Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1 Культура облепиха. Биологически активные вещества облепихи. Некоторые биохимические и фармакологические аспекты действия на организм человека 11
1.2 Некрахмальные полисахариды 18
1.2.1 Целлюлоза, строение и свойства 18
1.2.2 Гемицеллюлоза, строение и свойства 21
1.2.3 Пектиновые вещества, строение и свойства 25
1.3 Ферментативный гидролиз как фактор повышения эффективности переработки плодово-ягодного сырья 29
1.3.1 Современные представления о свойствах и механизме действия ферментов, гидролизующих некрахмальные полисахариды 29
1.3.1.1 Ферменты целлюлазного комплекса 29
1.3.1.2 Ферменты гемицеллюлазного комплекса 35
1.3.1.3 Ферменты пектолитического комплекса 38
1.3.2 Применение ферментов в переработке плодово-ягодного сырья 42
2. Экспериментальная часть 50
2.1 Объекты и методы исследования 50
2.1.1 Объекты исследования 50
2.1.2 Методы исследования характеристик ферментных препаратов 50
2.1.3 Методы исследования химического состава и физико-химических показателей 53
2.1.4 Метод получения концентрата 61
2.1.5 Методы органолептической оценки 62
2.1.6 Методы исследования микробиологических характеристик концентрата 62
2.1.7 Методы определения показателей качества жиров 62
2.1.8 Методы оценки реологических, структурно-механических
и органолептических показателей кондитерских изделий 62
2.1.9 Методы математического планирования и обработки экспериментальных данных 63
2.2 Результаты исследований и их обсуждение 64
2.2.1 Изучение химического состава ягод облепихи 64
2.2.2 Разработка способа предварительной ферментативной обработки ягод облепихи при получении сока 78
2.2.2.1 Обоснование выбора ферментных препаратов для обработки ягод облепихи 79
2.2.2.2 Характеристика ферментных препаратов 81
2.2.2.3 Исследование условий применения индивидуальных ферментных препаратов для обработки ягод облепихи 92
2.2.2.4 Разработка условий применения композиции ферментных препаратов для обработки ягод облепихи на основе методов математического планирования 99
2.2.2.5 Изучение влияния ферментативной обработки ягод облепихи с применением композиции ферментных препаратов на выход физиологически функциональных ингредиентов в СФО и антиоксидантную активность 108
2.2.3. Разработка технологических решений для получения концентрата сока облепихи из СФО 126
2.2.3.1 Разработка технологической схемы получения концентрата сока из СФО 127
2.2.3.2 Изучение органолептических, физико-химических показателей качества, химического состава и антиоксидантной активности концентрата сока из ягод облепихи 133
2.2.3.3 Изучение изменений состава, органолептических, микробиологических характеристик и показателей качества липидов концентрата сока из ягод облепихи в процессе хранения 148
2.2.4 Применение концентрата сока из ягод облепихи при получении кондитерских изделий 160
2.2.4.1 Применение концентрата сока из ягод облепихи в технологии кондирования плодов тыквы 160
2.2.4.2 Применение концентрата сока из ягод облепихи при получении тортов и пирожных 165
2.2.4.3 Применение концентрата сока из ягод облепихи при получении желейного мармелада 174
2.2.5 Применение жома ферментированных ягод облепихи при получении кондитерских изделий 185
2.2.5.1 Изучение химического состава жома ферментированных ягод облепихи 185
2.2.5.2 Применение жома ферментированных ягод облепихи при получении вафель 192
Заключение 200
Выводы 201
Список литературы 204
Приложения
- Некрахмальные полисахариды
- Ферментативный гидролиз как фактор повышения эффективности переработки плодово-ягодного сырья
- Методы исследования характеристик ферментных препаратов
- Разработка способа предварительной ферментативной обработки ягод облепихи при получении сока
Введение к работе
Актуальность темы. Важная роль в создании «здоровых» продуктов питания принадлежит плодово-ягодному сырью, которое, благодаря многообразию входящих в его состав полезных для здоровья человека микронутриентов и физиологически функциональных ингредиентов, способных регулировать многочисленные реакции организма, представляет исключительный интерес для здорового питания и является ценной сырьевой базой при создании высококачественных продуктов питания.
Среди большого разнообразия плодов и ягод, произрастающих на территории Российской Федерации, особого внимания заслуживают ягоды облепихи. Объясняется это наличием достаточной сырьевой базы, доступностью, экологической чистотой и уникальностью химического состава, который позволяет отнести эту ягодную культуру к категории «суперфруктов».
