Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Состояние вопроса и задачи исследований 6
1.1 Белково-углеводное молочное сырье как биоактивное сырье животного происхождения 6
1.2 Характеристика функциональных продуктов на основе гетероферментативного брожения молочной сыворотки 11
1.3 Метаболизм лактозосбраживающих дрожжей 21
1.4 Выводы по обзору литературы, цель и задачи исследований 29
Глава 2. Объекты и методы исследований 31
2.1 Организация проведения эксперимента 31
2.2 Объекты исследования 33
2.3 Методы исследований 33
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 38
3.1 Выделение и идентификация дрожжей из лактозосодержащего сырья 38
3.2 Изучение сочетаемости выделенных штаммов лактозосбраживающих дрожжей 59
3.3 Технология получения комбинированного инокулята 67
Глава 4. Разработка технологии ферментированного напитка с функциональными свойствами 71
4.1 Разработка технологии получения ферментированного напитка 71
4.2 Исследование пищевой ценности ферментированного напитка 76
4.3 Исследование свойств ферментированного напитка в процессе хранения 79
4.4 Рекомендации к применению 82
Выводы 86
Список литературы 87
Приложения
- Характеристика функциональных продуктов на основе гетероферментативного брожения молочной сыворотки
- Метаболизм лактозосбраживающих дрожжей
- Изучение сочетаемости выделенных штаммов лактозосбраживающих дрожжей
- Исследование пищевой ценности ферментированного напитка
Введение к работе
Актуальность работы. Питание является одним из главнейших факторов, определяющих поддержание здоровья, работоспособности и активного долголетия населения. На приоритетную значимость питания указывает постановление Правительства РФ № 917 от 10.08.98 «О концепции государственной политики в области здорового питания населения Российской Федерации» на период до 2015 г. Цель государственной политики в области здорового питания заключается в сохранении и укреплении здоровья населения, а также профилактике заболеваний, вызванных нехваткой в рационе полноценных белков, витаминов, пищевых волокон, макро- и микронутриентов. Важнейшее место в реализации этой программы занимают молочные продукты.
Для молокоперерабатывающей отрасли актуальна проблема утилизации молочной сыворотки, которая, как известно, обладает высокой пищевой и биологической ценностью, что делает привлекательным ее применение в производстве функциональных продуктов. Роль активных ингредиентов в них могут играть дрожжевые клетки, поскольку обладают выраженным лакто- и бифидогенным эффектом. При этом ассортимент ферментированных продуктов, содержащих активные клетки дрожжей, ограничен и, в основном, представлен продуктами с использованием традиционных заквасок лактозосбраживающих дрожжей. Тогда как спектр дрожжевых культур, осуществляющих ферментацию, может быть значительно расширен за счет использования в различных климатических зонах местных рас штаммов, как наиболее жизнеспособных в данных эколого-географических условиях.
Усиление функциональных свойств ферментированных продуктов является одним из приоритетных направлений для расширения ассортимента и решается путем использования пробиотических микроорганизмов. Lactobacillus acidophilus относятся к облигатным представителям нормальной микрофлоры ЖКТ человека, что свидетельствует о перспективности применения ацидофильных палочек и дрожжевых культур для разработки новых функциональных продуктов, отвечающих требованиям современных тенденций в питании.
С учетом вышеизложенного, разработка технологии ферментированного напитка с функциональными свойствами актуальна в рамках решения социальной проблемы организации здорового питания.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилась разработка технологии напитка с функциональными свойствами на основе молочной сыворотки, ферментированной L. acidophilus и лакто-зосбраживающими дрожжами.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
выделить из природных ценозов штаммы лактозосбражи-вающих дрожжей, обладающих высокими витаминсинтезирующими свойствами;
выявить наиболее рациональные способы культивирования лактозосбраживающих дрожжей на молочной сыворотке;
обосновать технологические параметры получения ферментированного напитка с функциональными свойствами;
исследовать качественные показатели, аминокислотный и витаминный состав ферментированного напитка;
изучить возможность использования ферментированного напитка в производстве соусов.
Научная новизна. Экспериментально установлено, что природные биоценозы, сформированные на основе брожения лактозы, являются перспективными субстратами для выделения лактозосбраживающих дрожжей рода Torulopsis. Выявлено, что наиболее высокой биохимической активностью и витаминсинтезирующей способностью обладают штаммы дрожжей, выделенные из напитка айраг и микробной ассоциации кефирных грибков. Совместное культивирование данных штаммов дрожжей усиливает их биохимическую активность, интенсифицирует спиртовое брожение, повышает синтез витаминов и обеспечивает гомогенность популяции. Доказана эффективность поэтапного процесса ферментации молочной сыворотки L. acidophilus и комбинированным инокулятом лактозосбраживающих дрожжей, что способствует накоплению незаменимых аминокислот, витаминов и обеспечивает функциональные свойства.
