Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Аналитический обзор 13
1.1 Особенности строения и свойства L-фенилаланин-аммоний-лиазы 13
1.2 Научные и практические аспекты получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы 26
1.3 Прикладное использование L-фенилаланин-аммоний-лиазы 68
1.4 Обоснование основных направлений исследований, их цель и задачи 72
ГЛАВА 2 Методология проведения исследований 75
2.1 Организация выполнения работы 75
2.2 Объекты исследований 79
2.3 Используемое оборудование 84
2.4 Методы проведения исследований 85
ГЛАВА 3 Разработка технологии получения направленных гидролизатов молочной сыворотки 113
3.1 Выбор ферментов для проведения направленного гидролиза белков молочной сыворотки 113
3.2 Изучение технологических режимов и условий проведения направленного ферментативного гидролиза белков молочной сыворотки 119
3.3 Изучение функциональных свойств направленных гидролизатов белков молочной сыворотки 134
3.4 Заключение по третьей главе 139
ГЛАВА 4 Скрининг и идентификация пигментных дрожжей, продуцирующих L-фенилаланин-аммоний лиазу и их физиолого-биохимические характеристики 143
4.1 Разработка ПНР-системы для идентификации гена pal пигментных дрожжей 143
4.2 Анализ нуклеотидного состава гєнараї у выбранных штаммов дрожжей 148
4.3 Изучение фенотипических особенностей и биохимических свойств выбранных культур для выбора дальнейших объектов исследований 156
4.4 Выбор штамма суперпродуцента L-фенилаланин-аммоний-лиазы 160
4.5 Заключение по четвертой главе 182
ГЛАВА 5 Моделирование и оптимизация технологическогопроцесса получения pal 186
5.1 Подбор компонентов и оптимизация питательной среды для культивирования Aureobasidium pullulans 863 186
5.2 Исследование влияния параметров культивирования пигментных дрожжей на качественные показатели продукта биосинтеза 199
5.3 Разработка технологии выделения и очистки PAL 215
5.4 Заключение по пятой главе 221
ГЛАВА 6 Разработка технологии иммобилизации pal на наночастицы 223
6.1 Сравнительная характеристика химического состава и физических свойств частиц оксида железа Fe203 и Fe304 224
6.2 Оптимизация концентраций конденсирующих агентов, используемых при иммобилизации PAL на частицы Fe203, функционализированные тио-феновыми и сложноэфирными группами 232
6.3 Изучение физико-химических свойств нативной и иммобилизованной PAL 235
Технологическая схема получения иммобилизованной PAL на наночастицы Fe304 247
6.4 Заключение по шестой главе 249
ГЛАВА 7 Разработка технологии лиофилизации PAL 251
7.1 Изучение теплофизических характеристик PAL 252
7.2 Исследование влияния процесса замораживания на активность PAL 254
7.3 Определение криоскопических температур PAL 256
7.4 Моделирование процессов кристаллизации влаги при замораживании 258 ферментного препарата PAL 4
7.5 Изучение влияния режимных параметров лиофилизации на ее продолжи-266 тельность 7.6 Изучение кинетики процесса лиофильной сушки PAL 274
7.7 Заключение по седьмой главе 281
ГЛАВА 8 Практическая реализация результатов исследований 284
8.1. Способ получения белкового эквивалента продукта, предназначенного для лечения больных фенилкетонурией (патент РФ №2376893) 284
8.2 Способ выделения и очистки фермента 286
8.3. Способ получения иммобилизованного фермента 289
8.4. Способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах (патент РФ №2460790) 291
8.5. Способ лиофилизации фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы 294
8.6. Ферментный препарат L-фенилаланин-аммоний лиаза (ТУ 9291-144-02068315-2011) 296
8.7. Заключение по восьмой главе 299
Заключение 300
Список сокращений и условных обозначений 307
Список литературы
- Прикладное использование L-фенилаланин-аммоний-лиазы
- Используемое оборудование
- Изучение функциональных свойств направленных гидролизатов белков молочной сыворотки
- Исследование влияния параметров культивирования пигментных дрожжей на качественные показатели продукта биосинтеза
Введение к работе
Актуальность работы. Промышленное производство продуктов специализированного питания жизненно необходимо больным в критических и хронических состояниях, в т.ч. при нарушении функции пищеварения. Основу таких продуктов, как правило, составляют гидролизаты белков с различной степенью гидролиза, зачастую являясь единственно возможным средством при терапевтическом воздействии, обеспечивающем полноценное развитие детей и жизнедеятельность взрослых с различной патологией.
