Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Научные и практические предпосылки разработки современных технологий ферментативных гидролизатов молочных белков (аналитический обзор) 11
1.1 Медико-биологические основы создания гидролизатов молочного белка и специализированных продуктов на их основе 11
1.1.1 Значение белка в питании здорового и больного человека 11
1.1.2 Белковый компонент специализированных гипоаллергенных продуктов 17
1.1.2 Белковый компонент полуэлементных смесей для энтералъного питания 30
1.1.3 Продукты с модифицированным аминокислотным составом 34
1.2 Технологические аспекты получения гидролизатов молочных белков 38
1.2.1 Общие вопросы гидролиза белка 38
1.2.2 Технологии ферментативного гидролиза 43
1.2.3 Использование технологий мембранной фильтрации 60
1.2.4 Методы снижения горечи ферментативных гидролизатов 74
1.2.5. Методы получения пептидных препаратов с модифицированным аминокислотным составом 76
1.2.6 Состав специализированных продуктов на основе ферментативных гидролизатов белка 78
ГЛАВА 2. Обоснование направлений собственных исследований, их цель и задачи 91
2.1 Нерешённые проблемы в области технологии фгмб 91
2.2 Основные параметры состава сп па основе ФГМБ 97
2.2.1 Гипоаллергенные продукты лечебного назначения 98
2.2.2 Гипо аллергенные продукты профилактического назначения 106
2.2.3 СП для энтералъного питания 108
2.2.4 СП с измененным аминокислотным составом 122
2.3. Цель и задачи исследования 128
ГЛАВА 3. Структура исследований, организация эксперимента, объекты и основные методы исследований 129
3.1 Структура исследования 129
3.2 Объекты исследования 131
3.3 Методы исследований 132
3.3.1 Ферментативный гидролиз и мембранная очистка молочных белков в лабораторных условиях 132
3.3.2 Ферментативный гидролиз и мембранная очистка и фракционирование молочных белков в промыитенных условиях 134
3.3.3 Получение в лабораторных и пилотных условиях ферментативных гидролизатов, модифицированных по аминокислотному составу (со сниженным содержанием фенилаланина) 134
3.3.4 Методы лабораторных исследований ферментативных гидролизатов молочных белков 135
3.3.5 Биохимические, иммунохимические и аллергологические методы 142
ГЛАВА 4. Оптимизация процессов ферментативного гидролиза Молочных белков (кмб и ксб) 149
4.1 Ферментативный гидролиз «панкреатином» 149
4.2 Ферментативный гидролиз «флавоэнзимом» 163
4.3 Использование двухферментных систем 170
4.4 Накопление свободных аминокислот в процессе ферментативного гидролиза 173
4.5 Количественная оценка степени гидролиза по соотношению общего и аминного азота 175
4.6 Определение средней молекулярной массы по хроматографическому профилю 176
4.7 Оценка остаточной протеолитической активности 177
ГЛАВА 5. Изучение характеристик фгмб в процессе мембранной обработки 183
5.1 Влияние мембранных обработок на физико-химические свойства гидролизатов молочных белков 184
5.2 Влияние мембранных обработок на биологическую ценность и усвояемость гидролизатов молочных белков 191
5.3 Влияние мембранных обработок на остаточную антигенность 195
5.4 Изучение потенциальной аллергенности фгмб в опытах на животных 200
5.5 Собственные сенсибилизирующие свойства ферментативных гидролизатов белка 204
5.6 Методические принципы расчета процессов мембранного фракционирования ФГМБ 206
ГЛАВА 6. Исследование закономерности удаления фенилаланина из ФГМБ с использованием адсорбционной хроматографии 210
6.1 Хроматографическая очистка фгмб, полученных с использованием «панкреатина» 214
6.2 Хроматографическая очистка фгмб, полученных с использованием «флавоэнзима» 217
6.3 Хроматографическое получение фгмб без фенилаланина на основе нанофильтрационных фракций 229