Однако на сегодняшний день ресурсы облепихи востребованы лишь на 5-10%, причем большая часть собранного урожая - до 95% - перерабатывается на масло, лишь незначительная часть используется для производства консервированной продукции, и ежегодно до 50% урожая остается неубранным вообще. Возможно, это объясняется несовершенным техническим обеспечением, ограниченной научной базой и недостатком разработок новых высокоэффективных способов переработки ягод, которые дают возможность максимально использовать их природный биологический ресурс. И потому, следует признать, что потенциальные возможности ягод облепихи в пищевой промышленности реализуются пока еще не достаточно эффективно. В большей степени это связано с тем, что при переработке лишь часть биологически активных компонентов ягод переходит в соковую часть продукта, значительная доля находится в ассоциативной связи с компонентами клеточных стенок. Поэтому актуальными представляются исследования, направленные на разработку прогрессивных технологий переработки ягод облепихи, позволяющих наиболее полно и эффективно использовать их уникальный природный состав. Это может достигаться за счет ферментативной модификации структурных биополимеров, составляющих основу клеточных стенок ягод и формирующих белково-углеводно-фенольные комплексы.
Цель работы. Обоснование способа предобработки ягод облепихи при получении сока для увеличения его выхода, максимального извлечения в сок физиологически функциональных ингредиентов облепихи и разработка технологических аспектов его применения в кондитерской промышленности.
В соответствии с поставленной целью были определены задачи исследования:
- характеристика химического состава ягод облепихи с позиций пищевой ценности для обоснования целесообразности проведения ферментативной обработки ягод при получении сока;
- обоснование выбора ферментных препаратов (ФП) пектолитического и глюканазного действия для применения на стадии предобработки ягод облепихи при получении сока для увеличения выхода сока и наиболее полного извлечения входящих в состав ягод физиологически функциональных ингредиентов (ФФИ);
- разработка способа предобработки ягод облепихи с применением мультэнзимной композиции на основе ФП Фруктоцим-Колор и Laminex BG Glucanase Complex (МЭК);
- исследование и сравнительный анализ химического состава и антиоксидантной активности сока облепихи, полученного с использованием разработанного способа ферментативной предобработки ягод облепихи (СФО) и сока, полученного в тех же условиях без ферментативной обработки;
- разработка технологических решений для получения концентрата сока облепихи из СФО (КСФО);
- исследование химического состава, антиоксидантной активности, органолептических, физико-химических и микробиологических показателей качества КСФО для применения в составе пищевых продуктов;
- разработка технологической схемы и технологических рекомендаций по получению и применению КСФО в качестве источника природных красителей и ароматизаторов и для повышения пищевой ценности кондитерских изделий;
- разработка проекта технических условий на КСФО, проведение опытно-промышленной апробации по применению КСФО при производстве кондитерских изделий.
Научная новизна. Экспериментально обоснована целесообразность проведения предварительной обработки ягод облепихи ФП пектолитического и глюканазного действия для получения сока повышенной пищевой ценности.
Выявлены условия предобработки ягод облепихи комплексными ФП Фруктоцим-Колор и Laminex BG Glucanase Complex, способствующие увеличению выхода сока на 25% и снижению его вязкости.
Показано, что проведение предварительной обработки ягод облепихи МЭК на основе Фруктоцим-Колор и Laminex BG Glucanase Complex способствует увеличению выхода в соковую фракцию редуцирующих веществ, белка, липидов, органических кислот, витамина С - на 20-40%, по сравнению с соком, полученным без предобработки.
С использованием метода ГЖХ установлено, что в соке из ягод облепихи, полученном с применением предварительной ферментативной обработки, в жирнокислотной фракции содержится значительное количество моно- и полиненасыщенных жирных кислот (более 57%); при этом, по сравнению с соком, полученным без предобработки, содержание линоленовой кислоты больше в 1,7 раза, вакценовой – в 1,25 раза.
Доказано существенное влияние предобработки ягод облепихи препаратами Фруктоцим-Колор и Laminex BG Glucanase Complex на увеличение выхода в сок токоферолов (в 2,5 раза), каротиноидов (в 3,2 раза), флавоноидных соединений – катехинов, флавонов, флавонолов и флаванонолов (в 1,4-4,5 раза). С использованием методов ВЭЖХ и ГЖХ дана характеристика качественного и количественного состава каротиноидного комплекса и катехинов СФО. Выявлено наличие в СФО лютеина, криптоксантина и эпикатехин галлата, которые отсутствовали в соке, полученном без предобработки.
Установлена более высокая антиоксидантная активность СФО (в 4,3 раза) по сравнению с соком, полученным без применения ФП.
