Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Особенности нарушения высшей нервной деятельности при интоксикации гамк-антагонистами и возможные пути их медикаментозной коррекции (обзор литературы) 12
1.1. Современные представления о роли ГАМК-ергической нейромедиаторной системы в осуществлении функций ЦНС и формировании патологического поведения 12
1.2. Токсикологическая характеристика блокаторов ГАМК-зависимых хлорионофоров 21
1.3. Теоретическое обоснование выбора фармакологических препаратов, применяемых для восстановления высшей нервной деятельности лабораторных животных после отравлений блокаторами ГАМК-зависимых хлор-ионных каналов 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Материалы исследования 39
2.2. Методы исследования
2.2.1 Определение острой токсичности : 43
2.2.2 Экспериментальная оценка высшей нервной деятельности лабораторных животных 43
2.2.3 Биохимические методы 50
2.2.4 Математическая обработка экспериментального материала
ГЛАВА 3. Дозозависимые особенности нарушения высшей нервной деятельности при остром отравлении норборнаном 53
3.1. Проявления экспериментальной картины интоксикации... 53
3.2. Изменения безусловно-мотивационной деятельности 56
3.3. Изменения мнестических функций 60
ГЛАВА 4. Процессы липидной пероксидации и углеводно-энергетического обмена при интоксикации норборнаном 66
4.1. Перекисное окисление липидов и система антиоксидантной защиты 67
4.2. Углеводно-энергетический обмен 73
ГЛАВА 5. Экспериментальная оценка влияния исследуемых фармакологических препаратов на восстановление дееспособности при интоксикации норборнаном 77
5.1. Влияние фармакологических средств на мнестические функции грызунов при интоксикации норборнаном 78
5.2. Влияние мексидола и этомерзола на углеводно энергетический обмен и процессы липидной пероксидации при интоксикации норборнаном 84
5.3. Влияние мексидола и этомерзола на безусловно мотивационная деятельность грызунов при интоксикации
норрборнаном 95
Заключение 99
Выводы 111
Список литературы
- Токсикологическая характеристика блокаторов ГАМК-зависимых хлорионофоров
- Определение острой токсичности
- Изменения безусловно-мотивационной деятельности
- Углеводно-энергетический обмен
Токсикологическая характеристика блокаторов ГАМК-зависимых хлорионофоров
Следует отметить особую роль ГАМК-ергической системы в развитие судорожного синдрома при различных патологических состояниях и заболеваниях ЦНС (Софронов Г.А. и соавт., 1992; Chapman A.G.et al., 1983; Крыжа-новский Г.Н., 1991,1997; Зенков Л.Р., 2002; Карлов В.А., 2003). Установлено, что нарушение разных звеньев ГАМК-ергического тормозного контроля, как правило, вызывает развитие судорог или повышение судорожной готовности у лабораторных животных (Головко А.И., 1994). Так, например, пенициллин, являясь селективным антагонистом ГАМК-ергического торможения снижает плотность ГАМК- рецепторов. Судорожные эффекты тиосемикарбазида обусловлены торможением активности глутаматдекарбоксилазы и последующим снижением синтеза ГАМК в мозгу. Бикукуллин конкурентно блокирует связывание ГАМК с рецепторами. Конвульсивная активность коразола, норбор-нана и бициклофосфата (БЦФ) обусловлена их блокирующим действием на проводимость хлор-ионного канала (ХИК) ГАМК-бензодиазепин-рецепторно-ионофорного комплекса.
Повышенное содержание ГАМК в ЦНС, в частности в коре мозга, вызывает активацию нормального механизма сна (Мосолов С.Н.,1996). Показано участие некоторых продуктов обмена ГАМК в нервной системе в регуляции сна, в частности - Y-оксимасляной кислоты. Применение в клинической практике гаммаоксимасляной кислоты (ГОМК) и фенибута вызывает у больных с неврозами увеличение продолжительности сна и его нормализацию.
