аутологичными мононуклеарными ККМ авторы связывают преимущественно с обновленной продукцией в организме больных проангиогенных и антиапоптических цитокинов [Kinnaird et al., 2004; Dimmeler et al., 2004; Kocher et al., 2001], с регуляцией воспаления и иммунной модуляцией [Dewald et al., 2005; Thum et al., 2005], с улучшением внутриклеточной регенерации кардиомиоцитов и повышением их устойчивости к апоптозу [Minatoguchi et al., 2004; Trial et al., 2004; Chazaud et al., 2003], а также с их влиянием на пролиферацию кардиомиобластов [Anversa, 2004].
Между тем, наряду с позитивной оценкой применения ККМ у больных с ХСН в последние годы появились исследования, которые отрицают возможность улучшения сократительной функции левого желудочка у таких больных при использовании аутологичных мононуклеарных клеток костного мозга.
Отсутствие позитивного эффекта от применения аутологичных ККМ авторы этих исследований связывают с изменением состава и свойств стволовых и прогениторных ККМ больных под влиянием различных тяжелых сопутствующих заболеваний [Rota et al., 2006; Award et al., 2006; Rauscher et al., 2003; Karra et al., 2005; Messina, 2006; Lehrke et al., 2006; Gina et al., 2006; Sata, 2006; Epstein et al., 2004].
Создается впечатление, что в практике лечения ХСН разные исследователи применяют ККМ с разными и даже противоположными свойствами.
Для выяснения причин отсутствия у отдельных категорий больных позитивного эффекта от введения мононуклеарных (МНК) ККМ, мы предположили, что при ХСН как хроническом заболевании [Гольдберг Е.Д. и др. 2006] на фоне системного воспаления [Шевченко О.П. и др. 2005], и сопутствующего вторичного иммунодефицита различной степени выраженности [Ермакова Л.П., 2001], а также хронической гипоксии у больных формируется функциональная недостаточность самих гемопоэтических и иммунорегуляторных клеток КМ, которую необходимо диагностировать и корригировать до использования клеток КМ (мононуклеарной фракции клеток) в качестве терапевтического средства.
Разработать методы диагностики и коррекции функциональной активности клеток костного мозга для обеспечения стабильного позитивного эффекта клеточной трансплантации на сократительную функцию сердца и качество жизни у больных с хронической сердечной недостаточностью.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Изучить возможность применения мононуклеарных клеток (МНК) аутологичного костного мозга в качестве эффективного вспомогательного метода коррекции сократительной функции миокарда и повышения качества жизни у больных с хронической сердечной недостаточностью; выявить факторы, препятствующие реализации этих эффектов.
-
Выявить нарушения функционального состояния МНК костного мозга и их взаимосвязь с дисфункцией клеток иммунной системы периферической крови, развивающейся у больных ХСН.
-
Разработать метод индивидуальной оценки резервов функциональной устойчивости клеток иммунной системы периферической крови больных ХСН и предложить тест для прогнозирования клинической эффективности трансплантации аутологичных клеток костного мозга.
-
Разработать и применить метод индивидуального подбора иммунномодуляторов для восстановления функциональной активности иммунной системы больных ХСН (клеток костного мозга и периферической крови), обеспечивающей реализацию позитивного клинического эффекта трансплантации ККМ.
-
Показать возможность оптимизации клинического эффекта трансплантации аутологичных ККМ у больных ХСН путем 2-х этапного восстановления иммуно-биорегуляторной активности ККМ перед трансплантацией: за счет осуществления медикаментозной коррекции иммунного статуса больных in vivo и последующей активации функционального состояния МНК костного мозга in vitro при их культивировании.
-
Установить клиническую эффективность трансплантации аутологичных клеток костного мозга у больных с терминальной стадией хронической сердечной недостаточности.
-
Изучить влияние интраоперационной интрамиокардиальной трансплантации клеток костного мозга на частоту и тяжесть развития послеоперационных иммунозависимых осложнений.
