Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современное состояние и перспективы создания новых биологически активных препаратов на основе белков молока 10
1.1 Теоретические основы создания биологически активных добавок к пище 12
1.2 Технологические основы производства биологически активных добавок к пище. Принципы разработки рецептур БАД и требования к их производству 15
1.3 Биологически активные сывороточные белки молока 20
1.4 Современные способы получения биологически активных белков из молочного сырья 52
Глава 2 Объекты и методы исследований 56
2.1 Объекты исследований. Постановка эксперимента 56
2.2 Обоснование выбора исходных компонентов композиционного препарата 59
2.3 Методы исследования 61
2.3.1 Препаративные методы 61
2.3.2 Подготовка и контроль качества сырья для получения катионных сывороточных белков молока (КСБМ) 63
2.3.3 Аналитические методы 64
2.3.4 Электрофорез белков в ПААГ 75
2.3.5 Микробиологические методы 76
2.3.6 Холодная стерилизация растворов белковых препаратов 78
2.3.7 Лиофильная сушка 79
2.3.8 Контроль качества препарата 79
2.3.9 Методы моделирования технологических факторов производства молочных продуктов 80
2.3.10 Условия проведения экспериментов с животными 81
Результаты исследований и их обсуждение 83
Глава 3 Получение и характеристика компонентов разрабатываемого биологически активного препарата (БАП) 83
3.1 Оценка качества исходного сырья 83
3.2 Получение и характеристика компонентов композиционного препарата 85
3.2.1 Комплекс катионных сывороточных белков молока (КСБМ) 85
3.2.2 Куриный лизоцим (кЛЦ) 89
Глава 4 Технологические аспекты производства и применения биологически активного препарата на основе защитного комплекса молока и куриного лизоцима 91
4.1 Определение совместимости компонентов композиционного БАП «МОБЕЛИЗ» в жидкой форме 91
4.2 Прикладные аспекты разработки технологии получения БАП «МОБЕЛИЗ» 117
Глава 5 Характеристика и физиологические свойства препарата «МОБЕЛИЗ» 129
5.1 Изучение показателей качества БАП «МОБЕЛИЗ» 129
5.2 Исследование биологической ценности БАП «МОБЕЛИЗ» 131
5.3 Исследование антимикробного действия БАП «МОБЕЛИЗ» 134
5.4 Изучение показателей безопасности и физиологической активности БАП «МОБЕЛИЗ» 137
Глава 6 Влияние технологических факторов производства молочных продуктов на биологическую активность компонентов БАЛ «МОБЕЛИЗ» 152
6.1 Режимы тепловой обработки 152
6.2 Кислотность среды 158
6.3 Характеристика молочных продуктов, обогащенных БАП «МОБЕЛИЗ» 164
6.3.1 Питьевое молоко 164
6.3.2 Йогурт 168
Выводы 176
Библиографический список 178
Приложение А. Результаты статистической обработки результатов биологического эксперимента с использованием нейронных сетей 197
Приложение Б. Патент РФ № 2318406 «Способ получения БАД из низкомолекулярных катионных белков молока и полученная этим способом БАД» 215
Приложение В. Заявление на выдачу патента на изобретение № 2008109043 «Способ получения биологически активной добавки «МОБЕЛИЗ» и полученная этим способом БАД «МОБЕЛИЗ» от 12.03.2008 218
Приложение Г. Проект нормативной документации (ТУ, ТИ) на производство биологически активного препарата «МОБЕЛИЗ» 220
Приложение Д. АКТ опытной выработки обогащенных биологически активным препаратом «МОБЕЛИЗ» питьевого молока и йогурта 223
Приложение Е. ПРОТОКОЛ дегустации обогащенных биологически активным препаратом «МОБЕЛИЗ» питьевого молока и йогурта 225
Приложение Ж. ПРОТОКОЛЫ оценки качества обогащенных молочных продуктов биологически активным препаратом «МОБЕЛИЗ» 228
Приложение И. Дипломы выставок и конференций 231
- Технологические основы производства биологически активных добавок к пище. Принципы разработки рецептур БАД и требования к их производству
- Современные способы получения биологически активных белков из молочного сырья
- Определение совместимости компонентов композиционного БАП «МОБЕЛИЗ» в жидкой форме
- Йогурт
Введение к работе
Актуальность работы. Современная пищевая технология оставляет человеку все меньше шансов на сохранение биологически активных компонентов в продуктах повседневного потребления, как правило, подвергающихся сложной многостадийной обработке. В последние годы в отечественной отраслевой науке особое место отводится технологиям безотходной переработки молока, предусматривающим не только наиболее полное извлечение из сырья основных макро, но и микро- и нанокомпонентов, являющихся биологически активными факторами, роль которых в механизме поддержания гомеостаза организма весьма значима. Известно, что комплекс белковых веществ является одним из определяющих факторов биологической ценности натурального молока, делая его не только продуктом питания, но и основным компонентом, определяющим устойчивость организма к неблагоприятным условиям.