К таким патологиям относится фенилкетонурия – наследственное заболевание, вызванное нарушением перехода фенилаланина (незаменимой аминокислоты) в тирозин и приводящее к задержке психического развития и тяжелым поражениям центральной нервной системы.
Количество фенилаланина в питании таких больных должно быть строго нормировано с учетом возраста больного, что, как правило, достигается потреблением специализированных продуктов. Одним из направлений получения таких продуктов является использование L-фенилаланин-аммоний-лиазы (PAL) (КФ 4.3.1.5), которая катализирует реакцию обратимого дезаминирования L-фенилаланина до безопасных для организма соединений: транс-коричной кислоты и аммиака.
PAL является ключевым продуктом метаболизма фенилпропаноидов в растениях и грибах, где вовлечена в биосинтез вторичных метаболитов (флаво-ноидов, фуранокумаринов, компонентов клеточный стенки) и существует в виде множественных изоформ. Она обнаружена в активной форме в водорослях, актиномицетах, 12 видах базидиомицетов, разрушающих древесину. Среди микроорганизмов, обладающих PAL-активностью, известны некоторые штаммы красных дрожжей Rhodotorula, Rhodosporidium и Sporobolomyces и два представителя актиномицетов – продуцентов митомицина.
Данный фермент находит применение и как продукт самостоятельный в терапии и/или диагностике больных фенилкетонурией, как вспомогательный в производстве продуктов питания специального назначения, а также в биотехнологическом производстве L-фенилаланина из транс-коричной кислоты, для подавления роста злокачественных клеток, стимулирования роста растений и т.д.
Все вышесказанное подтверждает актуальность работы.
Степень разработанности. Существенный вклад в создание и освоение технологии получения специализированных продуктов питания внесли Г.Б. Гаврилов, Н.Б. Гаврилова, В.И. Ганина, Н.И. Дунченко, И.А. Евдокимов, В.И. Круглик, К.С. Ладодо, Л.А. Остроумов, А.Н. Петров, В.О. Попов, Г.Ю. Сажинов, В.А. Тутельян, В.Д. Харитонов, И.С. Хамагаева, А.Г. Храмцов; ферментного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы – В.И. Муштаев, M. Jason Мас Donald, H. Orum, O.F. Rasmussen.
Разработка новых и усовершенствование существующих технологий получения ферментного препарата PAL требует нахождения новых, более интенсивных источников его сверхсинтеза, что невозможно без изучения генетических особенностей уже известных продуцентов. В базах данных генетических
последовательностей (EMBL и GeneBank) обнаружено только 26 последовательностей генома микроорганизмов, обладающих PAL-активностью. Поэтому актуальны поиск микроорганизмов, обладающих L-фенилаланин-аммоний-лиазной активностью, на основе анализа генетических последовательностей их генома, разработка технологий получения и использования L-фенилаланин-аммоний-лиазы в производстве специализированных молочных продуктов. Отдельные этапы работы выполнены в рамках:
ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме «Молекулярное клонирование и экспрессия гена pal, обеспечивающего биотрансформацию фенилаланина с целью разработки технологии получения продуктов питания для лечения больных фенилкетону-рией», государственный контракт № П1701;
ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме «Разработка технологии получения продуктов питания для больных наследственными нарушениями аминокислотного обмена», государственный контракт № 16.740.11.0239;
ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме «Разработка альтернативных подходов получения продуктов для больных наследственными нарушениями аминокислотного обмена с использованием методов биоинформатики и математического моделирования», соглашение № 14.В37.21.0565;
и при финансовой поддержке:
- гранта Президента Российской Федерации МД-48.2009.4, договор
№02.120.11.48-МД по теме «Биохимический и геномный анализ экспрессии
гена pal с целью получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы в связи с созданием
продуктов питания для больных фенилкетонурией»;
аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 года)», задание № 2.1.2/3566 по теме «Разработка биотехнологии получения специфических ферментов, продуцируемых микроорганизмами»;
Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина (г. Москва, договор № 154/1 от 23.03.2012 г.).