ГЛАВА 7. Обоснование принципиальной технологической схемы и разработка частных технологий получения фгмб с заданными составом и свойствами 237
7.1 оптимизация технологических параметров фгмб на стадии сгущения, пастеризации и сушки 237
7.1.1 Изучение реологических показателей и выбор оптимальных параметров сгущения 237
7.1.2 Определение режимов пастеризации 238
7.1.3 Обоснование режимов сушки 239
7.2 Обоснование принципиальной технологической схемы получения ФГМБ с регулируемым химическим составом и свойствами 241
7.3 Разработка частных технологий ФГМБ 245
7.3.1 Разработка технологии ФГМБ 1 для продуктов энтерального питания
(полуэлементных смесей) 245
7.3.2 Разработка технологии ФГМБ 2 для гипоаллергенных продуктов лечебно-профіиіактической направленности 247
7.3.3 Разработка технологии ФГМБ 3 для гиппоаллергенных продуктов лечебного назначения 249
7.3.4 Разработка технологии ФГМБ 4 для питания больных фенилкетонурией 251
ГЛАВА 8. Разработка блочно-модульной схемы получения ФГМБ и СП на их основе 255
8.1 Обоснование и разработка принципиальной блочно-модульной схемы получения фгмб и сп на их основе 255
8.2 Разработка частных технологий сп на основе ФГМБ 265
8.2.1 Технология производства продукта «НУТРИЛАКПЕПТИ-СЦТ» 265
8.2.2 Технология производства продукта «НУТРИЛАК-ГА» 269
8.2.3 Технология производства продукта «НУТРИЭН-ЭЛЕМЕНТАЛЬ» 274
8.2.4 Технология производства продукта «НУТРИЭН-ФТИЗИО» 279
8.2.5 Технология производства продукта «НУТРИЭН-ФОРТ» 285
8.2.6 Технология производства продуктов линии «НУТРИГЕН-ФКУ13,15,20» 291
8.2.7 Технология производства продуктов «НУТРИГЕН-ФКУ 30», НУТРИГЕН-ФКУ 40», НУТРИГЕН-ФКУ 70» 294
8.3 Функциональная классификация фгмб и сп на их основе 297
ГЛАВА 9. Практическая реализация результатов исследований. 300
9.1 Организация промышленного производства ФГМБ и СП НА их основе 300
9.2 Разработка научно-технической документации 302
9.3 Социальная значимость производства сп 306
Выводы 308
Список литературы
- Белковый компонент специализированных гипоаллергенных продуктов
- Гипоаллергенные продукты лечебного назначения
- Ферментативный гидролиз и мембранная очистка молочных белков в лабораторных условиях
- Влияние мембранных обработок на биологическую ценность и усвояемость гидролизатов молочных белков
Введение к работе
Актуальность работы. Рациональное питание способствует сохранению здоровья, профилактике заболеваний, а также создает условия для повышения способности организма противостоять неблагоприятным воздействиям окружающей среды и переносить физические и психоэмоциональные нагрузки. На приоритетную значимость питания указывает постановление Правительства РФ №917 от 10.08.98 «О Концепции государственной политики в области здорового питания населения Российской Федерации», рассчитанной на период до 2010 г.
Особое место в современной нутрициологии занимает проблема пищевой недостаточности при критических состояниях. Агрессивные воздействия любой этиологии (травмы, ранения, кровопотери, ожоги, хирургические, вмешательства), а также патологические проявления (онкологические, инфекционные заболевания, воспалительные процессы в печени и поджелудочной железе) развивают неспецифические реакции гиперметаболизма и гиперкатаболизма. Это приводит к нарушениям обмена белков, углеводов, липи-дов, усиленному расходу углеводно-липидных компонентов и распаду тканевых белков. При этом основной чертой всей совокупности изменений обмена веществ является сочетание резкого повышения потребностей организма в белково-энергетических субстратах со снижением толерантности к белку пищи. Специфические требования также предъявляются к белковой состав-. ляющей рациона больных наследственными заболеваниями аминокислотного обмена, пищевой аллергией, в том числе, детей первого года жизни.