Практическая значимость. Разработан способ предварительной ферментативной обработки ягод облепихи при получении сока для увеличения выхода сока и максимального извлечения в сок ФФИ ягод облепихи.
Разработаны технологические рекомендации и технологическая схема получения концентрата соковой фракции из ягод облепихи в двух модификациях: концентрат облепиховый натуральный (45-50% с.в.) и концентрат облепиховый с сахаром (70-72% с.в.); обоснованы сроки и условия хранения КСФО, обеспечивающие микробиологическую безопасность, сохранение биологически активных веществ и потребительских характеристик.
Разработаны проекты технической документации: ТУ и ТИ на концентрат облепиховый.
Разработаны технологические рекомендации по применению концентрата облепихового при производстве кондитерских изделий (кондированные плоды тыквы, в качестве самостоятельного ингредиента и в составе кремового полуфабриката для песочных и слоеных тортов и пирожных, мармелад).
Проведены производственные испытания в условиях ОАО «Хлебпром» ОП г. Красногорск по применению КСФО при производстве тортов «Творожник», «Песочный», пирожного «Берлинское». Разработаны рецептуры и внесены изменения в ТУ и ТИ на песочный торт «Творожник» и слоеное пирожное «Берлинское»; проведена наработка опытной партии этих изделий. Разработанные технологические рекомендации принимаются к внедрению на данном предприятии.
Показано, что применение вторичного продукта переработки ягод облепихи (жома) при получении КСФО в жировой начинке для вафель дает возможность повысить их пищевую ценность по содержанию витамина С, каротиноидов, токоферолов.
Новизна разработанных технических решений подтверждена патентом RU 2454880 С1 «Способ получения концентрата облепихи».
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в пищевой промышленности» (Самара, 2009 г.); VII, VIII и IX международной научно-практической конференции и выставке «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты» (Москва, 2009, 2010, 2011 гг.); III Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово, 2010 г.); 5th International Seabuckthorn Association Conference (China, Qinghai, Xining, 2011).
Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, из них 1 - в зарубежном издании, 4 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получен патент RU 2454880 С1 «Способ получения концентрата облепихи».
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы и 12 приложений. Основной текст работы изложен на 221 странице, содержит 37 рисунков и 56 таблиц. Список использованной литературы включает 241 источник, в том числе 122 зарубежных.
Некрахмальные полисахариды
Целлюлоза (клетчатка) - главная составная часть растительных тканей. Это прочное, волокнистое, водонерастворимое соединение, фибриллы которого образуют каркас растительных клеток и главную составную часть опорных тканей растений. Этот внеклеточный структурный полисахарид - самый распространенный в природе биополимер. В большом количестве содержится в тканях древесины (40-55%), в волокнах льна (60-85%) и хлопка (95-98%); в травах и ботве сельскохозяйственных культур содержится около 30% целлюлозы, в овощах и фруктах - 1-2%; в ягодах - 3-5% [1, 25, 39]. Строение целлюлозы к настоящему времени исследовано достаточно подробно [5, 8, 11, 37, 40, 79, 119, 181, 219, 235]. Совокупность полученных данных позволяет считать, что чистая целлюлоза представляет собой регулярный линейный гомополимер, состоящий из 6000-12000 остатков P-D-глюкозы, связанных между собой (3-(1— 4) гликозидной связью. В среднем одна нить целлюлозы имеет молекулярную массу 1-106-2-106[11, 15, 108, 117]. Нитевидные гидрофильные молекулы целлюлозы, благодаря прочным водородным связям, соединяются пучками по 40-60 штук в элементарные фибриллы, состоящие из нескольких десятков параллельных цепей [15, 37, 39, 92]. Агрегаты из нескольких элементарных фибрилл образуют микрофибриллы, в которых молекулы целлюлозы вытянуты продольно, а в поперечном направлении плотно упакованы в высокоупорядоченную кристаллическую структуру [68, 171, 190, 226]. В литературе укрепилось мнение о наличии в структуре микрофибрилл двух фаз - аморфной и кристаллической [1,5, 40]. Гесс с сотрудниками предполагали регулярное чередование кристаллических и аморфных участков постоянных размеров вдоль оси микрофибрилл [11]. Известен ряд схем (Долметча, Теннесена—Эллефсена) [37], где микрофибриллы как бы «собраны» из одинаковых по длине «блоков», причем каждый из них образован свернутыми цепями со складчатой конформацией. Роговин З.А. считал, что регулярного чередования кристаллических и аморфных участков нет [81]. В рамках представлений, развиваемых Роговиным, целлюлозу следует рассматривать как стереорегулярный высокоориентированный кристаллический полимер, обладающий значительной неоднородностью с наличием упорядоченных областей. В литературе [5, 11, 152, 219, 235] большое внимание уделяется теории паракристаллического строения полимеров, предложенной Хосманном. Согласно этой теории полимер состоит из зон, построенных по принципу складчатого кристалла, перемежающихся с аморфными участками, т.е. одна молекулярная цепь проходит через несколько областей порядка и беспорядка.