Практическая значимость. Полученные результаты были использованы при разработке технологии ферментированного напитка (ТУ 9224-002-02069473-09. Напиток «ЭНХЕРЭЛ»).
На основе результатов исследований подана заявка (№ 2008129628) о выдаче патента РФ «Штамм дрожжей Torulopsis species ВСГТУ-08». Получен приоритет от 17.07.2008.
Диссертационная работа выполнялась по теме НИОКР «Формирование рекреационных технологий в условиях экосистем Забайкалья», номер госрегистрации 01.20.08.07.257 от 03.02.2008.
Апробация работы. Основные положения, результаты и выводы, сформулированные в диссертации, докладывались на региональных, всероссийских и международных семинарах и конференциях. По результатам диссертационного исследования опубликовано 18 печат-
ньгх работ, в т.ч. 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, подана 1 заявка на выдачу патента РФ.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, глав, выводов, списка литературы, приложений.
Характеристика функциональных продуктов на основе гетероферментативного брожения молочной сыворотки
Производство продуктов функционального назначения является актуальной задачей для современной пищевой промышленности. В мировом масштабе идет постоянная работа по созданию новых продуктов функционального питания обладающих как широким спектром применения, так и точечной направленностью на конкретный орган, биотоп, систему, заболевание [92].
Большой теоретический и практический вклад в развитие технологии продуктов функционального питания внесли ученые отечественных школ прикладной биотехнологии, биохимии и нутрициологии: Бражников A.M., Большаков О.В., Горбатова К.К., Журовская Н.К., Липатов Н.Н. (ст.), Липатов Н.Н. (мл.), Радаева И.А., Рогов И.А., Титов Е.И., Токарев Э.С., Харитонов В.Д., Шалыгина A.M., Уголев A.M., Волгарев М.Н., Покровский В.И., Тутельян В.А., Позняковский В.И., Хамагаева И.С. и др.
Наиболее значимыми является функциональные продукты переработки молока, т.к. его белки, жиры и углеводы уникальны и соответствуют физиологическим потребностям организма человека от рождения до глубокой старости [74, 92].
Для создания функциональных продуктов на основе молочной сыворотки одним из перспективных микроорганизмов являются культуры лактозосбраживающих дрожжей - они обладают высокой скоростью роста, устойчивостью к посторонней микрофлоре и отличаются химическим составом [2, 4, 9, 36, 44, 54, 72, 99]. Дрожжи содержат 40-55 % белка, который усваивается на 85-88 %, занимая по этому показателю промежуточное положение между белками растительного и животного происхождения [33].
Установлено, что дрожжи, использующие лактозу, как основной источник углеводного питания встречаются почти во всех молочных продуктах, приготовленных на естественных заквасках [42, 72, 93, 94]. Лактозосбраживающие дрожжи участвуют в процессах получения таких ферментированных продуктов, как кефир, курунга, кумыс, тараг, ацидофильно-дрожжевое молоко и других лечебно-профилактических напитков. Обогащение состава заквасок указанных молочных продуктов лактозосбраживающими дрожжами, активизирует развитие молочнокислых бактерий, улучшает органолептические свойства. В условиях дефицита пищевого белка дрожжевая биомасса является перспективным источником не только белка и незаменимых аминокислот, но и минеральных веществ (в частности металлопротеинов), витаминов и других биологически активных веществ. Клеточные стенки дрожжей активно сорбируют токсины и токсичные метаболиты, стимулируют развитие клеток пробиотической микрофлоры — бифидобактерий, ацидофильных палочек, т.е. дрожжевые препараты могут играть роль не только нутрицевтиков, но и парафармацевтиков, как стимуляторов собственной защиты флоры макроорганизма [92, 99].
Существует несколько механизмов, посредством которых осуществляются парафармацевтические свойства дрожжей. Один из которых заключается в сорбции патогенных микроорганизмов содержащиеся в клеточных стенках дрожжей маннанолигосахаридами [2]. Известно, что патогенные микроорганизмы для прикрепления к эпителиальным клеткам кишечника используют лектиновые рецепторы, которые обладают способностью распознавать углеводы, находящиеся на поверхности этих клеток [6, 8]. Частицы маннанолигосахаридов устилают стенки кишечника, а так как они похожи на вышеупомянутые углеводы, патогенные микроорганизмы прикрепляются к ним. Не обладая способностью ассимилировать маннанолигосахариды, патогенные микроорганизмы погибают. При этом стимулируется лакто- и бифидогенная микрофлора, обладающая энзиматическими комплексами для ассимиляции маннанолигосахаридов [3, 32].