В соответствии с вышеизложенным и с учетом опыта зарубежных стран, существует доказанная необходимость промышленного производства продуктов специализированного питания, назначаемых больным в критических состояниях или при нарушении функции пищеварения. Как правило, в их состав в качестве белкового компонента входят гидролизаты белков с различной глубиной гидролиза, которые оказываются зачастую единственным
средством лечебного воздействия, обеспечивающим жизнедеятельность и полноценное развитие больных детей и взрослых с различной патологией.
Ввиду актуальности вопроса создания специализированных продуктов (СП) с заданными свойствами в последние годы отмечается значительное усиление интереса исследователей к процессам их получения. В нашей стране в 70-80-х годах прошлого столетия были созданы и внедрены в клиническую практику отечественные пищевые смеси («Энпиты», «Инпитан», «Ово-лакт» и др.), использование которых положительно повлияло на результаты лечения многих категорий больных и тяжело пострадавших.
Вклад в освоение технологии продуктов для специализированного питания, в том числе на основе молочных белков, внесли В.Г. Высоцкий, Г.Б. Гаврилов, И.А. Евдокимов, П.Ф. Крашенинин, К.С. Ладодо, Н.Н. Липатов, Н.Н. Липатов (мл.), М.Ф. Нестерин, А.А. Покровский, Т.С. Попова, И.А. Рогов, Ю.Я. Свириденко, Н.А. Тихомирова, Э.С. Токаев, В.А. Тутельян, В.Д. Харитонов, А.Г. Храмцов, А.П. Чагаровский, A.M. Шалыгина, В.А. Шатер-ников [18-20, 52, 53, 58, 60, 63-68, 94, 119-121, 125, 128, 132, 133] другие отечественные и зарубежные ученые.
Однако, в начале 90-х годов в Российской Федерации выпуск СП прекратился, и в течение последующих 10 лет на рынке были представлены только зарубежные продукты.
В этой связи направление по созданию ферментативных гидролизатов молочных белков (ФГМБ) и СП на их основе следует признать принципиально новым, позволяющим решить важные социальные проблемы [109, ПО], а также расширить знания в области лечебного питания, что указывает на актуальность выполненных исследований
Научная новизна работы. В работе исследованы особенности ферментативного гидролиза (ФГ) молочных белков в зависимости от их фракционного состава, происхождения ферментных препаратов, их концентрации, температуры, активной кислотности, применения рН-статирования и других факторов. Показано, что решающая роль в формировании качественного и
количественного состава пептидных фракций ФГМБ принадлежит природе используемого ферментного препарата, фермент-субстратному соотношению и условиям гидролиза. Изучено изменение характеристик ФГМБ (молеку-лярно-массового распределения (ММР) пептидных фракций, содержания свободных аминокислот, остаточной антигенности (АГ) в процессе ультрафильтрационной (УФ) очистки и нанофильтрационного (НФ) фракционирования. В результате достигнуто снижение АГ гидролизатов молочного белка и белка молочной сыворотки, достаточное для их использования в лечебных и лечебно-профилактических СП. Получены гидролизаты концентрата сывороточных белков (КСБ) с улучшенными в сравнении с существующими аналогами органолептическими характеристиками. Разработаны принципы и методики расчета мембранной обработки для получения ФГМБ с заданным составом и свойствами с учетом основных технологических факторов. Исследованы закономерности и оптимизированы условия процесса селективной сорбции фенилаланина из различных видов ФГМБ с использованием промышленной адсорбционной хроматографии (АХр), получены ФГМБ с содержанием фенилаланина, сопоставимым с аналогичной характеристикой смесей кристаллических 1-аминокислот, используемых в СП для питания больных фенилкетонурией.
На основе данных литературы и результатов собственных исследований предложена функциональная классификация ФГМБ и СП с их использованием. Исследованы биологическая, энергетическая и пищевая ценность ФГМБ и СП, полученных на их основе, а также их клиническая эффективность.