По мнению А.А. Клесова представление о наличии в целлюлозе двух фаз необязательно предполагает существование четкой границы между ними, и более обосновано представление о целлюлозе как однофазной системе с различной степенью упорядоченности и наличием непрерывного перехода уплотнений и разрыхлений в пределах отдельных микрофибрилл [40].
Основываясь на вышеизложенном, следует сказать, что кристаллические и аморфные участи не имеют четких границ и благодаря значительной длине макромолекулы целлюлозы могут проходить через несколько кристаллических и аморфных областей.
Степень кристалличности структур микрофибрилл определяет степень прочности целлюлозного волокна. В кристаллических участках молекулы целлюлозы упакованы плотно и с большой энергией межмолекулярной связи, поэтому молекулы, находящиеся внутри такого участка недоступны для реагентов и наиболее устойчивы к ферментативному гидролизу [6, 8, 15, 70, 219]. Аморфные участки более легко проницаемы для химических реагентов и сравнительно легко гидролизуются. В результате замены полярных групп целлюлозы карбоксиметилом нарушается молекулярная регулярность и возникает множество водородных связей с водой, что делает ее структуру более открытой и доступной действию ферментов [39, 79, 178].
Молекулярное строение целлюлозы определяет ее надмолекулярную структуру, а также физико-химические и морфологические свойства. Природная целлюлоза устойчива к действию химических реагентов и нерастворима в воде, а лишь набухает в ней [8, 146, 152, 171]. При действии на целлюлозу концентрированных растворов щелочи изменяются ее химические, физико-химические и структурные свойства: отмечается интенсивное набухание, меняется степень кристалличности [5].
Целлюлоза по своей природе весьма резистентна к действию различных гидролизующих агентов, в том числе ферментов, т.е. является субстратом с низкой реакционной способностью. Это обусловлено различным соотношением аморфных участков и кристаллитов, нерастворимостью, наличием защитной матрицы, образованной лигнином, гемицеллюлозой и пектиновыми веществами, куда погружены целлюлозные волокна [40, 167, 219]. Молекулы целлюлозы настолько малы для прохождения молекул ферментов, что только при предварительной обработке ферменты могут проникать внутрь тканей растений. Поэтому ферментативный гидролиз целлюлозосодержащего сырья непременно требует предварительной обработки растительной ткани [39, 117].
Универсальным способом предобработки растительного сырья, не требующим дополнительных стадий, является измельчение. Реакционная способность после измельчения в отдельных случаях увеличивается в 10-15 и более раз [8].
Целлюлоза трудно подвергается метаболизму: у большинства животных и человека не переваривается в желудочно-кишечном тракте из-за отсутствия фермента, гидролизующего (3-1,4-гликозидную связь. Биодеградацию целлюлозы осуществляют ферменты микроорганизмов [52, 55]. Микрофлора толстого кишечника человека ферментирует целлюлозу овощей и фруктов практически полностью [39, 73].
Ферментативный гидролиз как фактор повышения эффективности переработки плодово-ягодного сырья
Целлюлоза разрушается представителями многих родов микроорганизмов (бактериями, микроскопическими грибами и актиномицетами), среди них - Alt. tenuis, Asp. amstelodamy, Asp. awamory, Cel. gilvus, Cel. flavigena, Rhizopus oryzae, Chr. lucknowense, Tr. viride и др. [8, 9, 15, 39, 54, 126, 208, 229]. В гидролизе целлюлозы участвуют 4 основных вида ферментов. Эндо- -1,4-глюканазы катализируют неупорядоченное расщепление целлюлозных молекул на крупные фрагменты. Под действием экзо-/3-1,4-глюкозидазы и целлобиогидролазы от нередуцирующего конца целлюлозных молекул или их фрагментов отщепляется соответственно глюкоза и целлобиоза. Целлобиаза или [3-глюкозидаза катализирует гидролиз целлобиозы с образованием глюкозы [16, 34, 39, 75]. Отдельные компоненты целлюлолитических ферментов различаются не только по молекулярной массе, изоэлектрическои точкой, содержанию углеводов в молекуле и аминокислотному составу, но и по механизму действия [79, 188]. Эндоглюканазам принадлежит важнейшая роль в полиферментной целлюлазной системе, поскольку они первыми атакуют как растворимую, так и нерастворимую целлюлозу [8, 15, 39, 117, 176]. Эндоглюканазы неупорядоченно расщепляют связи, удаленные от концов полимерной цепи и приводят к существенному уменьшению степени полимеризации целлюлозы: образованию олигосахаридов, которые в свою очередь атакуются экзоферментами - целлобиогидролазами и экзоглюкозидазами. Иначе говоря, эндоглюканаза создает субстрат для действия экзоферментов [39, 55, 215]. Среди ферментов целлюлазного комплекса изучению эндоглюканаз было уделено, по-видимому, наибольшее внимание [9, 59, 125, 158, 176, 178, 188]. Эндоглюканазы - это гликопротеиды, в состав большинства которых входит до 40% углеводов, состоящих из глюкозы, маннозы, галактозы и арабинозы, ковалентно связанных с белковой частью молекулы [15, 39, 81]. Полагают, что углеводный компонент фермента связан с его адсорбционной способностью на субстрате и глубиной гидролиза нативной целлюлозы [176, 178].