Актуальным считается использование в технологиях пищевых продуктов биологически активных белков животного происхождения, в частности, особое внимание уделено наиболее используемому для этих целей лизоциму куриного яйца. В последние два десятилетия лизоцим активно используется в производстве продуктов детского и лечебно-профилактического питания. Кроме того, в свете результатов недавних исследований, начинается использование сывороточных белков молока, особый интерес среди которых представляют физиологически значимые катиоиные белки защитного комплекса молока: лактопероксидаза, лактоферрин, лизоцим, ангиогенин, панкреатическая рибонуклеаза. Недостатком существующих технологий является получение и использование очищенной формы отдельных белков молока, в то время как в природе они существуют в комплексе и функционально взаимосвязаны, проявляя зачастую синергетический эффект. В нативном виде комплекс биологически активных белков может быть выделен из молочного сырья. Среди катионных белков коровьего молока важная роль в защите организма принадлежит лизоциму, значимый уровень которого, в отличие от других белков, сохраняется только в бактерицидной фазе молока. Между тем, это не только сам по себе полифункциональный белок, но и в композиции с другими катионными белками образует защитный белковый комплекс молока, оказывая влияние на их активность. В промышленности практическое применение получил препарат куриного лизоцима, по своим свойствам гомологичный молочному лизоциму. На сегодняшний день сочетание лизоцима с другими биологически активными белками животного происхождения применяется в основном в производстве косметических препаратов и БАД для специального питания узких групп населения. Технологии их производства, как правило, не учитывают взаимное влияние компонентов этих комплексов в готовом продукте.
В этой связи безусловный интерес представляет возможность получения
природного комплекса защитных белков молока в сочетании с куриным
лизоцимом, в качестве основы высокоэффективных биологически активных
препаратов широкого спектра действия и продуктов лечебно-
профилактической направленности с их применением.
Исследования, представленные в диссертационной работе, базируются на достижениях отечественных и зарубежных школ прикладной биотехнологии, биохимии и нутрициологии, представленных в трудах ученых: К.К. Горбатовой, Г.С. Комоловой, Н.Н. Липатова, Н.П. Мертвецова, И.А. Рогова, Н.А. Тихомировой, В.А. Тутельяна, А.Г. Храмцова, A.M. Шалыгиной; В.П. Шидловской, M.D. Bond; K.D. Kussendrager; P.Maes; R.Shapiro; D.J. Strydom; Shimazaki; B.L. Valle и других.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка технологии биологически активного препарата на основе композиции защитного комплекса молока и куриного лизоцима для дальнейшего использования в качестве активной основы многокомпонентных продуктов лечебно-профилактической направленности.
В соответствии с поставленной целью последовательно решались следующие задачи:
Обосновать выбор белковой основы биологически активного препарата;
Получить из коровьего молока и проанализировать белковую фракцию, входящую в состав защитного комплекса молока, изучить возможность ее совместного использования с куриным лизоцимом,
Обосновать параметры технологии получения и рациональные режимы хранения биологически активного препарата на основе сывороточных катионных белков защитного комплекса молока и куриного лизоцима в жидкой и сухой формах;
Исследовать органолептические, физико-химические, микробиологические, технологические свойства и биологическую ценность препарата;
Определить токсичность и физиологическую активность препарата в эксперименте на животных;
Провести апробацию препарата в технологии производства молочных продуктов в лабораторных и промышленных условиях, изучить показатели качества и безопасности обогащенных им продуктов;
Разработать проект нормативной документации на производство биологически активного препарата на основе защитного комплекса молока и куриного лизоцима.