Практическая значимость и реализация результатов работы в промышленности. На основе исследований, проведенных в лабораторных, пилотных и промышленных масштабах созданы оригинальные технологии, новизна технических решений которых подтверждена авторскими свидетельствами, патентами и положительными решениями на выдачу патентов №№1358890, 1369710, 1446705, 1457192, 1522462, 1608866, 1614169, 1622967,
1658433, 1663800, 1827771, 1839085, 2017427, 2019971, 2054264, 2262240, 2290822, 2290823, 2290824, 2005114358/13, 2005114361/13, 2005114365/13, 2006122680/13. Предложена принципиальная технологическая схема и разработаны частные технологии ФГМБ с использованием различных процессов во взаимосвязи. Обоснована блочно-модульная схема получения ФГМБ и широкой гаммы СП на их основе. Указанные разработки внедрены в производство (ТУ 9229-127-17023360-03, ТУ 9229-133-17023360-04, ТУ 9229-149-17023360-03, ТУ 9229-151-17023360-04, ТУ 9229-152-17023360-04, ТУ 9197-163-17023360-05, ТУ 9229-176-17023360-07).
Апробация работы. Основные результаты работы доложены и получили одобрение на симпозиумах, конгрессах, конференциях, семинарах и совещаниях различного уровня (Киев, 1987; Москва, 1987, 1988, 1990, 1995; Ереван, 1987; София, 1988; Углич, 1988; Вологда, 1988; Минск, 1989; Одесса, 1990; Могилев, 1990; Монреаль, 1990; Краснодар, 1993; Тюмень, 1995; Гродно, 1995; Истра, 1997; Санкт-Петербург, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано более ста печатных работ, в том числе две монографии, 20 статьей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных материалов диссертаций, статьи в научных трудах институтов, материалах Международного молочного конгресса, тезисы в материалах симпозиумов, конференций, а также описания авторских свидетельств, патентов и заявок на выдачу патентов РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
Обоснование физико-химических и биотехнологических закономерностей получения ФГМБ, предназначенных для использования в СП лечебной и лечебно-профилактической направленности;
Результаты изменений качественных и количественных характеристик ФГМБ (степени гидролиза, ММР белковых фракций, АГ и содержания свободных аминокислот) в процессе гидролиза и различных мембранных обработок;
/
3. Требования к исходным ФГМБ и параметры технологического процесса АХр, обеспечивающие освобождение ФГМБ от фенилаланина до уровня, соответствующего современным подходам к диетотерапии больных ФКУ;
4.Концепция создания ФГМБ с направленно-регулируемыми составом и свойствами;
5. Блочно-модульная схема и технологии получения ФГМБ и СП на их основе.
Белковый компонент специализированных гипоаллергенных продуктов
Все это в совокупности создает большие трудности в составлении элиминационных диет так, чтобы они были способны удовлетворять потребность больного в полноценном белке и микронутриен-тах (витаминах, минеральных веществах) [25, 104].
В этой связи большую остроту и актуальность приобретает проблема создания специализированных гипоаллергенных продуктов, содержащих источник полноценного белка, не вызывающего аллергических реакций [60]. Для этого необходимо, чтобы в составе белкового компонента продукта отсутствовали структуры, способные при поступлении с пищей вызывать аллергические реакции.
Как известно, детерминанты, распознаваемые иммунокомпетентными клетками и антителами в белках, могут быть нескольких типов [162, 380]. Это: 1) «последовательные» эпитопы, представляющие собой короткие (несколько остатков) фрагменты пептидной цепи; 2) «петлевые» эпитопы, являющиеся также короткими фрагментами, но жестко стабилизированными дисульфидными мостиками; 3) «конформационные» эпитопы, образованные пространственно сближенными в молекуле белка аминокислотными остатками, принадлежащими к удаленным друг от друга участками последовательности. Если структуры 3-го типа достаточно эффективно разрушаются даже при относительно не глубоком ферментативном гидролиза белка, то детерминанты 1-го и 2-го типа могут сохраняться даже в сравнительно коротких пептидах, состоящих из 10-20 аминокислотных остатков. При этом имеются данные, которые позволяют предположить, что в случае пищевых аллергенов, в частности, такого важного из них, как Р-лактоглобулин коровьего молока [2], аллергенные детерминанты являются именно «последовательными» эпитопами [216, 246].