Цель и задачи исследования. Целью работы является развитие существующих и создание новых биотехнологий специализированных молочных продуктов с использованием L-фенилаланин-аммоний-лиазы.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
разработать технологию получения направленных гидролизатов белков молочной сыворотки, предназначенных для производства продуктов питания для больных фенилкетонурией;
сформировать стратегию скрининга пигментных дрожжей, отличающихся способностью к синтезу L-фенилаланин-аммоний-лиазы, и изучить фе-нотипические особенности и биохимические свойства штаммов-продуцентов L-фенилаланин-аммоний-лиазы;
разработать технологию получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы, осуществить выбор штамма ее суперпродуцента, подобрать компоненты и оптими-
зировать состав питательной среды для его культивирования, изучить влияние параметров процесса периодического культивирования выбранного штамма на выход L-фенилаланин-аммоний-лиазы и ее активность, разработать технологию выделения и очистки полученного ферментного препарата;
разработать технологию иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы и исследовать основные физико-химические, биохимические и каталитические свойства нативной и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы ;
разработать технологию лиофилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы, обеспечивающую максимальное сохранение ее активности в процессе хранения;
- использовать установленные закономерности для разработки техниче
ских документов на ферментный препарат и специализированные молочные
продукты на его основе, а также внедрения результатов исследования в про
мышленности, в т.ч. путем трансфера технологий.
Научная новизна. Разработана технология получения целенаправленных гидролизатов белков молочной сыворотки, обеспечивающая максимальное удаление фенилаланина из полипептидной цепи.
Проведен молекулярно-функциональный скрининг группы пигментных дрожжей, из которых выделено 19 новых продуцентов L-фенилаланин-аммоний-лиазы (Aureobasidium pullulans Y863, Bullera alba Y1581, Bullera piri-cola Y1577, Candida glabrata Y2813, C. maltosa Y242, Cryptococcus laurentii Y227, Cr. macerans Y2763, Cystofilobasidium capitatum Y1852, Debaryomyces castellii Y968, D. robertsiae Y3392, Dioszegia hungarica Y3208, Dioszegia sp. Y3320, Geotrichum klebahnii Y3053, Phaffia rhodozyma Y1668, Rhodosporidium diobovatum Y1565, Rh. infirmominiatum Y1569, Rh. glutinis Y77, Rh. lactosa Y2770, Rh. rubra Y1193, Saccharomyces cerevisiae Y1127, S. kluyveri Y2559, Spo-robolomyces holsaticus Y991, Tilletiopsis washingtonensis Y1650, Torulopsis apico-la Y566, Tremella foliacea Y1624, Tr. mesenterica Y1625).
Установлена корреляция между генетической организацией штаммов микроорганизмов и их биосинтезом L-фенилаланин-аммоний-лиазы.
На основе методов случайных процессов, дисперсионного анализа и полного факторного эксперимента исследованы закономерности периодического глубинного культивирования пигментных дрожжей и биосинтеза PAL с использованием модели Людекинга-Пайри, выделен высокоактивный продуцент PAL - штамм Aureobasidium pullulans, для него определен компонентный состав субстрата, теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены режимы ферментации PAL.
Разработаны методики организации биосинтеза, выделения и очистки, иммобилизации на наноносителях и лиофилизации PAL, позволяющие не только получить фермент, превосходящий по качеству существующие аналоги, но и гарантировать его сохранность на протяжении более восемь месяцев.
Исследованы состав, свойства и хранимоспособность новых видов специализированных молочных продуктов с использованием PAL, предназначенных для питания больных фенилкетонурией.
Практическая значимость. На основе теоретических и экспериментальных исследований сформулированы требования к технологическим процессам, связанным с получением продуктов питания для больных фенилкетонурией: параметры и условия гидролиза белков молочной сыворотки, обеспечивающие максимальное удаление фенилаланина из полипептидной цепи; параметры и условия периодического культивирования Aureobasidium pullulans Y863; биосинтеза, выделения и очистки, иммобилизации на наноносители, лиофилизации PAL, направленного гидролиза молочного сырья. Техническая новизна разработанных технологических решений подтверждена патентами РФ № 2376893 «Способ получения белкового эквивалента продукта, предназначенного для лечения больных фенил-кетонурией»; № 2415943 «Биологически активный пептид, полученный из молочного белка»; № 2425879 «Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ»; № 2437935 «Способ производства мультиферментного препарата»; № 2460790 «Способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах».