При изучении рефлекторной деятельности было показано значение ГАМК-ергической тормозной системы в формировании соматических рефлексов; отмечалось облегчение сгибательного и чесательного рефлексов при использовании ГАМК-ергических антагонистов, таких как пикротоксин и бикукуллин (Георгиев В.П., 1980; Баев К. и соавт., 1981). Физиологическая многогранность ГАМК, обусловленная ее полифункциональностью как нейромедиатора всех морфофункциональных уровней ЦНС (Мухин Е.Н., 1990; Сергеев П.В. и соавт., 1999), существование нескольких типов и множества изоформ ГАМК-рецепторов (Egebjerg A. et al., 2002) предопределяют значительную широту и разнообразие фармакологических эффектов ГАМК-ергических веществ на ВНД. Сбои в функционировании ГАМК- ергической системы приводят к различным нарушениям ВНД, фенотипически проявляющимся в патологических формах поведения, обусловленных нарушением когнитивных функций (Мухин Е.Н.,1990; Елькин А.И. и соавт., 2004), двигательной активности (Крыжановский Г.Н., 1980), адаптивных форм реагирования (Суворов Н.Ф. и соавт., 1989) и изменением эмоционального поведения (Concas A. et al., 1990).
Имеющиеся в настоящее время сообщения о роли ГАМК-ергической системы мозга в процессах обучения и памяти достаточно противоречивы. Некоторые производные ГАМК (фенибут, баклофен, ацетиловый эфир ГАМК) проявляют, подобно пирацетаму (Островская Р.У. и соавт., 1984), ан-тиамнестическую активность. В то же время выявлена отрицательная корреляция между содержанием ГАМК в мозге и способностью животных к выработке условного рефлекса. Так мусцимол, аминооксиуксусная кислота, у-ацетилен-ГАМК, вальпроат натрия, баклофен, усиливающие ГАМК-ергическую нейропередачу, ухудшают условнорефлекторную деятельность животных, отрицательно влияют на обучение и память (Раевский К.С. и соавт., 1986). В работе К.С. Раевского и соавт. (1994) показано, что невротиза-ция животных сопровождается развитием мнестических расстройств на фоне компенсаторного повышениия уровня ГАМК в коре и в гиппокампе (Гладких В.Д. и соавт., 2001)
Многочисленные клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о вовлечении системы ГАМК в формирование эмоциональных реакций, связанных с агрессивно-оборонительным поведением и формированием тревожно-фобических и депресивных состояний (Гладких В.Д. и соавт., 2001).
На основании результатов простых скрининг-тестов, а также данных исследования на моделях тревожного поведения (Gray J.A. et al., 1984; 1988; Guy A.P. et al., 1990; Corbett R. et al., 1991) можно предполагать участие ГАМК в интеграции тревожно-депрессивного поведения.
Характерно, что генетически обусловленный более высокий уровень ГАМК в мозге мышей BALB/c по сравнению с линией С57В16 определяет и различное развитие реакции на стрессовое воздействие этих животных. В коре мозга крыс, которых авторы рассматривают как «тревожные», снижено число ГАМК-бензодиазепиновых мест связывания. При формировании мотивации страха нейронная матрица тревоги включает ГАМК-ергический медиа-торный компонент вентрального гиппокампа (Талалаенко А.Н. и соавт., 1992), функционально значимый в отрицательных эмоциональных состояниях. Это согласуется с полученными при использовании иных методологических подходов результатами, свидетельствующими, что ГАМК-ергическая система участвует в регуляции тревоги и является «мишенью» анксиолити-ческого действия транквилизаторов. На различных экспериментальных моделях тревожности показана важная роль ГАМК в купировании тревожно-фобических состояний (Matsumoto R.R., 1989). Отчетливый анксиолитиче-ский эффект, так же как и противосудорожная активность ГАМК-позитивных препаратов, коррелирует с их способность вызывать накопление ГАМК в ме-диаторном «компартменте». Напротив, увеличение тревожно-фобического уровня у грызунов сопровождается снижением содержания ГАМК в головном мозге (Croucher MJ. et al., 1983; Geddes J.W. et al., 1984). Инъекции пен-тилентетразола вызывают состояние тревожного беспокойства и страха у людей и изменение поведения у животных по типу усиления уровня тревожности