Свободные аминокислоты и короткие фрагменты пищевых белков, образующиеся при протеолизе, не аллергенны, хотя последние и могут содер жать отдельные аллергенные эпитопы [199, 216]. Это связано, во-первых, с тем, что короткие фрагменты белка неиммуногенны, т.к. не могут быть представлены антигенпрезентирующими клетками Т-хелперам [34, 102]. Во-вторых, для того, чтобы вызвать аллергическую реакцию, аллерген должен привести к сближению в мембране клетки мишени не менее чем двух молекул IgE, то есть должен быть поливалентным (нести несколько эпитопов) [34, 102]. В целом, чем выше степень дефрагментации белковой макромолекулы (до коротких пептидов, содержащих не более 10 аминокислотных остатков, и, в пределе - до свободных аминокислот), тем меньше вероятность проявления данным белковым компонентом аллергенных свойств [262, 270].
В этой связи, рядом аллергологов высказывается мнение, что идеальным путем решения проблемы создания гипоаллергенных продуктов является использование т.н. «элементных» смесей, белковый компонент которых представлен смесью свободных кристаллических 1-аминокислот, воспроизводящей аминокислотный состав какого-либо из природных белков (например, белка женского молока) [111, 155, 245]. Однако, согласно теории адекватного питания, сформулированной академиком A.M. Уголевым [122-124], нутри-тивные потребности организма в наилучшей степени удовлетворяются теми формами пищевых веществ, к которым вид оказался адаптирован в ходе своего эволюционного развития. С этой точки зрения использование в питании больных аллергией смесей кристаллических 1-аминокислот представляется а priori неоптимальным, поскольку в составе продуктов, составляющих естественный рацион человека (как взрослого, так и ребенка) свободные аминокислоты в сколько-нибудь значимых количествах, как правило, отсутствуют, и белковый компонент представлен в основном нерасщепленным макромоле-кулярным белком или, в отдельных случаях, продуктами его частичного ферментативного расщепления-пептонами. Примерами последних являются гамма-фракция казеина и протеозо-пептоны сыворотки коровьего молока [2]. Исходя из этих самых общих соображений, можно утверждать, что питание полуэлементной диетой, в которой белковый компонент в основной своей массе представлен пептидами, является более физиологичным и способно лучше удовлетворить потребность организма больного в нутриентах по сравнению с питанием продуктами на основе аминокислотных смесей. Это положение нуждается, однако, в более конкретной экспериментальной и клинической аргументации.
Во-первых, имеются многочисленные данные литературы о том, что смеси пептидов различной длины всасываются в пищеварительном тракте быстрее и полнее, чем эквивалентные по составу смеси аминокислот [259, 263, 350, 351]. Данный эффект в известной степени зависит от концентрации нутриента в просвете кишки и от состава смеси аминокислот [239], однако в целом он воспроизводим в широком ряду клинических наблюдений и лабо-- раторных исследований на животных. По данным новых исследований скорость абсорбции зависит от длины пептидов: максимальна она, по-видимому, для ди- и трипептидов различного состава [213, 214, 331]. В клетках абсор-бтивного эпителия тонкой кишки выявлены специфические транспортные рецепторы для этих пептидов [231]. Кроме того, смеси аминокислот являются, в сравнении с пептидами, гиперосмолярными и в их присутствии отмечается приток жидкости из серозного пространства в просвет кишки, то есть в направлении, противоположном направлению всасывания пищевых субстратов. Это может приводить к торможению абсорбции различных нутриентов и, в том числе, самого белкового компонента [206]. Помимо собственно осмотического механизма, свободные аминокислоты могут стимулировать секрецию жидкости в просвет кишки за счет стимуляции ими выработки кишечного гормона секретина [213]. Напротив, короткие пептиды обладают способностью усиливать всасывание воды из просвета кишечника [33] и даже способны частично подавлять действие такого мощного диарейного фактора как холерный токсин [272]. Присутствующие в составе гидролизатов пептиды способствуют увеличению активности ферментов пристеночного мембранного пищеварения, что приводит к дополнительному улучшению ассимиляции белка [338].