Научная новизна работы состоит в следующем:
Показана возможность и целесообразность использования защитного
комплекса катионных белков молока в композиции с белком немолочного
происхождения - куриным лизоцимом, обеспечивающих лечебно-
профилактическую направленность разработанного препарата;
Научно и экспериментально обоснованы параметры технологии
биологически активного препарата (БАП) на основе защитного комплекса
катионных белков молока и куриного лизоцима, обеспечивающие высокий
уровень сохранности нативности компонентов;
Получены новые данные о взаимозащитном действии биологически
активных компонентов препарата в процессе хранения;
Установлено, что в составе композиционного БАП при нагревании (до температур 40-65С) происходит повышение биологической активности компонентов;
Выявлена высокая биологическая ценность разработанного БАП:
повышенное в сравнении с эталоном ФАО/ВОЗ содержание всех незаменимых аминокислот;
антимикробное действие комплексного белкового препарата в отношении условно-патогенной микрофлоры;
исследованиями in vivo показаны безопасность и положительное влияние БАП на выносливость к физическим нагрузкам и переносимость животными стрессовых воздействий.
Практическая значимость.
На способ получения комплекса катионных сывороточных белков молока -одной из составляющих биологически активного композиционного препарата -получен патент RU № 2318406 от 10.03.2008 г. На разработанный препарат «МОБЕЛИЗ» подано заявление на выдачу патента на изобретение per. № 2008109043 от 12.03.2008;
Разработан способ получения биологически активного препарата на основе композиции защитного комплекса молока и куриного лизоцима (БАП «МОБЕЛИЗ»);
Разработан проект нормативной документации (ТУ,ТИ) на производство биологически активного препарата «МОБЕЛИЗ»;
Обоснован способ обогащения БАП «МОБЕЛИЗ» молочных продуктов, что позволит расширить ассортимент продуктов детского и лечебно-профилакического питания и увеличить возможности рационального использования молочного сырья;
Показана возможность применения разработанной технологии производства БАП в рамках безотходной переработки молочного сырья;
Проведена опытная выработка питьевого молока и йогурта, обогащенных БАП «МОБЕЛИЗ» в условиях лабораторного и промышленного производства.
Результаты работы внедрены в учебный процесс: Разработаны и изданы методические указания к выполнению лабораторных и учебно-исследовательских работ для студентов, обучающихся по направлению 260300
- технология сырья и продуктов животного происхождения, 260100 -
технология продуктов питания.
Работа выполнялась в рамках аналитической ведомственной целевой
программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008)» по
проекту «Развитие биотехнологических принципов создания
многокомпонентных продуктов лечебно-профилактической направленности,
обогащенных биологически активными веществами, оптимизация процесса их
вакуумной сушки для обеспечения длительных сроков хранения».
Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены и
обсуждены на научно-технической конференции «Технологии живых систем»
(Москва, 2004 г.); Международной научной конференции студентов и молодых
ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2005, 2006, 2007 г.); научных чтениях с международным участием, посвященных 100-летию со дня рождения П.Ф. Дьяченко (Москва, 2006); конференции «Проблемы совершенствования холодильной техники и технологии. Энергосбережение» (Москва, 2006); Четвертом Московском международный конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007); научно-практической конференции «Интеграция фундаментальных и прикладных исследований - основа развития современных аграрно-пищевых технологий» (Углич, 2007).
Получен грант в рамках конкурса на проведение молодыми учеными, аспирантами и студентами исследований в научных и научно-педагогических коллективах организаций Ассоциации МГУПБ (Москва, 2006). Работа отмечена дипломом II степени конкурса научных работ молодых ученых на V Юбилейной школе-конференции с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации» (Москва, 2007), а также дипломом и золотой медалью на 6-ой специализированной выставке «Мир биотехнологии» (Москва, 2008). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, 1 методические указания для студентов. Практическая значимость подтверждена патентом RU № 2318406 от 10.03.2008 г.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объектов и методов исследования, изложение результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 213 наименование, в том числе 88 иностранных авторов, 7 приложений. Основной текст работы изложен на 195 страницах машинописного текста, включает 26 таблиц, 47 рисунков.
Технологические основы производства биологически активных добавок к пище. Принципы разработки рецептур БАД и требования к их производству
При разработке биологически активных добавок к пище необходимо учитывать принципы, заложенные в концепции рационального, сбалансированного, лечебного, лечебно-профилактического и функционального питания.