Разработаны и утверждены технические условия и технологическая инструкция на производство L-фенилаланин-аммоний-лиазы (ТУ 9291-144-02068315-2011 и ТИ 9291-144-02068315-2011). Разработана и аттестована методика определения коричной кислоты и ее солей методом капиллярного электрофореза в алкогольных и газированных безалкогольных напитках, не содержащих фенила-ланина гидролизатах молочных белков (свидетельство № 01.00225/205-21-11). Результаты моделирования реализованы в программе для ЭВМ «Программа моделирования периодического процесса культивирования пигментных дрожжей» (свидетельство № 2014611451 от 03.02.2014 г.).
Составлена техническая документация на производство белковых продуктов для больных фенилкетонурией «Фенилаланин-фри» (ТУ 9745-145-020683815-2012 и ТИ 9745-145-020683815-2012); рецептуры питательных сред для культивирования пигментных дрожжей (№ 01.01264/212-21-11), методики выделения и очистки PAL (№ 01.00106/006-21-11); иммобилизации PAL на наночастицы оксида железа (№ 01.00107/007-21-11); лиофилизации PAL (№ 01.00108/008-21-11); идентификации микроорганизмов, обладающих L-фенилаланин-аммоний-лиазной активностью (№ 01.00114/104-21-12).
Наработана и протестирована партия фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы и проведены его опытно-производственные испытания in vivo. В экспериментах in vivo установлена антипролиферативная активность L-фенилаланин-аммоний-лиазы, синтезированной штаммом Aureobasidium pullulans Y863, что открывает перспективы ее использования как противоопухолевого агента.
Результаты исследований используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» при подготовке студентов и магистрантов, обучающихся по направлениям 240700 «Биотехнология» и 141200 «Холодильная, криогенная техника и системы жизнеобеспечения», а также при организации научно-исследовательской и практической работы аспирантов.
Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты работы представлены на симпозиумах, конгрессах, конференциях,
семинарах и совещаниях различного уровня за рубежом (Армения, Германия, Канада, США) и в России (Барнаул, Бийск, Волгоград, Звенигород, Москва, Новосибирск, Омск, Санкт-Петербург, Ставрополь, Тамбов и др.).
Результаты диссертационной работы прошли апробацию на предприятиях биотехнологической и пищевой промышленности: ООО «Биотек», ООО «Инновационно-исследовательский центр», Институт молекулярной биологии (ИМБ) Национальной академии наук Республики Армения (НАН РА), ЗАО «Хладо-техника», ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» и внедрены в производство на ClusterNanoTech LTD (Англия) путем трансфера технологий в рамках лицензионного договора № 4/13 от 20.12.2013 г.
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в более чем 70 печатных работах, в том числе монографиях, статьях в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных материалов диссертационных исследований: «Journal of Analytical Chemistry», «Biotechnology and Applied Biochemistry», «Биомедицинская химия», «Нанотехнологии и наноматериалы», «Известия высших учебных заведений. Серия «Химия и химическая технология», «Биотехнология», «Фундаментальные исследования», «Журнал аналитической химии», «Технология живых систем», «Известия Самарского научного центра Российской академии наук», «Вестник ВСГТУ», «Техника и технология пищевых производств», «Достижения науки и техники АПК», «Молочная промышленность», «Хранение и переработка сельхозсырья», отчетах по НИОКР, а также патентах РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Технология получения направленных гидролизатов белков молочной сыворотки.
-
Стратегия молекулярно-функционального поиска микроорганизмов – продуцентов L-фенилаланин-аммоний-лиазы; последовательности генов, ответственных за синтез L-фенилаланин-аммоний-лиазы; фенотипические особенности и биохимические свойства изучаемых культур.
-
Факторы, повышающие PAL-активность биотехнологических процессов.
-
Технология получения L-фенилаланин-аммоний-лиазы.
-
Параметры использования L-фенилаланин-аммоний-лиазы в производстве продуктов питания для больных фенилкетонурией.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, восьми глав, результатов и выводов, списка использованных литературных источников (524 наименования) и 15 приложений. Основной текст изложен на 309 страницах, содержит 83 таблицы, 98 рисунков.