Гипоаллергенные продукты лечебного назначения
Согласно Codex Alimentarius, специализированные продукты (Foods for special dietary uses - дословно: продукты для особых пищевых применений)-«это те продукты, которые специальным образом обработаны или составлены с целью удовлетворения особых пищевых потребностей, которые возникают вследствие особых физических и (или) физиологических условий и (или) наличия определенных болезней и расстройств и которые представляются в таковом качестве (в число этих продуктов входят, в том числе и продукты для младенцев и детей раннего возраста). Состав этих пищевых продуктов должен значительно отличаться от состава обычных продуктов данного типа, если таковые существуют»[184].
В числе СП отдельно выделяются лечебные продукты (Foods for special medical purposes - дословно: продукты для специальных медицинских целей) - то есть «группа специализированных продуктов, которые специальным образом обработаны или составлены и представляются для пищевой поддержки (management) пациентов и могут использоваться только под наблюдением врача. Они предназначены в качестве единственного источника питания или дополнительного питания пациентов с ограниченной или нарушенной способностью принимать, переваривать, всасывать и метаболизировать обычные продукты питания или определенные нутриенты в их составе или пациентов, которые имеют особые определяемые медицинскими показаниями потребности в нутриентах, которые не могут быть удовлетворены только лишь путём модификации нормальной диеты, либо за счет специализированных продуктов других типов, либо за счет того и другого вместе».
В данном разделе главы на основании анализа данных литературы, представленного в главе 1, патентной информации, сведений о составе СП ведущих мировых производителей и действующей в России нормативно-правовой базы будут сформулированы основные принципы, в соответствии с которым формулируются медико-биологические требования к составу и по казателям безопасности [118] СП различных типов, производимых на основе ФГМБ.
Гипоаллергенные продукты лечебного назначения СП, предназначенные для питания больных аллергическими заболеваниями, в первую очередь, детей раннего возраста, которым показана элими-национная диета с исключением белков коровьего молока, должны удовлетворять комплексу требований, которые далеко не исчерпываются качественным и количественным составом ФГМБ, используемого в качестве белкового компонента.
Главное из этих требований - сбалансированный состав СП, который может применяться в течение длительного времени в качестве единственного источника вскармливания детей с аллергическими заболеваниями, в том числе осложненными непереносимостью лактозы и нарушением усвоения белка и жира [10, 98]. Все пищевые компоненты, используемые при изготовлении продукта, должны быть допущены для питания ребенка, а применяемая технология не должна снижать их пищевую и биологическую ценность, привносить и вызывать образование токсичных и других нежелательных веществ [99, 101]. Продукт должен выпускаться в сухом виде и легко растворяться в воде температурой 35-40С с образованием стабильной жидкой смеси, обеспечивающей согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 [27] энергетическую ценность не менее 67 ккал/100 мл, сбалансированное содержание пищевых веществ и осмолярность не выше 320 мОсм/л (предпочтительно, не более 220 мОсм/л).
Белковый компонент продукта должен быть представлен ферментативным гидролизатом белков коровьего молока с высокой степенью гидролиза (такой тип гидролизатов определяется в ряде зарубежных работ не совсем корректно как «полный гидролизат», см. глава 1.1.2). Преобладающая часть пептидов такого гидролизата должна быть сосредоточена в области молекулярных масс менее 1-2 кД, а наличие полипептидов с массой более 10 кД не допускается. Пример ММР белкового компонента рассматриваемого продукта представлен в таблице 2.2. Таблица 2.2 Рекомендуемое ММР пептидов в белковом компоненте СП для вскармливания детей 1-го года жизни, страдающих непереносимостью бел ков коровьего молока
Фракции Средняя мол.масса пептидов, кД Диапазон мол. масс (кД), 12 6-12 3,5-6,0 0,6-3,5 0,6 содержание %% 0 0 0,1 15,0 84,9 1,4 Содержание взаимодействующих с антителами в тесте ИФА антигенов коровьего молока в составе белкового компонента продукта должно характеризоваться величиной не более 10"5 доли общего содержания белка. Аминокислотный состав белкового компонента должен быть максимально приближен к составу идеального белка, за который в данном случае принимается белок коровьего молока. При использовании ФГМБ на основе казеина это практически недостижимо и возникает необходимость в обогащении продукта некоторыми кристаллическими 1-аминокислотами (триптофан, метионин), что нежелательно, так как приводит к удорожанию продукта и увеличению его осмолярности. Поэтому предпочтительной формой белкового компонента является ФГМБ на основе КСБ или смеси КСБ/КМБ в соотношении 1:1, биологическая ценность которых по шкале женского молока приближается к 100%. Продукт обогащается таурином в количестве 32 мг на 100 г сухого продукта. Рекомендуемое содержание незаменимых аминокислот в продукте представлено в таблице 2.3.