Научное исследование было проведено в рамках государственного контракта № 02.435.11.3019 от «02»сентября 2005г «Использование стволовых клеток костного мозга для подержания функции сердца и поджелудочной железы» и выполнено по заказу Минздравсоцразвития РФ (регистрационный номер 0120.0 800279).
Впервые показано, что у больных с ХСН, нуждающихся в хирургической коррекции сократительной функции миокарда, состояние иммунной системы характеризуется не только вариабельными формами апоптотического иммунодефицита, но также снижением функциональной активности мононуклеарной фракции клеток костного мозга, что предопределяет отсутствие клинического эффекта от применения клеток костного мозга.
Установлено, что способность мононуклеарных клеток костного мозга к колониеобразованию находится в прямой зависимости от содержания CD25 и в обратной зависимости от содержания СD95 лимфоцитов в периферической крови.
На основании сопоставления интенсивности продукции активных форм кислорода (АФК) нативными лейкоцитами крови без и при добавлении ингибитора цАМФ фосфодиэстеразы был предложен критерий, так называемый индекс стимуляции (ИС), для прогнозирования адаптационных резервов иммунной системы и оценки пригодности клеток костного мозга для целей клеточной терапии. Установлено, что у здоровых людей численное значение ИС больше 1.0, при выраженной патологии ИС становится меньше 1.0. Было предложено использовать индекс стимуляции для оценки степени тяжести иммунодефицита в организме, а также для подбора иммунокорректоров и контроля эффективности проводимой иммунокорригирующей терапии. Новизна указанных разработок подтверждена положительными решениями о выдаче 5 патентов (положительные решения от 7.05.2007, 29.08.2007, 28.09.2007, 03.08.2007, 03.12.2007).
Установлено, что при значении ИС<0.6 и необходимости выполнения хирургической операции у больных возникает опасность возникновения тяжелых иммунозависимых осложнений в виде инфекционно-септических и органных дисфункций вплоть до развития полиорганной недостаточности.
Показано, что наиболее выраженная коррекция сократительной функции миокарда и улучшение качества жизни больных при использовании клеточной терапии достигается путем сочетанного предварительного применения индивидуально подобранной иммунокорригирующей терапии in vivo и культивирования выделенных клеток в питательных средах ex vivo перед введением их в миокард. При сочетанном применении этих процедур создаются оптимальные условия для восстановления биорегуляторной функции клеток костного мозга и клеток периферической крови, что создает условия для полной реализации регенерационных эффектов иммунной системы, как важнейшей интегративной системы регуляции гомеостаза.
Культивирование клеток костного мозга без предшествующей иммунокоррекции позволяет повысить их функциональную активность, что сопровождается изменением фенотипического состава клеток и продукцией цитокинов в культуральную среду. Однако регуляторные эффекты таких клеток после трансплантации являются недостаточными особенно у больных с выраженным иммунодефицитом.
Однократный курс иммунокоррекции без последующей трансплантации клеток, также не позволяет добиться выраженной и пролонгированной коррекции функции миокарда у больных ХСН.
Интраоперационное использование аутологичных ККМ как после культивирования, так и после культивирования в сочетании с иммунокоррекцией оказывает выраженное иммуномодулирующее действие, что проявляется снижением иммунозависимых осложнений в послеоперационном периоде, таких как гнойно-септические осложнения и полиорганная недостаточность даже при наличии инфекционно-септического анамнеза.
Создана медицинская технология лечения больных ХСН с помощью МНК аутологичного костного мозга. Технология предусматривает контроль степени иммунной дизрегуляции в организме больных, предварительное проведение иммунокоррекции индивидуально подобранными препаратами in vivo и последующее культивирование клеток костного мозга ex vivo. Такая технология предварительной подготовки ККМ позволяет повысить сократительные свойства миокарда (увеличение ФИ и снижение КДО и КСО), а также улучшить качество жизни больных ХСН (индекс MLHFQ) и повысить их физическую активность (индекс DASI).