Также имеются сведения о способности дрожжей к нейтрализации токсичности культур Klebsiella sp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella ozaenae in vitro, причем эта способность одинаково выражена у живых и автоклавированных культур [41]. Токсиннейтрализующая активность дрожжевых препаратов не абсолютна, о чем свидетельствует неполная инактивация высокотоксичных метаболитов псевдомонад. Псевдомонады продуцируют большой комплекс токсинов (около 20-25) [5] и, очевидно, какие-то из них не могут быть нейтрализованы дрожжами.
Метаболизм лактозосбраживающих дрожжей
Лактоза, как питательный компонент лактозосбраживающих дрожжей, содержит потенциальную энергию, которая сосредоточена в различных ковалентных связях между атомами молекулы. Только диссимиляция питательных веществ в результате окислительно-восстановительных реакций сопровождается высвобождением энергии и образованием химически активных метаболитов, которые используются при выполнении жизненных функций [98]. Химическая энергия лактозы превращается в процессе клеточного дыхания в биологически доступную энергию макроэргических фосфатных связей. Часть энергии при этом теряется, рассеиваясь в виде тепла [44, 93].
Дыхательный метаболизм представляет собой процесс использования энергии субстрата и образования активных метаболитов, используемых для синтеза различных структурных соединений. Метаболизм лактозосбраживающих дрожжей связан с осуществлением множества реакций, катализируемых в основном ферментами лактазой и галактозимазой.
Последовательно протекающие ферментативные реакции, в результате которых происходит разрушение ковалентных связей между атомами молекулы лактозы, обеспечивает одновременно образование метаболитов. Лактоза, являясь исходным материалом для спиртового брожения, подвергается гидролизу лактазай и распадается на галактозу и глюкозу.
Процесс брожения совпадает с гликолизом, за исключением концевого этапа, катализируемого лактатдегидрогеназой, который отличается двумя другими ферментативными реакциями, катализируемыми пируватдекарбоксилазой и алкогольдегидрогеназой (рисунок 1.1). Энзергонические процессы , , Эндергонические процессы
На первой стадии лактозосбраживающие дрожжи обладают способностью расщеплять лактозу двумя путями: путем образования легкогидродизуемых фосфорных эфиров и путем гидролиза на глюкозу и лактозу. Дрожжи, расщепляя лактозу, потребляют неорганический фосфор и образуют легкогидролизуемые фосфорные соединения, состоящие из глюкозо-1-фосфата и еще более легкогидролизуемой углеродфосфорной фракции.
На второй стадии глюкоза и галактоза, проникая в цитоплазму клетки и разрушаясь в ней, превращаются сначала в глицеральдегид-3 фосфат, а затем в ацетильную группу, входящую в состав ацетил-КоА.
Далее продукты распада вступают в третью стадию, которая для всех является общей и в результате которой они окисляются до С02 и воды, а также распадаются на низкомолекулярные образования для анаболитических процессов. В результате катаболизма лактозы освобождается энергия, необходимая для проявления жизнедеятельности дрожжевой клетки, а также образуются различные двух-, трех- и четырехуглеродные предшественники, которые являются исходным материалом для биосинтетических реакций.
Следовательно, в ходе окисления крупные молекулы расщепляются с образованием более мелких соединений и высвобождают при этом энергию, заключенную в их сложной молекулярной структуре. Эта энергия запасается в форме энергии фосфатных связей аденозинтрифосфата.
Катаболизм субстрата лактозосбраживающими дрожжами включает три стадии (см. рисунок 1.2).
Уникальным свойством дрожжевой клетки является непрерывное получение энергии — химической, электрической и т. д., необходимой для ее жизнедеятельности и физиологических функций. Энергия в клетке получается в результате окислительно-восстановительных реакций, протекающих в процессе ее жизнедеятельности в анаэробных и аэробных условиях.
Анаэробное брожение лактозосбраживающих дрожжей следует рассматривать как простейшую форму биологического механизма, обеспечивающего получение энергии из питательных веществ. Этот примитивный способ является своего рода подготовительной ступенью для дальнейшего окисления продуктов брожения кислородом. Отдельные этапы анаэробного расщепления глюкозы, катализируемые специфическими ферментами, в настоящее время хорошо известны. Поэтому различные типы брожения и в первую очередь гликолиз являются моделями для изучения более сложных и менее исследованных процессов дыхания.