Определение острой токсичности
Параметрами сравнительной оценки влияния норборнана и фармакопейных препаратов на мнестические функции мышей, крыс, собак являлись, рассчитывемые пробит-методом по D.J. Finney (1971), категории медианно-эффективных доз (DE50), вызывающих срыв процессов обучения и воспроизведения энграмм в 50% случаев в соответствии с той или иной методикой, относительно величин DL5o Неврологическое тестирование осуществляли по стандартной методике (Буреш Я.В. и соавт., 1991), позволяющей судить о воспроизводимости врожденных непроизвольных реакций (роговичного, зрачкового рефлексов и рефлекса сгибания, рефлексов вздрагивания, переворачивания, равновесия и хватания, реакции постановки лапы на опору и растопыривания пальцев задних лап) белых крыс. Животных формировали в группы, состоящих из самцов и самок в соотношении 1:1; тип нервной деятельности при этом не учитывали.
Динамику изменения мотивационных категорий зоосоциального поведения оценивали посредством теста парного (диадного) взаимодействия. Для проведения теста использовали круглый манеж из непрозрачного пластика, диаметром 60 см и высотой 50 см. На расстоянии 60 см над центром основания помещали источник света (лампу накаливания мощностью 500 ватт с зеркальным отражателем), обеспечивающим освещённость на уровне пола 2000 люкс. В течение 10 минут фиксировали поведение подопытного животного («резидента») на «нейтральной» территории непосредственно после подсадки к нему незнакомого неагрессивного сородича (интрудера). Оцениваемые элементы поведения не были обусловлены обучением, инструментально не вырабатывались и характеризовались специфическим профилем (граф-структурой) и количественными характеристиками (в единицах времени и вероятности). В поведении резидента выделяли дискретные элементы, характеризующие такие зоосоциальные формы поведения, как внутривидовая общительность и половое поведение. В качестве паттернов внутривидового поведения оценивали такие поведенческие элементы как: положение «внимание, вытянувшись» (резидент вытягивает голову и тело по направлению к интрудеру), приближение (направленное движение резидента к интру-деру), принюхивание (ориентация головы и тела интрудера с принюхиванием по отношению к интрудеру), следование (приближение резидента к интрудеру, когда последний движется прочь), положение «сверху», «снизу/под» (вползание резидента на тело/под тело интрудера), обнюхивание резидентом носа, различных частей тела и хвоста интрудера, аллогруминг (вылизывание, вычёсывание и выщипывание резидентом шерсти интрудера). В качестве паттернов полового поведения оценивали такие поведенческие элементы, как обнюхивание гениталий, попытки покрытия, как сексуальные паттерны самца (полное, неполное или дезориентированное покрытие). При оценки поведенческих актов животных в условиях диадного взаимодействия придерживались следующих правил: интрудер не должен был состоять с резидентом в одной группе содержания в виварии, запускался в клетку на расстояние максимального удаления от резидента; очередной контакт резидента с интруде-ром допускался не ранее, чем через 2 часа после предыдущего. Запись это-граммы производили с помощью программы для ПЭВМ (Вербицкая Е.В., Пошивалов В.П. 1987), позволяющей регистрировать последовательность появления и длительность отдельных элементов поведения мелких лабораторных животных. Первичные экспериментальные данные оформлялись в виде матриц частот актов и поз поведения крыс.