Предложен метод оценки степени иммунной дизрегуляции, основывающийся на определении активности лейкоцитарной суспензии в хемилюминесцентном тесте, отражающем состояние суммарных адаптационных резервов организма у больных с ИБС и ХСН. Этот показатель назван индексом стимуляции, величина его коррелирует с уровнем иммунодефицита и поэтому может использоваться для быстрой диагностики иммунной дизрегуляции. Этот показатель использован также для индивидуального подбора иммунокорректоров и контроля эффективности терапии иммуномодуляторами. Установлено, что при ИС<0.6 у больного прогнозируется выраженный иммунодефицит, сопровождающийся опасностью развития инфекционных осложнений и отсутствием эффекта от клеточной терапии. Именно таким больным должна заблаговременно проводится курсовая иммунокорригирующая терапия.
При проведении у больного полного комплекса подготовки иммунной системы и клеток костного мозга эффективность клеточной терапии достоверно повышается и сохраняется в течение 6 месяцев. Безопасность клеточной терапии позволяет рекомендовать повторные курсы клеточной терапии у больных ХСН для восстановления и поддержания сократительной функции миокарда.
Интраоперационное введение клеток костного мозга снижает летальность кардиохирургических больных и частоту развития иммунозависимых послеоперационных осложнений, а также способствует гладкому течению госпитального периода.
-
Трансплантация аутологичных клеток костного мозга достоверно повышает сократительную функцию миокарда и улучшает качество жизни у больных хронической сердечной недостаточностью, только после предварительного осуществления коррекции иммунной дизрегуляции в организме и последующего культивирования in vitro клеток костного мозга.
-
Использование индекса стимуляции позволяет оценивать адаптационные резервы организма и может быть использован для индивидуального подбора иммунокоррегирующих препаратов.
-
Интрамиокардиальное введение клеток костного мозга во время операции аортокоронарного шунтирования достоверно снижает частоту развития послеоперационных инфекционных осложнений и летальность больных с хронической сердечной недостаточностью.
Основные выводы и рекомендации используются в практической и научной работе отделения коронарной хирургии и трансплантации сердца ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехнологии.
Апробация работы
Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены: на IX, X, XI, XII Всероссийских съездах сердечно-сосудистых хирургов (Москва 2003, 2004, 2005, 2006 годы соответственно); на конференции «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)» (Москва 2002); на VIII Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2004; на V Ежегодной конференции «Сердечная недостаточность» (Москва, декабрь 2004); на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, ноябрь 2004); на II-ой международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, апрель 2004); на IX и X Всероссийском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2002, 2003); Ежегодных Всероссийских и международных научных конференциях «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва май 2006, май 2007); на II и III Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, октябрь 2002, ноябрь 2005); на четвертой межд. конф. “Лечение кардиомиопатий”, (Москва, 27-28 мая 2005г.); на XIII сессии общего собрания РАМН (Москва, 17-20 Февраля 2004г.); на 1 межд. конф.“Альтернативные методы реваскуляризации миокарда“, (Москва, 5 апреля 2004г.); на 13th World congress of Heart Disease , International academy of cardiology annual scientific sessions 2007, Vancouver, B.C., Canada, July 28-31, 2007. Апробация работы состоялась на межлабораторной научной конференции ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехнологии 5 февраля 2008г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 37 работ, из них 22 в центральной периодической печати. 13 работ в материалах всероссийских и 1 в материалах зарубежной конференций. Получено положительные решения по 5 патентам.
Объем и структура диссертационной работы
Диссертация содержит 7 глав и состоит из введения, обзора литературы (I глава), общей характеристики проведенных лабораторных и клинических исследований (II глава), 4 глав собственных исследований (главы III, IV, V, VI) с одновременным обсуждением полученных результатов, а также развернутого заключения (глава VII), выводов и практических рекомендаций.
Диссертация имеет библиографический указатель, который содержит 292 источников, включающих в себя 145 отечественный и 147 зарубежный источник. Работа изложена на 240 страницах машинописного текста, содержит 44 таблицы и 34 рисунка.