Ферментативный гидролиз и мембранная очистка молочных белков в лабораторных условиях
Лабораторные исследования по разработке методов получения ферментативных гидролизатов белков коровьего молока были проведены с целью оптимизации схем гидролиза для дальнейшего перехода к промышленным выработкам.
Предварительные исследования, проведенные с различными коммерческими ферментными препаратами, показали, что наиболее оптимальными для получения гидролизатов белков коровьего молока (КСБ и КМБ) широкого спектра применения являются «Флавоэнзим» из Asp. oryzae (производства «Novozyme», Дания) и «Панкреатин» из поджелудочной железы крупного рогатого скота (производства предприятия «Самсон», Санкт-Петербург, Россия или аналогичного препарата импортного производства).
В качестве белковых субстратов использовали концентрат белков коровьего молока (КМБ) BE 8527 (Дания) и концентрат сывороточных белков коровьего молока (КСБ) «Лакпродан 80» (Дания). Остальные использованные реактивы имели степень чистоты не ниже Х.Ч.
Гидролиз проводили без предварительной термической обработки субстратов в водяном термостате ТВС или суховоздушном ТС-8М (оба производства России) с перемешиванием, при температуре +50С, если иное не указано (данная температура является оптимальной для «Флавоэнзима» и «Панкреатина» по данным литературы [115], а также согласно рекомендациям фирм изготовителей). Контроль рН осуществляли с использованием лабораторных рН-метров рН-410 (Россия) или ЭВ-74 (СССР). Подведение рН осуществляли 1,0 М раствором гидроокиси натрия или 1,0 М соляной кислотой. По окончании процесса ферментный препарат в составе гидролизата инактивировали нагреванием при 90-95С в течение 5-10 мин.
Ультрафильтрацию полученных гидролизатов проводили на лабораторной установке «МИНИТАН» ( МШіроге»,США) с использованием работающих в тангенциальном потоке мембран с диаметром пор 10 кД [14].
НФ проводили на установке производства «ВЛАДИСАРТ» (Россия), в которой была установлена нанофильтрационная мембрана с селективностью около 0,5 кД (для водных растворов при рН 6-6,5).
Полученные гидролизаты лиофильно высушивали на лабораторной сублимационной сушке «ALPHA 1-5» (Австрия).
Ферментативный гидролиз и мембранная очистка и фрак ционирование молочных белков в промышленных условиях При переходе на промышленные условия получения ФГМБ на основе. КСБ и КМБ было осуществлено масштабирование условий ФГ и мембранной очистки, оптимизированных в лабораторных условиях [15, 16].
В основу получения гидролизатов молочных белков со сниженным содержанием фенилаланина был положен метод [318] со значительными модификациями. Применяли хроматографический принцип разделения [1] с использованием в качестве сорбента неподвижной твердой фазы ХАД-16 (Франция), представляющей собой пористые гранулы химически модифицированного полистирола. На хроматографическую колонку (2,5x40 см), предварительно заполненную носителем ХАД-16 и уравновешенную дистиллированной водой, через перистальтический насос Р-1 (Pharmacia, Швеция) наносили водный раствор белкового гидролизата концентрацией от 20 до 45% по сухим веществам в объёме от 10 до 25 мл. Наносимый раствор был предварительно осветлен микрофильтрацией через мембрану с размером пор 0,2 мкм. После этого проводили элюирование дистиллированной водой со скоростью 2,0 мл/мин в течение 100 минут, отбирая хроматографические фракции на коллектор FRAC-100 («Pharmacia», Швеция). Колонку далее регенерировали последовательным пропусканием 600 мл 0,2 М гидроокиси натрия, 500 мл 0,1 М соляной кислоты и 1000 мл дистиллированной воды. В отобранных фракциях измеряли оптическую плотность при 280 нм на спектрофотометре СФ-26 или СФ-46 и определяли содержание сухих веществ рефрактометрическим методом, а также проводили анализ ММР методом эксклюзионной хроматографии (см. ниже). После этого фракции лиофильно высушивали. В высушенных фракциях определяли содержание фенилаланина методом ВЭЖХ на обращенной фазе [105, 106].