Тревожно-фобическое состояние, как мотивационную категорию индивидуального поведения, исследовали посредством многопараметрового метода на основе естественной модели повышенной тревожности у крыс с использованием балльной шкалы оценки (Родина В.И. и соавт., 1992). Для входящих в состав шкалы тестов, провоцирующих состояние тревожности и страха и характеризующих видоспецифические реакции животных, принимались единые пределы измерения выраженности ответной реакции от 0 до 3 баллов; большая сумма баллов соответствовала более высокому уровню тре-вожно-фобического состояния. В основу тестов для формирования шкалы оценки тревожно-фобического состояния у крыс были положены две основные ситуации, в которых животные демонстрировали ответы, связанные со столкновением с незнакомым неживым объектом (или незнакомой ситуацией): фиксирование латентного времени спуска крысы с высоты, прохождения через отверстие, выхода из центра «открытого поля»; действием руки экспериментатора; оценка возникновения реакций «затаивания», «пячения», «вокализации», «прижимания» ушей животным (Родина В.И. и соавт., 1992). При постановке эксперимента формировали группы животных из самцов и самок в соотношении 1:1, при этом учитывали индивидуальные особенности животных, характеризующие исходный уровень их тревожно-фобического состояния (в предварительной серии экспериментов было установлено, что исходный средний балл, характеризующий уровень тревожно-фобического состояния крыс использованной популяции, составил 6,8 ± 0,5). После первичного обследования экспериментальные животные условно были разделены на «высокотревожных» (ВТ) (с исходным средним баллом более 6,8) и «низкотревожных» (НТ) (с исходным средним баллом менее 6,8).
Изменения безусловно-мотивационной деятельности
Видовые различия животных (мыши, крысы, собаки) не оказывают существенного влияния на выраженность мнестических расстройств. В случае формирования ретроградной амнезии величины DE50 мышей, крыс и собак составляют 0,15 - 0,18 соответствующих величин от DL50. Что касается динамики развития и продолжительности амнезии, то в экспериментах на грызунах (по сравнению с собаками) отмечается более раннее формирование амнезии, что, возможно, связано с видовыми особенностями функционирования адаптивно-компенсаторных реакций организма. Степень развития ассоциативных полей коры у млекопитающих, как известно, является показателем филогенетического статуса вида и уровня его адаптивных возможностей. По существу, начиная с отряда хищных, впервые зарождаются истинные, четко отдифференцированные ассоциативные структуры таламуса и коры мозга. Это, по-видимому, является причиной более длительного скрытого периода при формировании амнезии, индуцированной норборнанами в экспериментах на собаках.
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что норборнан дозозависимо индуцирует развитие обратимых нарушения процессов обучения и памяти (табл.6).
Динамика и выраженность нарушения мнестических функций у подопытных животных носит ярко выраженный дозозависимый характер. В табл.7 на примере амнезий, моделируемых посредством методики УРАИ и пространственного ориентирования в водном лабиринте представлены экспериментальные данные по способности крыс и мышей к выработке и упрочению условных реакций после затравки норборнаном в широком диапазоне (0,15 - 0,8 DL5o) вводимых доз.
Анализ полученных экспериментальных данных свидетельствует о том, что продолжительность антероградной амнезии достигает 9-12 суток при воздействии норборнана в субконвульсивных дозах; на уровне конвульсивных и минимально-летальных, дозозависимо сохраняется до 4-х недель. Полученные экспериментальные данные согласуются с клинико-экспериментальным материалом, свидетельствующим о возможности обратимого нарушения памяти при возникновении повышенной судорожной готовности в структурах мозга, и, прежде всего - в структурах лимбической
Ретроградная 0,073±0,002 (0,15DL50) 1440 До 4 системы (Карлов В.А., 1990, 2003). Механизмы, приводящие к срыву мнестических функций, до конца не выяснены. Их связывают, прежде всего, с полибиохимическими нарушениями медиаторного, нуклеинового обменов в условиях эпилептизации нейронов (Ильюченок Р.Ю. и соавт., 1994).