Диссертация выполнена в отделении коронарной хирургии и трансплантации сердца (руководитель – профессор, д.м.н. Э.Н. Казаков), а также в лаборатории биотехнологии стволовых клеток (руководитель – профессор, д.м.н. Н.А. Онищенко); при научном сотрудничестве с отделениями Института: иммунодиагностики и иммунокоррекции (руководитель – профессор, д.м.н. В.С.Сускова); радиоизотопной диагностики - профессор, д.м.н. Е.Н. Остроумов (руководитель - профессор, д.м.н. А.Е. Ермоленко); рентгенфункциональной диагностики – И.Ю. Тюняева и д.м.н. Б.Л. Миронков (руководитель - профессор, д.м.н. Честухин В.В.), а также другими отделениями и лабораториями ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехнологии.
Концепции патогенеза ХСН и принципы патогенетической терапии
На самом раннем этапе, который приходится на 30-70 годы XX столетия, интенсивно разрабатывались кардиоренальная и гемодинамическая концепции патогенеза ХСН (Сычева И.М., Виноградов А.В. 1977). Сущность кардиоренальной концепции сводилась к неспособности сократительной функции сердца обеспечить адекватное периферическое кровообращение в организме, следствием чего являлось снижение почечного кровотока и повышение венозного давления с задержкой в тканях натрия и воды. Кардиоренальная концепция обосновывала применение сердечных гликозидов и диуретиков в качестве основных средств патогенетической терапии ХСН. Гемодинамическая концепция связывала прогрессирование ХСН с периферической вазоконстрикцией и увеличением пред- и постнагрузки на сердце, результатом чего явилось дополнительное внедрение в практику лечения больных ХСН периферических вазодилататоров (Paley et al. 1965).
В последние 20-30 лет в связи с развитием медико-биологических представлений о факторах регуляции гомеостаза организма особым вниманием стала пользоваться нейрогуморальная концепция прогрессирования ХСН, в которой ведущую роль активации отводили: ренин-ангиотензин-альдостероновой (РААС) и симпатоадреналовой (САС) системам, а также изменению продукции антидиуретического гормона и предсердного натрийуретического пептида.
Ренин-ангиотензин-альдостероновая система (РААС) активируется при ХСН для поддержания системного АД и достаточного кровотока в жизненно важных органах - головной мозг, сердце, почки, печень. Основным компонентом этой системы являются ангиотензин II (А-П), высокий уровень которого обеспечивает адекватность гемодинамики в организме за счет: вазоконстрикторного действия на вены и артерии, стимуляции синтеза и секреции альдостерона в коре надпочечников и катехоламинов из мозгового вещества надпочечников, за счет влияния на реабсорбцию натрия в дистальных отделах почечных канальцев, а также повышения секреции кортикотропина и вазопрессина из гипофиза (Cleland et al. 1997).
Кроме того, А-П оказывает митогенное и стимулирующее действие на рост фибробластов, а также участвует в процессах гипертрофии, гиперплазии и ремоделирования миокарда; кроме того А-П принимает участие в индуцировании процессов клеточного апоптоза (Cook, Poole-Wilson, 1999). Широкие колебания РААС у больных ХСН (по содержанию А-П и ренина) в зависимости от их клинического состояния позволяют считать эту систему активным участником процессов компенсации и декомпенсации миокарда. В роли пролонгированного активатора РААС выступает активация симпато-адреналовой системы.
Симпатоадреналовая система (САС) - активируется в организме в ответ на снижение сердечного выброса (в результате дисфункции левого желудочка), которое ведет к снижению АД и одновременно усиливает раз дражение барорецепторов, которые усиливают симпатическую стимуляцию и повышают активность РААС. Следствием активации этих систем становится: тахикардия, вазоконстрикция, повышение сократимости миокарда, задержка Na+ и воды почками, которые вызывают гиперволемию, повышение давления наполнения сердца, повышение пред- и постнагрузки на миокард и как следствие повышение метаболической нагрузки, что способствует прогрессированию сердечной недостаточности (Ольбинская Л.И., Игнатенко СБ., 2000; Middlekauff 1997; Mortara et al. 1997).