Начальные этапы спиртового брожения, вплоть до образования пировиноградной кислоты (пирувата), полностью идентичны гликолизу. Более того, сравнительное изучение процессов анаэробного расщепления углеводов различными микроорганизмами показало, что ферменты и катализируемые ими реакции, протекающие с участием фосфорной кислоты, во всех случаях общие и эта общность сохраняется до образования из субстрата пировиноградной кислоты.
Изучение сочетаемости выделенных штаммов лактозосбраживающих дрожжей
Как известно, одним из способов повышения биоактивности культур является комбинирование, в основу которого заложены принципы сочетаемости и способности к совместному развитию в среде.
В результате исследований биохимической активности доказано, что наибольшей биоактивностью обладают штаммы дрожжей, выделенные из микробной ассоциации кефирных грибков и напитка айраг. С учетом факта, что комбинированный инокулят должен представлять собой гомогенную культуру, т.е. содержать в своем составе клетки дрожжей с близкой биохимической активностью, для создания комбинаций были отобраны штамм 3 и штамм 4. Как было отмечено ранее, именно дрожжи штамма 3 и штамма 4 отличаются близкой биохимической активностью и гомогенностью структуры популяции.
Дальнейшими исследованиями установлено благоприятное соотношение используемых штаммов лактозосбраживающих дрожжей для получения комбинированного инокулята. В соответствии с этим были разработаны следующие соотношения: I вариант - 0,5 части штамма 3: 1,5 части штамма 4; II вариант -.1,0 части штамма 3: 1,0 части штамма 4; III вариант- 1,5 части штамма 3:0,5 части штамма4. Доза вносимого инокулята составляла 10 % от объема молочной сыворотки. В качестве контроля использовали сыворотку, ферментированную штаммом дрожжей, выделенных из микробной ассоциации кефирных грибков. . Сочетаемость , штаммов лактозосбраживающих дрожжей в комбинированном инокуляте определяли по органолептическим показателям ферментированной молочной сыворотки. Так, сыворотка после ферментации вариантом 1 имела кисловатый, острый, слегка освежающий вкус от выделяющейся углекислоты. При культивировании соотношением дрожжей 1:1 сыворотка отличалась хорошо выраженным кислым ароматом и освежающим вкусом, а сыворотка, ферментированная вариантом III, имела острый резко щиплющий вкус и ярко выраженный дрожжевой запах.
Таким образом, для проведения дальнейших исследований на основании результатов изучения активности выделенных штаммов дрожжей, а также органолептических показателей их соотношений был выбран следующий вариант - 1 часть штамма 3: 1 часть штамма 4. Для обоснования применения комбинированного инокулята далее изучали его биохимические свойства в сравнении со свойствами штамма 4 и штамма 3.
Зависимость изменения показателя кислотности молочной сыворотки ферментированной комбинированным инокулятом от продолжительности культивирования в сравнении с монокультурами представлена на рисунке 3.14 и 3.15.
Величина титруемой кислотности сыворотки после двух суток ферментации комбинированным инокулятом изменилась на 16 Т, штаммом 4 - на 13 Т, а штаммом 3 - на 11 Т. После пяти суток культивирования - на 36 Т, на 30 Т и на 25 Т соответственно. Величина активной кислотности после 5 суток культивирования комбинированного инокулята в молочной сыворотке изменилась на 1,9 единицы рН в щелочную сторону. В то время как штамм 4 изменил кислотность среды на 1,75 ед рН, а штамм 3 - на 1,65 ед рН.
Результаты проведенных исследований показали, что в первые 48 часов культивирования дрожжевые клетки полностью адаптируются к заданным условиям и рост клеток не ограничивается ни недостатком питательных веществ, ни избытком продуктов обмена. Максимальный рост дрожжевых клеток при этом наблюдался у комбинированного инокулята. В следующие 72 часа культивирования, т.е. в стационарной фазе роста не наблюдается выраженных скачков роста, т.к. сказывается недостаток питательных веществ в среде и ингибирование продуктами метаболизма. Как видно, из данных рисунка 3.10а и 3.10 б комбинированный инокулят лактозосбраживающих дрожжей значительно сдвигает кислотность ферментируемой системы в сравнении с монокультурами дрожжей, что обусловлено близкой внутривидовой гомогенностью, сочетаемостью клеток дрожжей, биохимической активностью.