Наблюдаемые расстройства мнестических функций, в определенной мере можно рассматривать как следствие ослабления ГАМК-ергической регуляции вегетативных функций и активации симпато-адреналовых механизмов стресса, ведущих к формированию астеноневротического синдрома и, учитывая значимость ц-АМФ в процессах обучения и памяти (Ашмарин И.П.и соавт., 1999), дисбаланса циклазных систем мозга. В условиях интоксикации блокаторами ГАМК-зависимых хлор-ионных каналов рассматриваемая дозозависимая динамика нарушения мнестических функций коррелирует с динамикой дозозависимых изменений циклазных систем мозга (Пшёнкина Н.Н. и др., 1997). То есть формирование амнезии протекает на фоне первоначального увеличения ц-ГМФ и снижения ц-АМФ; нормализация мнестических функций - на фоне восстановления их баланса к исходному состоянию. Определённая роль в генезе мнестических расстройств при отравлении блокаторами ГАМК-зависимых хлор-ионных каналов принадлежит, на наш взгляд, и выявленным процессам усиления липидной пероксидации, нарушению биоэнергетики клетки, а, следовательно, и деструкции биомембран.
Таким образом, нарушение мнестических функций в условиях острых отравлений непрямыми ГАМК-антаганистами в определенной мере можно рассматривать как проявления специфических и неспецифических патогенетических механизмов. Безотносительно генеза рассматриваемой патологии и с точки зрения решаемых в работе задач, выявленное расстройство мнестических функций правомерно рассматривать в качестве адекватной лабораторной модели нарушения высшей нервной деятельности и оценки эффективности средств фармакологической коррекции отравлений блокаторами ГАМК-зависимых хлор-ионных каналов на уровне субконвульсивных доз и в реабилитационный период после отравлений тяжелой степени.
Учитывая то, что полученные, (посредством использования независимых методов оценки мнестических функций), экспериментальные данные сопоставимы между собой, для дальнейшей оценки антиамнестической активности тестируемых фармакологических препаратов в условиях интоксикации ГАМК-антагонистами, выбрана методика УРАИ, как достаточно информативная, наименее трудоёмкая и наиболее экономичная из комплекса использованных методов оценки мнестических функций лабораторных животных.
Таким образом, результаты экспериментальных исследований особенностей проявлений расстройств высшей нервной деятельности при отравлении норборнаном свидетельствуют о том, что нарушение дееспособности дозозависимо сохраняется от 9-12 суток (уровень воздействия субконвульсивных доз) до 4 недель (уровень воздействия конвульсивных и минимально-летальных доз). Формирующиеся при этом нарушения мнестических функций, фиксируемые посредством методики УРАИ, представляют собой наиболее адекватную лабораторную модель нарушения высшей нервной деятельности для оценки эффективности средств фармакологической коррекции отравлений блокаторами ГАМК-зависимых хлор-ионных каналов.
Углеводно-энергетический обмен
Достаточно стабильный реабилитационный эффект показан для мекси-дола и этомерзола в отношении как ретроградной, так и антероградной амнезий, индуцируемых норборнаном. В соответствии с литературными данными, эти препараты оказывают определённое влияние на модуляцию основных нейромедиаторных систем мозга и характеризуются выраженной антиоксидантний и антигипоксантной активностью. Выявленная при выполнении настоящего исследования ноотропная активность мексидола и этомерзола в отношении амнезии, индуцируемой нарушением тормозной ГАМК-ергической неиротрансмиссии ЦНС, во многом может быть обусловлена усилением антиоксидантной защиты (с последующим уменьшением процессов пероксидации) и увеличением энергопродукции клеток (за счёт активации процессов ресинтеза глюкозы из продуктов ее распада - лактата, пирувата, а также из глицерина и аминокислот).