В условиях длительной гиперактивации САС наступает нивелирование положительных эффектов активации этой системы, и сердце в значительной мере утрачивает способность адекватно реагировать на эндо- и экзогенные катехоламины (Fowler 1998); активация САС сопровождается повышением потребности миокарда в 02 и становится фактором развития его ишемии; способствует развитию тахикардии и ведет к депрессии силы сокращения, снижает количество и плотность Рі-адренорецепторов и потому снижает чувствительность кардиомиоцитов и катехоламинам, а также повышает уровни ренина и А-П. Катехоламины оказывают прямое токсическое действие на миокард, что выражается накоплением в клетке Са2+, iNOs, усилением апоптоза, а также усилением напряженности окислительно-восстановительных процессов и снижением их эффективности (Ольбинская Л.И., Сизова Ж.И. 2001; Smith et al. 1994).
Примечательно, что при прогрессировании ХСН наступает хроническая активация САС и устанавливаются стабильно высокие уровни катехо-ламинов в крови, что обусловлено не только снижением сердечного выброса, но и снижением чувствительности барорецепторов сердца и аорты к снижению АД (Anker et al. 1997).
Для снижения избыточной активности САС рекомендуется использование препаратов из группы р-адреноблокаторов или а-адреностимуляторов, однако эта терапия не может предотвратить форми рование порочного круга нейрогуморальних изменений, развивающихся при ХСН.
Избыточная секреция антидиуретического гормона (АДГ) возникает на поздних стадиях ХСН (Ольбинская Л.И., Ингатенко СБ., 2000) как результат сложного дизрегуляционного взаимодействия активированных нейрогормональных и депрессивных гемодинамических факторов. Стимуляция секреции АДГ (или вазопрессина) гипоталамусом наступает в ответ на повышение осмолярности плазмы (за счет задержки Na+), снижение К плазмы и высокую активность РААС (повышение А-П) и САС (повышение адреналина); секреция АДГ вызывает задержку жидкости в организме и увеличение ее внеклеточного объема при одновременном повышении экскреции Na+ с мочой (синдром гипонатриемии разведения).
Глубокий электролитный дисбаланс (гипокалиемия, гипокальцие-мия, гипонатриемия разведения) задержка и возросшая периферическая ва-зоконстрикция в условиях повышенной секреции АДГ становятся факторами дальнейшего прогрессирования ХСН из-за повышения пред- и постнагрузки на миокард. Применение р-блокаторов, также как а-адреностимуляция ингибирует секрецию АДГ (Ольбинская Л.И., Сизова Ж.И.,2001).
Клиническая характеристика больных ИБС с ХСН, получавших клеточную терапию
Поиск путей повышения клинической эффективности терапии ауто-логичными ККМ (с улучшением насосной функции сердца и позитивным ремоделированием миокарда) включал 3 этапа.
Длительность ИБС в среднем не превышала 25+11 мес, ХСН 14+3 мес. Более чем у половины больных были сопутствующие заболевания (гипертония 61%, у 40%) больных встречались различного типа аритмии), которые способствуют дополнительному повреждению сердечнососудистой системы и создают дополнительные препятствия для реализации позитивных терапевтических эффектов клеточной терапии.
Практически все больные получали медикаментозную поддерживающую терапию (сердечные препараты -100%, диуретики 32% от всех больных). Таблица 6 Общая клиническая характеристика больных, отобранных на трансплантацию МНК аутологичного костного мозга в I, II и III этапах ис следования. (п=156). Параметр Численные значения Возраст 51 + 3,2 Количество ИМ 1,6+0,6 ФК ХСН по NYHA 2,5+0,3 ФК стенокардии 3+0,3 ББИ (безболевая ишемия) 15% Длительность ИБС,мес. 25+11 Длительность ХСН,мес. 14+3 Индекс DASI, баллы 35,7±3,8 Артериальная гипертония, 61% Синусовый ритм 100 % Наджел. экстрасистолы 26% Жел. экстрасистолы 14% р- блокаторы 100% Диуретики 32% Кор. ангиполастика 9% Включение в лист на ТС 16 Для контроля эффективности клеточной терапии у больных с хирургической коррекцией ишемических нарушений миокарда (АКШ) исследование было проведено в двух группах больных: у больных с АКШ (п=50) и АКШ+ККМ (п=89). В таблице 7 дана характеристика клинического состояния больных этих двух групп, из которой следует, что достоверные различия в исходном состоянии сравниваемых групп больных отсутствовали.