Рецептура БАД к пище разрабатывается в соответствии с приоритетной задачей, которая ставится перед каждым продуктом: коррекция определенного дефицита эссенциальных и других биологически активных веществ в рационе питания человека, обусловленного эволюционными изменениями структуры питания, изменением образа жизни, ухудшением экологической обстановки, состоянием здоровья. В качестве сырья для производства БАД используют определенные виды продуктов растительного, животного, минерального происхождения, их компоненты или синтетические аналоги:
- продукты, которые использовались в пищу человечеством в исторический отрезок времени;
- продукты, входящие в рацион питания современного человека;
- выделенные и очищенные компоненты пищи и их синтетические аналоги;
- условно пищевые или непищевые продукты, содержащие биологически активные вещества, необходимые для нормального функционирования организма человека и аналогичные тем, которые он должен получать с пищей.
На современном этапе создания рецептур БАД, предназначенных для промышленного производства, перед учеными и производителями стоят следующие задачи:
- изучение состава и свойств продуктов питания, входящих в рацион современного человека;
- выделение и изучение биохимической и фармакологической активности биологически активных веществ, в том числе эссенциальных и минорных, входящих в продукты питания;
- анализ и изучение данных истории, археологии и литературы с целью определения продуктов, входивших ранее в рацион питания наших предков;
- изучение влияния продуктов питания, их компонентов или аналогов на организм здорового и больного человека, в том числе в условиях неблагоприятного воздействия окружающей среды;
- сбор и анализ данных эпидемиологических исследований с целью изучения влияния рационов питания и отдельных видов продуктов на определенные группы населения;
- определение концентраций макро- и микронутриентов в продуктах питания и подбор дозы, оптимальной для использования в составе БАД.
При разработке БАД целесообразно использовать накопленный опыт и данные по лечебному, лечебно-профилактическому и функциональному питанию, фитотерапии, биохимии, опыт по национальному питанию народов мира, данные по заболеваемости в различных регионах и их зависимость от рациона и множество других факторов [3, 11-14].
Важнейшим аспектом разработки рецептуры БАД является определение дозы вводимых ингредиентов. Суточная доза БАД должна довести содержание естественных эссенциальных макро- и микронутриентов, минорных компонентов до соответствующего уровня их физиологической потребности у здорового или больного человека, но не более разовой терапевтической дозы, определенной при применении этих веществ в качестве лекарственных средств, при условии приема препаратов не менее двух раз в сутки.
В настоящее время в мире существует несколько школ разработчиков БАД, отличающихся друг от друга подходами к целому ряду проблем: европейская, российская, азиатская (восточная), американская. В основу европейского способа составления БАД заложены не только известные с древних времен принципы питания, но и современные научные данные и воззрения. Биологически активные добавки к пище, производимые в Европе, являются поликомпонентными системами, включающими от 3 до 25 ингредиентов. При составлении прописей обычно выделяют действующее «ядро», т.е. 2-3 основных действующих компонента, наиболее часто встречающихся в традиционных сочетаниях. Параллельно проводят изучение и отбор видов сырья, действующих на сопряженные системы организма. Производство БАД в России стало развиваться только в последние 8 — 10 лет.
В индустриальных странах обогащение пищевых продуктов используется все более широко в качестве компенсации влияния процессов обработки и очистки пищевых продуктов на их питательную ценность и является альтернативой между попытками сохранить питательный состав продуктов путем щадящей обработки и минимального очищения или поддержать его путем обогащения и других мер воздействия.
При обогащении пищевых продуктов питания функциональными инфедиентами, согласно Шатнюк Л.Н. [12,15], следует соблюдать следующие основные принципы:
1. Для обогащения пищевых продуктов следует использовать те микронутриенты, дефицит которых реально имеет место и достаточно широко распространен и опасен для здоровья.
2. Обогащение витаминами, минеральными и другими биологически активными веществами следует, прежде всего, продукты массового потребления, доступные для всех групп детского и взрослого населения и регулярно используемые в повседневном питании.
3. Дополнительная стоимость обогащенного продукта должна быть приемлема для предназначенного потребителя.
4. Вносимый питательный элемент должен быть биологически доступен в продукте.
5. Обогащение пищевых продуктов не должно ухудшать потребительские свойства этих продуктов: уменьшать содержание и усвояемость других содержащихся в них пищевых веществ, изменять вкус, аромат.