Прикладное использование L-фенилаланин-аммоний-лиазы
С момента своего открытия Koukol and Conn (1961) PAL интенсивно изучалась, и аспекты ее энзимологии, роль в развитии растений и организация в отношении других ферментов фенилпропаноидного пути являлись предметом многочисленных публикаций [347, 372, 451]. Hahlbrock and Scheel (1989) описали особенности PAL и ее гена в петрушке, картофеле, французских бобах и клеточных культурах. В этих видах и многих других покрытосеменных растениях PAL, как было показано, существует в виде мультиплетных ферментов с различными кинетическими свойствами. Напротив, недавние исследования двух видов хвои Pinus banksiana Lamb, (гнездовая сосна) и Pinus taeda L.(сосна ладанная) позволили обнаружить только одну форму PAL [284, 467]. Такие результаты также были опубликованы для подсолнечника, бамбука и земляники [288, 289, 325, 326, 350].
Существование изоформ PAL приписывалось наличию небольшого семейства генов раї в покрытосеменных растениях, таких как бобы, рис, петрушка Ага-bidopsis и люцерна [253, 319, 327, 370, 399, 409, 452, 464]. Однако понимание генной организации PAL в растениях до сих пор находится в ранней стадии. Работы по картофелю [348] и сосне ладанной [467] выявили значительные отклонения от образца небольшого семейства генов pal. Оказалось, что геном картофеля содержит до 40 генов раї, по крайней мере, 10 из которых потенциально активны.
Whetten and Sederoff (1992) сообщали, что на другом конце спектра есть только одна копия гена pal в P. taeda, что подтверждается обнаружением хрома-тографически и кинетически различимых форм PAL в соснах.
Несмотря на очевидные различия в геномной организации генов раї в различных родах, гены pal идентифицировали с получением от 60 до 80% гомологии в кодируемых областях. Верхний диапазон - это сравнение между представителями семейства бобовых - люцерна бобы [327], в то время как нижняя степень гомологии получена из сравнения генов pal сосны и других покрытосеменных растений [467]. Структурная особенность большинства доступных последовательностей генов pal - это присутствие одного интрона [409]. Исключением является ген pal из Arabidopsis, который содержит две несмешивающиеся последовательности гена [466]. Также существует доказательство того, что гены pal Р. banksiana совсем не содержат интронов. Гены pal грибов, напротив, оказывается, содержат мультиплетные интроны [371]. Наибольшая степень сохранения последовательностей между генами PALB растениях проявляется во втором экзоне, следовательно можно предположить, что данная область может кодировать важный каталитический центр [348, 409].
PAL может иметь большое практическое применение в медицине для количественного определения L-фенилаланина в крови, для подавления роста раковых клеток - неоплазм, при лечении фенилкетонурии.
Количественное определение L-фенилаланина в плазме и сыворотке крови больного проводят с помощью PAL, выделенной из дрожжей Rhodotorula glutinis [316]. Количество аминокислоты определяют спектрофотометрически по изменению поглощения при 278 нм, что соответствует максимуму поглощения транскоричной кислоты.
Подавление роста некоторых неоплазм у животных и человека наблюдается при удалении L-фенилаланина из пищевого рациона. Это обусловлено тем, что неоплазмы содержат больше данной аминокислоты, чем нормальные ткани. Однако при этом уровень L-фенилаланина в плазме крови уменьшается очень медленно. Применение PAL из Rhodotorula glutinis подавляет рост, деление и жизнеспособность муриновых и лейкомных лимфоцитов у животных и не оказывает влияния на нормальные неделящиеся лимфоциты. Очищенный препарат PAL в крови мышей вызывает гибель 80% злокачественных клеток [405]. Такое действие PAL оказывает, создавая в делящихся злокачественных клетках дефицит незаменимой аминокислоты - L-фенилаланина [356].
Классическая фенилкетонурия вызывается нарушением в функционировании гидроксилазы фенилаланина - фермента, превращающего L-фенилаланин в L-тирозин. Это заболевание характеризуется избытком L-фенилаланина в крови и спинномозговой жидкости. Болезнь вызывает существенные необратимые нейропсихические расстройства. Использование гидроксилазы фенилаланина для лечения фенилкетонурии не имеет практического значения из-за трудностей, связанных с выделением и очисткой фермента из тканей млекопи 71 тающих. Психические расстройства, сопровождающие заболевание, предотвращаются, если больным давать пищу с пониженным содержанием L-фенилаланина. С этой целью применяют аминокислотные смеси, лишенные L-фенилаланина. Для их приготовления может использоваться PAL. Показано, что ацетоновые препараты клеток Rhodotorula texensis, активные по PAL, разрушают L-фенилаланин в гидро-лизатах сыра и яиц [245]. Однако даже при использовании обедненной пищи у больных фенилкетонурией содержание L-фенилаланина увеличивается при инфекционных заболеваниях. Поэтому вызывает большой интерес способность PAL in vivo в крови разрушать L-фенилаланин до транс-коричной кислоты, которая может через почки выводиться из организма [198]. Это может использоваться не только при лечении фенилкетонурии, но и для подавления роста неоплазм [298].