Влияние мембранных обработок на биологическую ценность и усвояемость гидролизатов молочных белков
В целях сравнительной оценки степени гидролиза в полученных нами различных гидролизатах белков коровьего молока было определено отноше-_ ние аминного азота к общему азоту, так, как это рекомендуется в руководстве [115]. При этом было показано, что рассматриваемое отношение составляет в разных образцах от 35 до 65%. Очевидно, что этот результат является заведомо завышенным, так как уже при содержании аминного азота 35% от общего азота образца практически каждая третья пептидная связь белкового субстрата должна быть гидролизована. При этом на эксклюзионной хроматограмме подавляющая часть аминокислотно-пептидного материала должна была бы выйти в диапазоне молекулярных масс менее 1 кД, т.е., по существу, в полном объеме хроматографической колонки. Однако практически на всех полученных хроматограммах наблюдаются пики с молекулярными массами в несколько кД и даже десятков кД (см. рисунки 4.1-4.11). Следовательно, показатель отношения N ,„,/N06111% по-видимому непосредственно не соответствует степени гидролиза, которая представляет собой долю гидролизованных пептидных связей в белковом субстрате по отношению к общему числу пептидных связей. Одной из причин такого несоответствия может быть неодинаковая величина коэффициентов молярной экстинкции комплексов ТНБС с различными пептидами, с одной стороны, и свободными аминокислотами, используемыми при построении стандартного графика — с другой. Так, в частности, в исследованиях по получению гидролизатов соево го белка (которые не вошли в настоящую работу), было показано, что соотношение NaM11H/N06Ul% для фракции пептидов в диапазоне молекулярных масс 1-4 кД составляет 447%, то есть кажущееся содержание аминного азота почти в 5 раз превосходит содержание общего азота в образце.
Таким образом, широко практикуемое в ряде работ количественное определение степени гидролиза по соотношению аминного и общего азота следует признать некорректным, а глубину гидролиза полученных в этих исследованиях гидролизатов, по-видимому, завышенной. Рассматриваемый показатель может служить только целям качественной сравнительной оценки глубины гидролиза при экспериментальном подборе условий проведения процесса в лабораторных и промышленных условиях.
Одним из методов оценки степени гидролиза может служить показатель средней молекулярной массы, полученной интегрированием хромато-графического профиля. Средняя молекулярная масса должна соответствовать точке на оси абсцисс (молекулярные массы), которая делит пополам общую площадь (или массу) под кривой хроматограммы от свободного до полного объема колонки.
В таблице 4.15 приведены результаты такого расчета для гидролизатов КМБ (BE 8527) «Флавоэнзимом» через 20 часов проведения реакции при различной концентрации фермента (см. таблица 4.11 и рисунок 4.10).
Полученные результаты в большей степени соответствуют реальной степени гидролиза, чем это следует из данных по определению отношения аминного и общего азота. Следует, однако, отметить, что и эти результаты должны рассматриваться, строго говоря, как относительные вследствие того, что коэффициент экстинкции отдельных хроматографических фракций при используемой нами длине волны 280 нм может различаться вследствие неодинакового содержания в них остатков ароматических аминокислот.
Для более точного определения средней молекулярной массы (и степени гидролиза) необходимо было бы проводить полный аминокислотный анализ хроматографических фракций с последующим пересчетом этих результатов на основании данных по общему азоту, либо использовать хромато-графическую систему с масс-пролетным проточным детектором, позволяющую определить непосредственно молекулярные массы индивидуальных пептидов, составляющих образец.