6. При обогащении пищевых продуктов необходимо учитывать возможность химического взаимодействия обогащающих добавок между собой и с компонентами обогащаемого продукта, и выбрать их такие сочетания, формы, способы и стадии внесении, которые обеспечивают их максимальную сохранность в процессе производства и хранения.
7. Регламентируемое, т.е. гарантируемое производителем, содержание витаминов, минеральных и других веществ в обогащенном ими продукте питания должно быть достаточным для удовлетворения за счет данного продукта не ниже 15% средней суточной потребности в этих микронутриентах при обычном уровне потребления обогащенного продукта.
8. Количество функциональных ингредиентов, дополнительно вносимых в обогащаемые ими продукты, должно быть рассчитано с учетом их возможного естественного содержания в исходном продукте или сырье, используемом для его изготовления, а также потерь в процессе производства и хранения с тем, чтобы обеспечить их содержание на уровне не ниже регламентируемого в течение всего срока годности обогащенного продукта.
9. Регламентируемое содержание функциональных ингредиентов в обогащаемых ими продуктах должно быть указано на индивидуальной упаковке этого продукта и строго контролироваться.
10. Эффективность обогащенных продуктов должна быть убедительно подтверждена апробацией на репрезентативных группах людей, демонстрирующей не только их полную безопасность, приемлемые вкусовые качества, но также хорошую усвояемость и способность улучшать обеспеченность организма микронутриентами, введенными в состав обогащенных продуктов.
Процесс обогащения продуктов функциональными ингредиентами достаточно сложен, так как при этом необходимо учитывать ряд факторов:
- совместимость компонентов функциональных ингредиентов между собой;
- совместимость компонентов функциональных ингредиентов и обогащаемого продукта;
- влияние технологической, в том числе термической, обработки продуктов на эффективность обогащения.
Теоретически все продукты могут быть обогащены макро- и микронутриентами для восстановления свойств, утерянных в процессе хранения, при технологической обработке для компенсации оскудения рациона вследствие изменения структуры питания и с целью оздоровления.
Многолетний международный опыт показал, что многие страны добились успеха в коррекции рациона питания и улучшения здоровья населения с помощью обогащенных продуктов. Обогащение продуктов должно являться не отдельной самостоятельной процедурой, а частью национальных (региональных) программ, связанных с питанием и здоровьем отдельных групп населения и популяции [3].
Современные способы получения биологически активных белков из молочного сырья
В настоящее время промышленное применение имеют два способа выделения сывороточных белков: метод баромембранной технологии и кислотно-тепловой способ коагуляции. Нагревание сыворотки до температуры 90С приводит к денатурации термолабильных сывороточных белков, а при значениях рН 4,4-4,6, нарушается агрегативная устойчивость, они коагулируют и выделяются в виде хлопьев, которые отделяются отстаиванием или центробежным способом на специальных сепараторах. Полученные белки для пищевых целей практически не используются, несмотря на их уникальные свойства, высокую пищевую и биологическую ценность.
Одним из мембранных способов получения концентратов сывороточных белков молока является ультрафильтрация. Ультрафильтрация сыворотки позволяет получать белковые концентраты с содержанием белка от 30 до 95%, которые затем используются при производстве сыра, творога, обогащенных детских молочных продуктов, белковых биологически активных добавок для детского и спортивного питания.
Для создания конкурентоспособных бифидогенных и бифидоактивных молочных продуктов, ликвидации белкового дефицита, повышения биологической ценности традиционных пищевых белков отечественными учеными предлагается использовать гидролизаты сывороточных белков, полученные многостадийной обработкой молочного сырья, включающей последовательное выполнение операций: приемки молочного сырья, отделение жира и казеиновой пыли, пастеризацию, охлаждение, фракционирование молочной сыворотки методом ультрафильтрации, сбор концентрата и его ферментативный гидролиз, последующую сушку. К сожалению, такими технологиями получения белковых концентратов не предусмотрено получение низкомолекулярных биологически активных белков молока, важная роль которых в метаболизме организма человека неоспорима. В связи с этим, вышеизложенные методы получения сыворотных белков молока нельзя рассматривать в качестве возможных для получения фракции минорных белков молока.