Возможно, углеводная часть обеспечивает скольжение фермента в фибриллярных структурах целлюлозы. Это существенно, поскольку целлюлаза осуществляет тысячи актов, не покидая поверхности одной целлюлозной молекулы [39, 79, 125].
К настоящему времени накоплены многочисленные данные о разной сорбционной способности эндоглюканаз [15, 55, 122, 133, 158, 188]. Так, исследования, проведенные А.А. Клесовым, М.С. Рабиновичем, И.В. Чуриловой [40, 79] показали, что эндоглюканазы, выделенные из Tr. lignorum, G. Candidum, Asp. niger, не обладают одинаковой способностью к адсорбции на микрокристаллической целлюлозе и процент адсорбированных ферментов от содержания их в исходном препарате выражается в следующих цифрах: 97%, 73% и 13% соответственно. Прочной адсорбцией отличаются эндоглюканазы, выделенные из термофильных штаммов Asp. wentii, Chaetonium thermophile [158, 188].
Немецкими учеными установлено, что для нативной целлюлозы измельчение способствует лучшей адсорбции целлюлаз, выделенных из Тг. reesei, и соответственно, увеличению их активности [158].
Американскими коллегами изучено влияние на адсорбционную способность эндоглюканаз из Tr. reesei при гидролизе древесины природы субстрата (мягкая или жесткая древесина), способа обработки (свежая или высушенная древесина) и ионной силы [149]. Показано, что из этих факторов наибольшее влияние на адсорбционную способность фермента оказывает способ обработки, уступая природе субстрата и ионной силе.
Что же касается отношения эндоглюканаз различного происхождения к растворимому субстрату (карбоксиметилцеллюлозе), то следует отметить, что взаимодействие активных центров ферментов с КМЦ характеризуется близким сродством для всех изученных эндоглюканаз [182].
Эндоглюканазам целлюлазного комплекса свойственна реакция трансгликозилирования, т.е. реакция переноса углеводного остатка субстрата на акцептор, в роли которого может выступать другая молекула олигосахарида, в результате чего происходит удлинение углеводной цепи с образованием ди-, три и более высокомолекулярных олигосахаридов, в результате чего уменьшается выход целевого продукта - глюкозы [40, 79, 165]. Так, на примере эндоглюканазы, полученной из Tr. viride НК-75, установлено, что способность к трансгликозилированию определяется аминокислотным составом молекулы фермента [169]. Одной из основных характеристик эндо-1,4-(3-глюканаз является сохранение аномерной конфигурации гликозидного гидроксила в продуктах реакции. По этому признаку эндоглюканазы существенно отличаются от экзоглюканаз [79, 126, 178, 223]. Некоторые свойства эндоглюканаз, выделенных из разных источников, различаются. Так, известно, что большинство эндоглюканаз стабильны при умеренных температурах (40-50С) и оптимум действия лежит в интервале рН 4- 5 [125, 188, 208], однако встречаются и исключения. Так, недавно из штамма Bacillus sp. NZ получена новая эндоглюканаза, которая проявляет активность при высоких температурах (50-100С) и стабильна в щелочной среде (рН 8-40) [200]. Выявлены также существенные различия и по молекулярным массам: эндоглюканазы, полученные из Tr. reesei [162], обладают молекулярной массой 25 кДа, из Cel. flavigena [208]- 20,4 кДа, из Pen. verruculosum [12] - 36 кДа, из Thermoascus aurantiacus [182] - 78 кДа. В то же время эндоглюканазы обладают сходными свойствами, среди которых следует выделить: сродство к субстрату возрастает с увеличением длины цепи олигосахаридов; низкое сродство к целлобиозе, которая может выступать в качестве ингибирующего фактора для эндоглюканаз; субстратная специфичность и сохранение аномерной конфигурации гликозидного гидроксила в продуктах реакции [15, 176, 178, 200]. Установлено, что ионы металлов влияют на активность эндоглюканаз по-разному. Так, в присутствии ионов Мп2+ и Fe + активность эндоглюканазы, выделенной из Asp. niger ANL301, увеличивалась на 24%, в то время как ионы Mg , Са , Си , Zn снижали активность на 29,4%, а ионы Hg - на 71,3% [133]. К экзоглюканазам следует отнести два фермента: экзо-1,4-глюкозидазу и целлобиогидролазу, которые могут с нередуцирующего конца поли- и олигомерных производных целлюлозы отщеплять соответственно глюкозу и целлобиозу и укорачивать доступные фрагменты субстрата за счет отщепления остатков глюкозы или фрагментов целлобиозы [15, 79, 143].