Обследование больных проводилось по утвержденному протоколу, который включает перечень общеклинических и специальных методов исследования. Клинический осмотр кардиолога, гастроэнтеролога, нефролога, оториноларинголога и стоматолога. Общий анализ крови и мочи, изучение свертывающей системы крови - тромбоциты, протромбиновый индекс, фибриноген, фибринолитичес кая активность крови, калий и натрий плазмы крови, биохимические ис следования крови - креатинин, мочевина, конъюгированный и неконъю гированный билирубин, АсАТ, АлАТ, ЩФ, общий белок и фракции, об щий холестерин, липопротеиды высокой и низкой плотности, триглице риды, глюкоза крови. Микробиологические исследования: - посев культур из носоглотки, крови и мочи на бактериальную, вирусную и грибковую микрофлору; - определение титров специфических антител к цитомегаловирусу, вируса herpes simplex; - определение серологических маркеров гепатита В и С. Рентгенографическое исследование органов грудной клетки. Гастроскопия. Ультразвуковое исследование печени, желчного пузыря, поджелудочной железы и почек. 2.3.2 Методы оценки кардиологического статуса больных. Методы включали проведение: электрокардиографическое исследование в 12 отведениях; суточное мо-ниторирование ЭКГ и электрофизиологическое исследование при сложных нарушениях ритма. эхокардиографическое исследование в М-и двухмерном режиме; до-плер-эхокардиографическое исследование. зондирование правых и левых отделов сердца. коронарография. рентгеноконтрастная вентрикулография. радиозотопные исследования сердца. внутрисердечные исследования выполнялись по специальной программе, включающей ретроградную катетеризацию правых и левых отделов сердца с регистрацией кривых внутриполостного давления, левую вент-рикулографию и селективную полипроекционную коронарографию.
При этом рассчитывались следующие гемодинамические показатели: давление в правом предсердии (ДПП), систолическое и среднее давление в легочной артерии (ДЛАсисъ ДЛАср), давление заклинивания в легочном капилляре (ДЗЛК), транспульмональный градиент (ТПГ) - разница ДЛАсист.
Функциональный класс стенокардии оценивали по классификации Канадской ассоциации кардиологов (Захаров В.Н., 2001).
Функциональный класс хронической сердечной недостаточности по Международной (Нью-Йоркской) классификации кардиологов (Ольбин-ская Л.И., Сизова Ж.М., 2001). Физическую активность и качество жизни больных оценивали по: - 6-минутному тесту; - по индексу физической активности (The Duke Activity Status Index-индекс DASI) в баллах (Таблица 8); - показателю качества жизни больных ХСН (Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire - MLHFQ) в баллах (Таблица 9).
Характеристика свойств клеток костного мозга у больных с ХСН
Еще в 1983 году был описан т.н. гематологический дистресс синдром, развивающийся у больных с длительным хроническим повреждением тканей, не относящихся к системе крови (Elsev 1983; Reizenstein 1983). Было выдвинуто предположение, что ведущими факторами его развития в ответ на хроническую гипоксию являются избыточная активность макрофагов и дизрегуляция Т-лимфоцитов костного мозга, которые вместе со стромальными механоцитами формируют гемопоэзиндуцирующее микроокружение (Попугайло М.В. 1979; Васильев Н.В. и др. 1992; Гольдберг Е.Д. идр.2006).
Проведенный нами анализ состояния иммунной системы крови у больных ХСН выявил, как уже указывалось выше (раздел 3.1), избыточную активацию клеток моноцитарно-макрофагальной системы и дизрегу-ляцию лимфоидного, преимущественно Т-клеточного звена в организме. На основании этих результатов, мы имели все основания полагать, что развитие ХСН у больных ИБС сопровождается адаптивными перестройками функциональной активности клеток костного мозга, и прежде всего, моно-нуклеарных клеток, которые формируют гемопоэзиндуцирующее микроокружение.