Относительно новым направлением получения сывороточных катионных белков молока в условиях промышленного производства является применение хроматографического способа их очистки. Так, для производства лактоферрина в промышленных масштабах в Японии используются катионнообменные смолы, на которых ЛФ абсорбируется. На второй стадии технологического процесса катионнообменная смола промывается соответствующим раствором, а абсорбированные вещества экстрагируются с помощью солевых растворов. Применение такого метода дает возможность получения фракции лактоферрина высокой чистоты. Для очистки и концентрации ЛФ используются также методы деминерализации и мембранной фильтрации [64].
Для очистки ЛП из молочного сырья в лабораторных условиях производства турецкими учеными также предложены способы ступенчатой ионообменной хроматографии. Технология получения включает в себя последовательное применение следующих операций: получение обезжиренного молока, смешение с катионообменником типа Amberlite CG 50 №Ґ , перемешивание, удаление декантацией молока, промывание катионообменной смолы, элюция фракции белков, содержащей ЛП, высаливание фракции белков молока сульфатом аммония, осаждение центрифугированием, деминерализация методом диализа, хроматографическая очистка на КМ Сефадекс С-50, затем высаливание очищенной фракции белков сульфатом аммония, ее осаждение центрифугированием, деминерализация методом диализа с последующими этапами хроматографической очистки на Сефадекс G-100, высаливанием сульфатом аммония, осаждением центрифугированием, и удалением сопутствующих солей методом диализа [92].
Все применяемые в настоящее время схемы очистки ангиогенина и пРНКазы из биологических жидкостей в качестве основного этапа также включают катионнообменную хроматографию. Модификации касаются в основном хроматографических сорбентов. На первой стадии очистки на колонке с КМ-целлюлозой 52 ("Whatman LTD", Англия) получают фракцию катионных белков, включающую и ангиогенин. Затем проводят хроматографию на колонке с сильным катионообменником Mono-S ("Pharmacia", Швеция). На последнем этапе препарат очищают до электрофоретической гомогенности обратнофазовой гидрофобной хроматографией при высоком давлении с использованием колонки С 18 ("Sinchrom Inc."). Достигнута также хорошая степень очистки ангиогенина от балластных белков с помощью хроматографии на КМ-сефарозе CL-6B ("Pharmacia Biotech LTD", Швеция), с последующей рехроматографией содержащих ангиогенин фракций на колонке Mono-S ("Pharmacia Biotech LTD", Швеция). Разработан способ получения из молока электрофоретически чистого активного препарата ангиогенина хроматографией низкого давления. Процедура включает последовательно очистку на КМ-целлюлозе 32 ("Reanal", Венгрия), CMoyopearl 650 S ("Tosoh", Япония) и Butyloyopearl 650 S ("Tosoh", Япония). Преимуществом этого способа является исключение на последних этапах очистки препарата дорогостоящей аппаратуры для жидкостной хроматографии высокого давления [1, 176-181].
Таким образом, на основании вышеизложенного следует считать ионообменную хроматографию одним из перспективных способов получения биологически активных катионных белков из молочного сырья. Кроме того, представляется целесообразным комплексное применение мембранных и хроматографических методов обработки с точки зрения получения широкого спектра белковых композиций на их основе.
Анализ литературных источников отечественной и зарубежной научно-технической, патентной литературы свидетельствует о том, что в последние годы в области отраслевой науки все большую актуальность приобретает направление получения минорных биологически активных веществ из животного сырья и создание на их основе БАД, обладающих направленной физиологической активностью, а также обеспечивающих формирование требуемых для пищевых продуктов потребительских свойств в составе обогащенных ими продуктов лечебно-профилактической направленности.
В связи с этим, целью настоящей работы являлось - разработка технологии биологически активного препарата на основе композиции защитного комплекса молока и куриного лизоцима для дальнейшего использования в качестве активной основы многокомпонентных продуктов лечебно-профилактической направленности.
Определение совместимости компонентов композиционного БАП «МОБЕЛИЗ» в жидкой форме
Одним из важных принципов получения биологически активного препарата является определение совместимости компонентов, входящих в его состав. Совместимость компонентов разрабатываемой композиции определяется постоянством состава компонентов, отсутствием отрицательного влияния друг на друга или проявлением синергетического взаимодействия компонентов комплексного препарата, а также постоянством органолептических, физико-химических свойств компонентов в процессе их сочетания и хранения готового БАП.