Однако очищенная PAL, введенная в кровь животного, вызывает тяжелые иммунологические реакции, и, кроме того, содержание в крови фермента быстро уменьшается. Эти негативные моменты могут быть преодолены при иммобилизации фермента.
Используемое оборудование
При создании продуктов для и детей, и взрослых, больных фенилкетонурией, особое внимание уделяется остаточному содержанию фенилаланина в продукте, что может быть достигнуто в результате проведения целенаправленного гидролиза белков молока с последующей его трансформацией или адсорбцией. Достигнуты значительные успехи в установлении механизмов каталитического действия бактериальных протеаз, особенностей расщепления отдельных белков казеиновой фракции и соответствующих пептидных карт [479]. Однако использование казеина ограничивается наличием в его составе большого количества гидрофобных аминокислот, вследствие чего его гидролизаты обладают горьким вкусом и другими посторонними органолептическими характеристиками, труднорастворимы, особенно в кислотных условиях. В то же время проблема комплексной переработки молочной сыворотки до сих пор не решена, что указывает на актуальность проводимых в данной главе исследований.
Молочная сыворотка является полноценным сырьем, которое может быть использовано в качестве компонента молочных смесей для детского питания, продуктов питания профилактического и лечебного назначения. Она содержит в своем составе углеводы, белковые вещества, минеральные соли, молочный жир. Всего в сыворотке обнаружено более 200 соединений. Основной объем в сухих веществах сыворотки занимает углевод - лактоза (около 70%). На долю других компонентов (не Сахаров) приходится 30%, из которых основное место занимают белковые вещества.
В связи с этим актуальным является изучение фракционного состава белков молочной сыворотки, используемой в эксперименте. Результаты исследований представлены в таблице 3.1.1.
Гидролиз белков молочной сыворотки придает им желательные функциональные свойства, снижает аллергенность, повышает усвояемость вследствие лучшей перевариваемости короткоцепочечных пептидов в желудочно-кишечном тракте по сравнению с нативными белками и аминокислотами.
Гидролиз сывороточных белков может быть осуществлен химическим и ферментативным способами [231]. Наибольший интерес вызывает ферментативный гидролиз, при котором молекулярная масса пептидов гидролизата снижается в 300-1000 раз, что снижает аллергенность белкового компонента молочных продуктов.
Основными характеристиками ферментативных гидролизатов являются: степень гидролиза белковых субстратов, пептидный состав и остаточная антиген-ность - количество нерасщепленного белка, сохраняющего способность взаимодействовать с антителами. Сложность получения частичных гидролизатов связана с выбором высокоактивных ферментов для эффективного расщепления белков молока: а-лактальбумина, Р-лактоглобулина, сывороточного альбумина, для которых характерна компактная глобулярная структура, определяющая относительную устойчивость к протеолизу [514]. Увеличение степени гидролиза сывороточных белков, выхода пептидной фракции и понижение ее антигенных свойств достигается установлением оптимальных условий ферментативного гидролиза.
В данной части работы для проведения целенаправленного гидролиза белков молочной сыворотки исследовали группу ферментов: эндопептидазы: химот-рипсин, алкалазу, нейтразу, термолизин, протамекс.
Исходя из специфичности каждого фермента (глава 2) с помощью программы PeptideCutter проведено компьютерное моделирование процесса гидролиза белков подсырной сыворотки.
Результаты компьютерного моделирования процесса гидролиза представлены в таблице 3.1.2. В ходе исследований определили количество эпитопов и свободных аминокислот, остающихся после гидролиза белков молочной сыворотки каждым из рассматриваемых ферментов.
Изучение функциональных свойств направленных гидролизатов белков молочной сыворотки
На первом этапе проведен сравнительный анализ двадцати шести нуклео-тидных последовательностей гена pal, содержащихся в базе данных генетических последовательностей GenBank в результате которого установлено достаточно высокое сходство последовательностей гена pal.