Для проверки данной гипотезы в отдельной серии экспериментов проведена оценка влияния мексидола и этомерзола на процессы углеводно-энергетического обмена, состояние антиоксидантной защиты и липидной пероксидации в условиях отравления норборнаном. 5.2. Влияние мексидола и этомерзола на углеводно-энергетический обмен и процессы липидной пероксидации при интоксикации норборнаном
Влияние мексидола (150 мг/кг) и этомерзола (80 мг/кг) на состояние углеводно-энергетического обмена и процессы липидной пероксидации оценивали в опытах на белых крысах на модели отравления норборнаном средней степени тяжести, после однократного внутримышечного введения 0,45 DL5o токсиканта. О состоянии углеводно-энергетического обмена судили по содержанию в тканях мозга, печени и мирокарда глюкозы, гликогена, лактата, пирувата и креатинфосфата. О состоянии системы антиоксидантной защиты и процессов перекисного окисления липидов судили соответственно по уровню малонового диальдегида (МДА), диеновых конъюгат (ДК) и восстановленных форм глутатиона (ВГ), активности супероксиддисмутазной (СОД) ферментной системы и каталазы в тканях мозга (печени) и эритроцитах. Отбор проб осуществляли с учётом особенностей динамики развития интоксикации: через 3, 24 и 48 часов после введения токсиканта и исследуемых фармакологических препаратов.
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что через сутки после отравления норборнаном в гомогенате мозга крыс отмечается: возрастание уровня глюкозы и снижение гликогена (соответственно в 2,5 и 2 раза); повышение концентрации лактата и снижение концентрации пирувата в 2 раза; снижение уровня креатинфосфата ( в 2 раза). Аналогичная, но менее выраженная тенденция изменения рассматриваемых биохимичских показателей фиксируется и в других тканях (печени, миокарде). Отмеченный биохимический сдвиг свидетельствует о нарушении углеводного и энергетического обмена и отражает, по-видимому, проявления вторичных, неспецифических процессов, обусловленных токсическим стрессом, повреждением биологических мембран и развивающейся гипоксией.
Под влиянием мексидола и этомерзола отмечается нормализация угле-водно-снергетического обмена клеток мозга и других тканей. Так, под воздействием рассматриваемых фармакологических препаратов содержание лактата (пирувата) снижается (увеличивается) в 1,5 - 2 раза, достигая уровня нормы в тканях мозга, печени и сердца (табл. 16 и 17); содержание креатинфосфата (по сравнению с отравленными животными) повышается, приближаясь к нижним границам нормы (табл. 18); содержание гликогена восстанавливается до уровня нормы в миокарде и тканях мозга и остаётся незначительно повышенным в печени (табл. 19); содержание глюкозы в мозге остаётся высоким, с тенденцией дальнейшего повышения (табл. 20), что, по-видимому, обусловлено активизацией адаптационно-компенсаторных реакций мозговых структур.
Что касается сравнительной оценки влияния рассматриваемых препаратов, то можно отметить, что этомерзол проявляет несколько более высокую (по сравнению с мексидолом) активность по нормализации углеводно-энергетического обмена в тканях мозга. Так, например, процессы стабилизации уровня креатинфосфата, лактат/пирувата в тканях печени и сердечной мышцы по силе выраженности равнозначны, как в случае воздействия этомерзола, так и мексидола. Что касается головного мозга, то здесь активность этомерзола несколько выше, чем мексидола.
![Экспериментальное обоснование методологических подходов к оценке эффективности фармакологической коррекции нарушения дееспособности после острых отравлений блокаторами ГАМК-зависимых хлор-ионных каналов [Электронный ресурс]](/i/i/4236/185775.png "Экспериментальное обоснование методологических подходов к оценке эффективности фармакологической коррекции нарушения дееспособности после острых отравлений блокаторами ГАМК-зависимых хлор-ионных каналов [Электронный ресурс] Кирьянов Владимир Владимирович")
![Клинико-диагностическое значение цитокиновой активации и эндотелиальной дисфункции у больных хронической сердечной недостаточностью и возможности коррекции имеющихся нарушений [Электронный ресурс]](/i/i/4378/189427.png "Клинико-диагностическое значение цитокиновой активации и эндотелиальной дисфункции у больных хронической сердечной недостаточностью и возможности коррекции имеющихся нарушений [Электронный ресурс] Толстов Сергей Николаевич")