Для целлобиогидролазы характерна способность гидролизовать нерастворимую целлюлозу с преимущественным образованием целлобиозы и полная неспособность уменьшать вязкость растворов КМЦ из-за наличия заместителей в глюкопиранозных звеньях субстрата, что препятствует продвижению фермента вдоль полимерной цепи [15, 149, 158]. По мнению ученых [1, 27, 132] целлобиогидролазы действуют достаточно медленно с точки зрения уменьшения степени полимеризации целлюлозы. В большей степени за уменьшение степени полимеризации ответственны эндоглюканазы, внутренне раскалывая цепи целлюлозы в относительно аморфных областях [8, 52, 79].
Большинство целлобиогидролаз являются гликопротеинами, содержащими до 9 % углеводов, которые состоят в основном из маннозы, небольшого количества глюкозы, галактозы и глюкозамина [15]. Молекулярные массы известных экзоглюканаз составляют 45-48 кДа [143, 149], но есть и более крупные молекулы (62-90 кДа), рН оптимум 4-5 [186, 223, 238].
Методы исследования характеристик ферментных препаратов
Эндополигалактуроназную активность определяли вискозиметрическим методом (метод разработан Д. Б. Лифшиц), основанном на гидролизе пектина с последующим контролем степени расщепления по снижению вязкости субстрата. За единицу эндополигалактуроназной активности принято такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г пектина со снижением вязкости раствора на 30% за 1 мин при 30С [75].
Экзополигалактуроназную активность определяли по методу, разработанному Д. Б. Лифшиц с сотр., основанному на определении скорости ферментативной реакции гидролиза пектина по количеству разрушенных гидролизом связей, которые рассчитывают по увеличению числа конечных альдегидных групп. Количество образовавшихся альдегидных групп определяют химическим иодометрическим методом, который основан на окислении этих групп йодом в щелочной среде до карбоксильных групп и восстановлении металлического йода до иодид иона: НООС(СНОН)4СН2ОН + 2Na2C03 + 12 - - NaOOC(CHOH)4COONa + 2NaI + 2Н20 + 2С02
В этой реакции галактуроновая кислота окисляется в слизевую кислоту. Для окисления берут избыток йода и после реакции определяют его количество, пошедшее на окисление альдегидной группы, по разности введенного в реакцию йода и оставшегося неизрасходованным после взаимодействия с уроновыми кислотами. Избыточный йод определяют путем титрования раствором тиосульфата натрия: 2Na2S203 + I2 - 2 Nal + Na2S406 За единицу экзополигалактуроназной активности ЭкзоПгА принято такое количество фермента, которое при температуре 30С и оптимальном рН катализирует гидролиз 1 мкмоль эквивалента гликозидных связей в молекуле пектовой кислоты за 1 мин. Экзополигалактуроназную активность выражают числом единиц фермента в 1 г (или в 1 см ) ферментного препарата [75].
Пектинэстеразную активность определяли по методу, разработанному Б. Д. Лифшиц и Д. Е. Плотниковой, основанному на определении скорости ферментативной реакции гидролиза сложноэфирных связей с последующим установлением количества образовавшихся свободных карбоксильных групп, которые определяют титриметрическим методом.
За единицу активности пектинэстеразы при этом принимают такое количество фермента, которое катализирует при 30С и оптимальном рН гидролиз 1 мкмоль сложноэфирных связей в молекуле пектина за 1 мин. Пектинэстеразную активность ПэА выражают числом указанных единиц в 1 г (или в 1 см3) исследуемого препарата [75].