Множественное выравнивание отобранных нуклеотидных последовательностей для каждого кластера генов, кодирующих L-фенилаланин-аммоний-лиазу, имеющихся в GenBank и EMBL-EBI показали, что последовательности гена раї у анализируемых микроорганизмов обладают малой консервативностью, поэтому область поиска универсальных праймеров был сужена. Для этого анализированы последовательности гена pal базидиомицетных дрожжей Rhodosporidium toruloides и Rhodotorula glutinis, поскольку именно они обладают наибольшим ро-ством к штаммам пигментных дрожжей.
В результате выбраны следующие универсальные праймеры: - праймер PAL IF (5 - CGC GGY CAY TCK GCK GT -3 . Прямой праймер занимает позицию с 292 по 308 нуклеотид гена pal из базы NCBI. Обратный праймер PAL1R (5 -САТ YTC TGC CGG YTG AAC RTG -3 ); - обратный праймер занимает позицию с 1299 по 1319 нуклеотид.
Таким образом пара праймеров RAL IF - RAL1R фланкируют фрагмент гена pal, расположенный с 292 по 1319 нуклеотид, размер полученного фрагмента -1027 п.н.
Для сконструированных пар праймеров рассчитаны температура отжига и параметры амплификации. Установили, что условиями проведения ГЩР-реакции являются 95С, 60 с, 30 циклов (95С, 30 с; 64С, 30 с; 72С, 60 с).
Контролировали результаты амплификации с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле. В качестве положительного контроля использовали искусственно синтезированный ген pal Rhodosporidium toruloides.
Для подтверждения наличия гена pal полученные ГЩР-фрагменты были подвержены прямому секвенированию.
Установлено, что штаммы: Bullera alba Y1581, Cryptococcus laurentii Y227, Cryptococcus macerans Y2763, Cystofilobasidium capitatum Y1852, Dioszegia hungarica Y3208, Dioszegia sp. Y3320, Geotrichum klebahnii Y3053, Phaffia rhodozyma Y1666, Rhodosporidium capitatum Y1567, Rhodotorula aurantiaca Y985, Rhodotorula minuta Y2777, Sporobolomyces holsaticus Y991, Sporobolomyces roseus Y987, не содержат в своем составе гена pal и соответственно исключим их из дальнейшего исследования.
Для изучаемых видов составлена матрица идентичности нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, свидетельствующая о том, что степень идентичности как нуклеотидных так и аминокислотных последовательностей внутри клады очень высока и составляет порядка 93-97% для некоторых видов.
Таким образом, с помощью филогенетического анализа была показана принадлежность исследуемого гена в семейству PAL, а также оценена сходство данных последовательностей.
Изучены фенотипические свойств выбранных пигментных дрожжей. В результате проведенных исследований было установлено: клетки выделенных дрожжей имеют круглую, округлую, овальную и цилиндрическую форму. Размеры «взрослых» дрожжевых клеток варьировали у разных видов от 1,5-2,0 до 10 мкм по ширине и достигали 20 мкм и более в длину у продолговатых клеток.
Дальнейшие исследования направлены на определение активности L-фенилаланин-аммоний лиазы у выбранных пигментных дрожжей. Результаты свидетельствуют о том, что наибольшей активностью обладают штаммы Aureobasidium pullulans 863, Rhodosporidium infirmominiatum 1569, Candida glabrata 2813, Candida maltose 242, Debaryomyces robertsiae 3392, Rhodosporidium diobovatum 1565, Rhodotorula lactose 2770, Saccharomyces cerevisiae 1127, Tilletiopsis washingtonensis 1650, Torulopsis apicola 566, Tremella foliacea 1624, Rhodotorula rubra 1193, Debaryomyces castellii 968, что позволяет рекомендовать из для дальнейших исследования направленных на получения ферментного препарата L-фенилаланин-аммоний лиазы.
Проводили выбор штамма - продуцента L-фенилаланин-аммоний-лиазы, способного обеспечить высокий уровень активности получаемого фермента в ферментационной среде на основе совокупности факторов (скорости биосинтеза, выхода фермента с единицы массы, используемого субстрата и продолжительности процесса культивирования).
В результате математического моделирования сформулированы рекомендации по выбору штамма суперпродуцента L-фенилаланин-аммоний-лиазы. Выделили штамм Aureobasidium pullulans 863, который обладает при прочих равных условиях, большей «производительностью» и активность по сравнению другими штаммами продуцентами L-фенилаланин-аммоний-лиазы.