Динамика изменения кислотности молочной сыворотки в процессе ферментации комбинированным инокулятом была исследована на основе двухфакторного эксперимента. На основании регрессионного анализа, проведенного методами математической статистики, получены следующие уравнения регрессии второго порядка наиболее адекватно описывающие реальную зависимость. Коэффициенты уравнения регрессии вычислены с помощью компьютерной программы регрессионного анализа
Исследование пищевой ценности ферментированного напитка
Исследования пищевой ценности ферментированного напитка показали, что в результате жизнедеятельности L. acidophilus и лактозосбраживающих дрожжей в ферментированном напитке накапливаются продукты метаболизма. Отличительной особенностью напитка является содержание 2,2±0,2 % лактозы и 1,8±0,2 % этанола, что является следствием экспериментально разработанных параметров ферментации молочной сыворотки.
В ходе дальнейших исследований был изучен аминокислотный состав ферментированного напитка (см. таблицу 4.3).
Ферментация молочной сыворотки клетками ацидофильных палочек и лактозосбраживающих дрожжей способствовала накоплению лизина, гистидина, валина, метионина, фенилаланина и пролина. При этом общий удельный вес аминокислот в напитке на 3 % больше в сравнении с молочной сывороткой. Очевидно, это можно объяснить за счет накопления дрожжевой биомассы.
Ферментация молочной сыворотки в два этапа чистой культурой ацидофильных палочек и комбинированным инокулятом лактозосбраживающих дрожжей способствует накоплению в ферментированном напитке витаминов и витаминоподобных веществ. В таблице 4.4 представлены данные исследования содержания витаминов в ферментированном продукте.
При этом отмечен различный уровень накопление витаминов, что указывает на изменение активности микробной системы. Анализ содержания витаминов показал, что в ферментированном напитке в сравнении с исходной сывороткой содержание тиамина выше на 71 %, рибофлавина на 243 %, пиридоксина на 50 %, биотина на 176 %, холина на 51 %. А концентрации аскорбиновой кислоты в ферментированном напитке в три раза, фолиевой кислоты в пять раз, никотиновой кислоты в тринадцать раз и пантотеновой кислоты в два раза превышает исходную молочную сыворотку.
Полученные данные согласуются с литературными [37, 42, 72], свидетельствующие о том, что лактозосбраживающие дрожжи обладают высокой синтетический способностью витаминов группы В и витамина С, что в результате своего развития выделяют в среду ряд экстрацеллюлярных продуктов своего метаболизма.
Высокое содержание аминокислот и витаминов в ферментированном напитке является следствием биосинтеза этих соединений микрофлорой комбинированного инокулята и ацидофильных палочек. Полученные результаты согласуются с литературными данными о способности лактозосбраживающих дрожжей и ацидофильных палочек продуцировать биологически активные вещества.
Таким образом, использование биоактивного комбинированного инокулята лактозосбраживающих дрожжей и пробиотической культуры ацидофильных палочек, а также поэтапный режим ферментации молочной сыворотки способствует количественному изменению биологически активных веществ в ферментированном напитке и приданию ему функциональных свойств.
В связи с тем, что микрофлора ферментированного продукта включает чистые культуры изучение стабильности физико-химических и микробиологических показателей требует особого внимания. С это целью изучали качественные характеристики ферментированного продукта в процессе хранения в течение семи суток при температуре 4±2 С (см. таблицу 4.5). Экспериментальные данные, представленные в таблице 4.5 показывают, что кислотность ферментированного продукта остается стабильной в процессе хранения. Величина тируемой кислотности изменилась от 70±2 Т до 74±2 Т через семь суток хранения. Титр жизнеспособных ацидофильных палочек через пять суток хранения изменился с 8±2 107 до 3±2 106 КОЕ/см3, а через семь с О суток хранения составил 2±1 10э KOE/CMJ. Число клеток лактозосбраживающих дрожжей через 5 суток изменилось с 7±1 10 до 5±1 10 , а на седьмые сутки составило 2±1 10 КОЕ/см . Исследования показали отсутствие в ферментированном напитке в течение семи суток хранения при температуре 4±2 С наличие патогенной и условно-патогенной микрофлоры.
Совокупность полученных данных указывает на то, что в течение пяти суток хранения показатели ферментированного напитка остаются стабильными, а при дальнейшем хранении происходит увеличение величины титруемой кислотности и снижение числа активных клеток ацидофильных палочек и лактозосбраживающих дрожжей.
Таким образом, на основании полученных данных определили хранения, обеспечивающий функциональность свойств ферментированного напитка пять суток, в течение которого сохраняется число активных клеток ацидофильных палочек и лактозосбраживающих дрожжей.