В основу разработанного А. П. Рухлядевой колориметрического метода определения пектиназной (полигалактуроназной) активности ферментного препарата положено определение скорости ферментативной реакции гидролиза пектина, которую устанавливают по количеству образовавшихся продуктов, не осаждаемых сульфатом цинка. Определяя интенсивность окраски растворов на фотоэлектроколориметре, устанавливают количество продуктов реакции в расчете на массу галактуроновой кислоты.
За условную единицу активности в данном методе принимают такое количество фермента, которое катализирует превращение за 1 ч при температуре 30С и рН 4,1 в галактуроновую кислоту 1 г пектина, что составляет 30% от количества пектина, введенного в ферментативную реакцию. Пектолитическую активность выражают числом указанных единиц в 1 г или 100 см3 анализируемого материала [75].
В основу метода определения экзоглюканазной активности положен расчет скорости ферментативной реакции по количеству образовавшихся спирторастворимых углеводов, определяемых колориметрическим методом с применением антронового реактива.
За единицу экзоглюканазной активности ЦАк принято такое количество фермента, которое в стандартных условиях катализирует за 1 ч гидролиз целлюлозы с образованием 1 г глюкозы, составляющего 1,8% от количества глюкозы, получающегося при полном превращении в этот сахар целлюлозы, взятой для проведения ферментативной реакции.
Экзоглюканазная активность характеризуется числом единиц фермента, содержащегося в 1 г (или в 100 см ) препарата [75]. Эндоглюканазную активность определяли вискозиметрическим методом, основанным на определении скорости уменьшения вязкости 0,3%-ного раствора Na-КМЦ после действия целлюлазы. Эндоглюканазную активность определяют по способности снижать вязкость раствора Na-КМЦ при температуре 28С с применением вискозиметра Оствальда.
За единицу эндоглюканазной активности ЦАХ в данном методе принято такое количество фермента, которое в принятых условиях опыта приводит к увеличению текучести (величины, обратной относительной вязкости), равной 1 мин"1 [75].
Ксиланазную активность определяли ацидиметрическим методом, разработанным Т. А. Черемновой и В. И. Родзевич во ВНИИПБ. Метод основан на определении скорости ферментативной реакции по количеству образовавшихся редуцирующих углеводов в результате гидролиза ксилана. Содержание образовавшихся редуцирующих углеводов находят методом, основанным на окислении сахара Фелинговой жидкостью. За единицу ксиланазной активности ГцА в данном методе принято такое количество фермента, которое катализирует гидролиз ксилана за 1 ч с образованием 1 мг редуцирующих углеводов (в пересчете на ксилозу) в принятых условиях [75].
Метод определения Р-глюканазной активности основан на регистрации начальной скорости уменьшения вязкости 0,5%-ного раствора (3-глюкана после действия фермента [75]. Активность Р-глюканазы определяется по ее способности снижать вязкость раствора (3-глюкана, фиксируемой с применением вискозиметра Оствальда при температуре 30С.
За единицу активности Р-глюканазы (ед/г) принято такое количество фермента, которое приводит в принятых условиях к увеличению текучести, равному 1 мин"1.
Для определения оптимальной температуры действия гидролиз субстрата (1%-го пектина, Na-КМЦ) проводили при температуре от 30 до 70С. Затем определяли соответствующую (пектолитическую, эндоглюканазную) активность [75].
Для определения рН-оптимума гидролиз субстрата (1%-го пектина, Na-КМЦ) проводили при различных значениях рН от 3,0 до 8,0. рН среды создавали при помощи ацетатной и фосфатной буферных смесей, затем определяли соответствующую (пектолитическую, эндоглюканазную) активность [75].
Разработка способа предварительной ферментативной обработки ягод облепихи при получении сока
Важным аспектом успешного применения ферментных препаратов в пищевых технологиях является обоснованный выбор и наиболее полное использование активностей их основных ферментативных систем. При гидролизе многокомпонентного растительного сырья целесообразно применение мультиферментных систем, при этом необходимо учитывать особенности отдельных ферментов, составляющих ферментный комплекс препарата в условиях, приближенных к естественным условиям его применения и выбрать условия биокатализа соответственно характеристикам основного фермента, или ферментов, определяющих режимы гидролиза [8, 39].