Однако, в костном мозге пациентов с ИБС была отмечена тенденция к увеличению числа ретикулоцитов и эритробластов, причиной которой может быть гипоксия тканей, развивающаяся при хронической сердечной недостаточности.
Кроме того, нами была отмечена тенденция к увеличению количества лимфоцитов в костном мозге, причиной которого может быть адаптационное усиление их миграции в костный мозг при стрессе (Дыгай A.M., Клименко Н.А. 1992) и перераспределение фенотипического состава клеток (повышение CD8+ клеток, таблица 16), а также наступающее нарушение процессов межклеточного взаимодействия.
Свидетельством этого может служить накопление провоспалительных цитокинов, общее снижение лимфоцитов крови и резкое снижение Т-лимфоцитов, в особенности клеток CD25+, несущих ИЛ2-рецептор, которые регулируют гранулопоэз, а также способность мононуклеарных клеток костного мозга к колониеформированию (Estrov et al. 1987).
Нами не выявлено также достоверных различий в соотношении клеточных популяций в свежевыделенной фракции МНК этих больных, что может быть связано с отсутствием выраженных структурных изменений в костном мозге (таблица 17).
Проведенные нами исследования показали, что функциональное состояние клеток иммунной системы оказывает сильное влияние на проли-феративную способность клеток костного мозга, причем, чем больше показатели иммунной системы (CD25+, CD95+) приближаются к норме, тем выше становится функциональная активность мононуклеарных клеток костного мозга.
При высокой степени иммунной дизрегуляции функциональная активность ККМ оказывается резко сниженной.
На рисунке 7 и 8 можно также видеть, что в функциональном состоянии МНК КМ существует индивидуальные варианты отклонения пролифера-тивной активности клеток у разных больных даже при одинаковых или близких значениях исследуемых показателей иммунной системы.
Эти результаты позволяют нам заключить, что у больных ИБС с ХСН функциональная активность ККМ определяется степенью иммунной дизрегуляции, а также вариабельностью индивидуальных отклонений в функциональном состоянии ККМ.
Таким образом, сочетано проведенные исследования функционального состояния иммунной системы и клеток костного мозга позволили установить, что больные ИБС с хронической сердечной недостаточностью имеют: вариабельный иммунодефицит апоптотического типа; вариабельный характер снижения функциональной (пролиферативной) активности моно-нуклеарных клеток костного мозга; высокую корреляционную связь между нарушением в крови содержания CD25+ и CD95+ иммунных клеток и сопутствующей пролиферативной активностью МНК КМ.
Результаты приведенного исследования означают, что: - у больных ИБС с резкой дисфункцией иммунной системы и сопутствующим снижением функциональной активности ККМ - высокая вероятность, что эффект от терапевтического применения мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга будет снижен или отсутствовать; - для прогнозирования результатов терапии аутологичными МНК у больных ХСН должен быть разработан и использован информативный метод, основывающийся на предварительной индивидуальной оценке общих адаптационных резервов организма по состоянию биологической реактивности клеток иммунной системы; - под контролем разработанного биологического теста должен быть разработан метод повышения адаптационных резервов организма, в том числе иммунной системы и костного мозга, что позволит повысить биологические регуляторные возможности аутологичных клеток КМ для эффективной терапии ХСН.
Повышение функциональной активности клеток костного мозга при проведении иммунокоррекции
Из таблицы 23 следует, что индивидуально подобранная иммунокоррекция у больных ИБС способствует повышению уровня Т-лимфоцитов в крови, несущих рецептор к ИЛ2, способствует пролиферации этих клеток и повышает продукцию колониестимулирующих факторов, кроме того, в крови снижается уровень CD95- клеток (Verma et al. 1979). Т.е. нивелируется иммунная дизрегуляция апоптотического типа и восстанавливается эффекторные функции лимфоцитов, которые в свою очередь способствуют повышению функциональной активности клеток костного мозга (Estrov et al. 1987).