Исследование влияния параметров культивирования пигментных дрожжей на качественные показатели продукта биосинтеза
Задачей технического решения является оптимизация схемы выделения и очистки иммобилизованного фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы.
Технический результат достигается за счет использования известной схемы очистки фермента (прототип) с включением дополнительных стадий повторного дробного осаждения и очистки гидрофобной хромотографией иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы и увеличение ее активности по сравнению с прототипом.
Способ осуществляется следующим образом: после однократной стадии очистки фермента, включающей экстракцию, ферментирование, осаждение и ионообменную хромотографию, фермент подвергали повторному дробному осаждению и гидрофобной хромотографии, рассчитывали активность L- фенилала-нин-аммоний-лиазы и выход фермента.
Пример выполнения предлагаемого способа. Первую очистку проводили в соответствии с прототипом. Вторую очистку ФАЛ проводили с целью оптимизации схемы очистки и увеличения выхода фермента. Для этого биомассу размораживали и ресуспендировали в 150 ммоль фосфатном буфере (рН 8,0) с 10 ммоль имидазо-лом. В суспензию добавляли ингибиторы протеаз. Клетки разрушали ультразвуком при средней мощности и амплитуде равной 4, используя средний шток. Озвучивали суспензию (по 20 см ) на льду 8 раз по 20 сек с минутными интервалами для охлаждения. Гомогенат центрифугировали при 10000 об/мин 30 мин.
Следующим этапом очистки фермента был выбран дробный метод осаждения. Вначале данного метода L-фенилаланин-аммоний-лиазу фракционировали сульфатом аммония. На процесс фракционирования оказывают влияние следующие факторы: ионная сила, температура, рН и начальная концентрация белка. В супернатант вносили сухой сульфат аммония (осч) до 25% от насыщения. После растворения соли экстракт выдерживали 15 мин на холоду. Осадок отделяли центрифугированием, как указано выше. В супернатанте концентрацию соли доводили, добавляя сухой сульфат аммония до 50% от насыщения. После 15 минутной инкубации на холоду повторно центрифугировали, и полученный осадок ресуспендировали в 55% сульфате аммония для отмывки от ЭДТА, содержавшегося в ингибиторах, также центрифугировали. Затем осадок растворяли в 150 ммоль фосфатном буфере (рН 8,0) с 10 ммоль имидазола.
Поскольку полученный белок содержит дополнительную гексагистидино-вую последовательность в С-концевой области полипептидной цепи для удаления, не растворившегося осадка, дальнейший этап очистки связан с нанесением препарата белка на колонку с Ni -NTA агарозой. Для этого препарат центрифу 94- "3 гировали и наносили на колонку с Ni -NTA агарозой (7 см ), уравновешенную тем же буфером. Работу проводили при +15 С. Колонку промывали от несвязанного материала исходным буфером (4 объема колонки), затем - 150 мМ фосфатным буфером (рН 8,0) с 20 ммоль имидазолом (4 объема колонки). ФАЛ элюировали тем же буфером с увеличенной до 250 ммоль концентрацией имидазола (3 объема). Для концентрирования и замены буфера в препарат вносили 4 М раствор (NH4)2S04 до 50% насыщения и оставляли на ночь при + 6 С. На следующий день центрифугировали (15000 об/мин х 15 мин) и осадок растворяли в 50 ммоль фосфатном буфере (рН 8,2). Затем добавляли насыщенный раствор (NH4)2S04 до 0,8 моль. Удельная активность PAL после Ni+2 - NTA агарозы составила 2,245 Е/мг белка.
Для удаления, не растворившегося осадка, препарат также центрифугиро-вали и наносили на колонку с Ni -NTA агарозой (7 см ), уравновешенную тем же буфером. Работу проводили при +15 С. Колонку промывали от несвязанного материала исходным буфером (4 объема колонки), затем - 150 ммоль фосфатным буфером (рН 8,0) с 20 ммоль имидазолом (4 объема колонки). PAL элюировали тем же буфером с увеличенной до 250 мМ концентрацией имидазола ( 3 объема). Далее препарат PAL, очищенный ионообменной хроматографией на Mono-Q, диализовали против 300 мл 0,1 моль Трис-HCl с 50% глицерина. При диализе фермент сконцентрировался в 4,4 раза и потом хранился при - 20 С.
Последней стадией очистки фермента была очистка с помощью гидрофобной хромотографии. Результаты предложенной очистки, включающий стадию гидрофобной хромотографии представлены в таблице 8.2.1.