Эффективное ведение процесса ферментативного гидролиза обусловливается целым рядом факторов. Это, прежде всего, проведение предварительной обработки сырья, температура, рН, длительность процесса, концентрация ферментных препаратов. В настоящем разделе представлены результаты исследований по изучению условий проведения предварительной ферментативной обработки ягод облепихи при получении сока на основе решения и анализа следующих задач: обоснование выбора ферментных препаратов Фруктоцим-колор, Ксибитен-Цел и Laminex BG Glucanase Complex для обработки ягод облепихи; - характеристика ферментных препаратов Фруктоцим-колор, Ксибитен-Цел и Laminex BG Glucanase Complex с точки зрения целесообразности их применения для обработки ягод облепихи; - исследование условий применения индивидуальных ферментных препаратов (концентрация ферментных препаратов и продолжительность гидролиза) для обработки ягод облепихи с точки зрения выхода сока и физиологически функциональных ингредиентов в сок; - разработка условий применения композиции ферментных препаратов для максимального выхода сока и физиологически функциональных ингредиентов с применением методов статистического моделирования; - изучение влияния предварительной ферментативной обработки ягод облепихи с применением композиции на основе выбранных ферментных препаратов на выход физиологически функциональных ингредиентов в сок из ягод облепихи и его антиоксидантную активность
Выбор ферментных препаратов определяется спецификой гидролизуемого сырья (прежде всего его химическим составом) и поставленными задачами. Анализ данных, представленных в разделе 2.2.1, посвященном изучению химического состава ягод облепихи, показал, что потенциальным резервом для повышения выхода сока и экстрактивной способности растительной ткани ягод может явиться ферментативная модификация структурных биополимеров ягод целлюлозы, гемицеллюлозы и пектиновых веществ. Поэтому залогом успешного проведения гидролитического процесса вполне обоснованным представляется применение соответствующих ферментов (пектолитического, целлюлолитического и гемицеллюлазного действия). Сок в ягодах находится в клеточных вакуолях, протоплазме и отчасти в межклеточных пространствах и прочно удерживается живой тканью. Для получения высококачественного сока из ягод облепихи необходимо максимальное извлечение сока из покровных тканей, содержащих значительное количество красящих веществ, в том числе каротиноидов. Основным препятствием к выделению сока является высокая водоудерживающая способность сырья и вязкость жидкой фазы, связанная с наличием полисахаридов - нейтральных и кислых (пектиновых веществ) [39]. Основной биохимический процесс, протекающий в плодово-ягодной мезге при обработке ферментными препаратами, - гидролиз пектиновых веществ. Наличие в ягодах облепихи различных форм пектиновых веществ, находящихся в подвижном состоянии: протопектина - компонента межклеточников и клеточных стенок (0,66±0,12 г/100 г ягод), растворимого пектина клеточного сока (0,39±0,09 г/100 г ягод) (таблица 2) и промежуточных форм трансформации протопектина в растворимый пектин, обусловливает необходимость применения ферментных препаратов с выраженной пектолитической активностью. Такие препараты вызывают полное разрушение первичного состояния тканей плодов, уменьшают молекулярную массу и снижают вязкость пектиновых веществ, что способствует более эффективному прессованию, увеличению выхода сока и повышению содержания в нем растворимых сухих веществ: Сахаров, органических кислот, витаминов, а также флавоноидов и каротиноидов, определяющих цвет конечного продукта [183, 166, 220, 161, 222].
В работе использовали комплексный ферментный препарат Фруктоцим-колор, предоставленный немецкой фирмой «Делер», предназначенный для обработки яркоокрашенного растительного сырья, содержащего пектин.
Выбранный ферментный препарат уже успешно себя зарекомендовал при обработке ягод красной смородины, клубники, свекольной мезги. Приведенные в литературе данные свидетельствуют, что применение Фруктоцим-колор способствует увеличению выхода сока, улучшению его биохимического состава и органолептических показателей [36, 41, 113, 153].
Важная роль в формировании клеточных стенок растений принадлежит целлюлозе и гемицеллюлозе. Ферменты целлюлолитического и гемицеллюлазного действия, обладая набором ферментов эндо- и экзогенного действия, разрушают структуру клеточных стенок и целостность растительных тканей, способствуя тем самым увеличению ее экстрактивной способности. Известно, что с применением цитолитических ферментных препаратов можно существенно повысить выход сока и ценных природных компонентов сырья: органических кислот, полифенолов, антоцианов и катехинов [17, 18, 58].
Для исследований выбрали ферментные препараты Laminex BG Glucanase Complex (штамм-продуцент - Tr. reesei), предоставленный фирмой «Даниско» и Ксибитен-цел (штамм-продуцент - Tr. longibrachiatum TW-1), предоставленный фирмой «Битэкс». Были проведены исследования по характеристике ферментных препаратов и их применению для обработки ягод облепихи, и дана оценка эффективности их действия с точки зрения выхода сока и физиологически функциональных ингредиентов в соковую фракцию.
Похожие диссертации на Совершенствование технологии сока из ягод облепихи для повышения пищевой ценности и применения в кондитерской промышленности