Известно (Burgess et al. 1978), что наиболее информативным показателем функциональной активности ККМ является колониеформирующая активность мононуклеарных клеток (МНК) костного мозга. Именно поэтому мы сопоставили изменения фенотипического состава (отдельных популяций лимфоцитов) клеток иммунной системы периферической крови и изменения уровня провосполительных цитокинов в ней под влиянием индивидуально подобранной иммунокорригирующей терапии с изменением колониеформирующей активности МНК костного мозга.
Оказалось (таблица 28), что индивидуально подобранная иммуно-коррекция приводит к увеличению содержания CD25+ клеток, снижению уровня апоптотических лимфоцитов (CD95), уменьшению уровня провос-полительных цитокинов, но не приводит к достоверному увеличению числа колониеформирующих единиц, при культивировании МНК.
Отсутствие достоверных различий в количестве колониеобразующих единиц у больных в КМ как до, так и после иммунокоррекции по сравнению с контролем (здоровые доноры) мы связывали с вариабельностью вторичного иммунодефецита апоптотического типа у этих больных и с отсутствием индивидуального контроля степени иммунокоррекции.
Использовав для оценки адекватности иммунокоррекции разработанный нами показатель - индекс стимуляции (ИС) в хемилюминесцент-ном тесте (глава IV) мы сопоставили содержание клеток CD25+, CD95+ и количество колониеформирующих единиц в свежевыделенных МНК костного мозга в зависимости от значений ИС лейкоцитарной суспензии крови этих больных через 14 суток после иммунокоррекции. Из таблицы 29 видно, что там, где иммунокоррекция была эффективной (ИС 1.0) такие показатели функциональной активности МНК как CD25+, CD95+ и количество колониеформифующих единиц не отличаются от значений здоровых доноров. Если ИС остается, несмотря на иммуно-коррекцию, меньше единицы значении CD25+, CD95+ и количество коло-ниеформирующих единиц достоверно отличается от здоровых доноров и свидетельствует о сохраняющемся ингибировании ККМ. Такие клетки после трансплантации их больным окажутся не эффективными.
Для восстановления гомеостаз-регулирующих функций ККМ, а также для восстановления силы и качества регенераторных сигналов, посылаемых этими клетками в очаги повреждения важно, прежде всего, вывести ККМ из-под воздействия инибирующих и токсических факторов, циркулирующих в крови больного, путем культивирования в питательных средах ex vivo (или in vitro).
Процесс восстановления биорегуляторной активности МНК КМ нами контролировалася по изменению фенотипического профиля клеток до и после культивирования.
Однако, степень выраженности возникающих изменений после культивирования была различной и коррелировала с клиническим эффектом терапевтического применения этих клеток и уровнем ИС лейкоцитарных клеток этого больного. Из рисунка 19-В видно, что изменения фенотипического состава ККМ после культивирования были не выраженными, а содержание клеток - носителей CD3, CD8 антигенов - непременных участников регенераторного процесса оказалось даже сниженным. У этого больного с тяжелой хронической сердечной недостаточностью клинический эффект на применение аутологичных культивированных клеток был слабо выраженным и этот эффект соответствовал ИС 1.0. У другого больного, также с хронической сердечной недостаточностью (рисунок 19 А), ККМ отреагировали на культивирование резким увеличением практически всех популяций клеток, а после применения этих клеток у больного был получен отчетливо выраженный позитивный клинический эффект (ИС его лейкоцитов был 1.0). Считаем важным также подчеркнуть, что различия в клинической эффективности от применения культивированных клеток сопровождались соответствующими различиями в иммунном статусе этих больных, которые коррелировали со значением ИС. Объяснением полученных результатов могут служить различия в функциональной активности аутологичных мононуклеарных клеток в процессе культивирования. Оказалось (рис 20), что у больного с позитивной клинической реакцией на введение ККМ, наступали не только отчетливые количественные изменения в популяционном составе клеток, но и резко увеличивалось в культуральной среде содержание TGF-J3 и G-CSF. У больного с отсутствием выраженной позитивной реакции на введение аутологичных ККМ - накопление цитокинов в культуральной среде было незначительным также как и изменение в фенотипическом составе клеток после культивирования (рис 20).