С целью получения жидкой формы композиционного препарата «МОБЕЛИЗ» белки растворяли в используемых обычно в технологиях получения жидких форм биологически активных препаратов водные среды:
- дистиллированная вода (рН 5,5-5,7);
- физиологический раствор - 0,09% изотонический раствор хлорида натрия с рН близким к значениям данного показателя коровьего молока, безопасный, широко применяемый в фармакологии, медицине и пищевой промышленности;
- 0,05 М калийфосфатный буфер (рН = 6,2-6,3) - наиболее часто используется в лабораторной практике, безопасный для применения в пищевой промышленности.
Готовили растворы монопрепаратов компонентов (КСБМ, к-ЛЦ) и проводили составление композиционного БАП «МОБЕЛИЗ» при различных соотношениях КСБМ : к-ЛЦ = 1:1, 1:2, 2:1. При определении уровня содержания белков в составе композиции руководствовались нормами их содержания в комплексе КСБМ цельного «парного» молока и дозировками к-ЛЦ, которые определены как эффективные для лечебно-профилактической цели и используются в технологии получения функциональных пищевых продуктов [209].
Изменение органолептических, физико-химических показателей, ферментативной активности и содержания белков в составе монопрепаратов и композиционном БАП фиксировали сразу после растворения и в течение 1, 3, 12, 24, 48, 72, 168 ч хранения при комнатной температуре (плюс 20±2С) и температуре бытового холодильника (плюс 4±2С). Результаты исследований представлены на рисунках 14-23. Как показали исследования, сразу после составления белковой композиции (БАП) не происходит изменений в активности компонентов по сравнению с соответствующими показателями в растворах препаратов КСБМ и к-ЛЦ. В связи с этим, в дальнейшем при оценке изменения активности компонентов в процессе хранения за 100% было принято значение ферментативной активности каждого компонента сразу после составления композиционного БАП. Характеристика жидкой формы полученного БАП представлена в таблице 7. Исследования показали, что комплексование КСБМ с к-ЛЦ не оказывает существенного влияния на изменении органолептических показателей композиционного препарата на их основе.
Хранение жидкой формы БАП проводили без соблюдения правил асептики в открытой емкости и с соблюдением асептических условий после микрофильтрации белкового раствора. Результаты исследований изменения биологической активности компонентов БАП в процессе хранения в неасептических условиях представлены на рисунках 14-23.
Как видно из графиков на рисунках 14-15 в ходе хранения препарата КСБМ и композиционного БАП (жидкая форма) в обоих случаях наблюдается снижение активности ЛП в зависимости от соотношения компонентов в композиции и среды. В составе КСБМ через 3 ч хранения при температуре плюс 4±2С и плюс 20±2С активность ЛП снижается более интенсивно по сравнению с композиционным БАП. Такая тенденция наблюдается и через 12 часов хранения. При хранении растворов препаратов при температуре плюс 20±2С резкое падение активности ЛП наблюдается в течение 24 ч и через 48 часов хранения наблюдается практически полная инактивация фермента.
Как видно из таблицы 8, наиболее длительные сроки сохранности ферментативной активности ЛП наблюдаются при температуре плюс 4±2С. В композиции с к-ЛЦ отмечается увеличение продолжительности сохранности ЛП. Так, уже при соотношении компонентов в БАП 2:1 отмечено статистически достоверное (по сравнению с КСБМ) продление сроков сохранности в случае применения калийфосфатного буфера и физиологического раствора. Увеличение к-ЛЦ в составе композиционного БАП до концентрации, обеспечивающей соотношение компонентов во всех средах как 1:1, также приводит к продлению сроков сохранности лактопероксидазы. Наименьшее значение период Т5о было выявлено при соотношении компонентов в БАП 1:2. Немаловажным фактором является среда жидкой формы препарата. Наименее благоприятной средой для сохранности ЛП является дистиллированная вода. Наиболее продолжительные сроки сохранности ЛП отмечены в физиологическом растворе.
Изменение активности пРНКазы в составе КСБМ и композиционного БАП в процессе хранения показаны на рисунках 16-17. Как видно из графика на рисунке 16 в первые 24 часа хранения при температуре плюс 4±2С происходит только незначительное снижение активности фермента в исследуемых образцах. Позже активность пРНКазы снижается в зависимости от состава раствора белка, в том числе от соотношения КСБМ и к-ЛЦ. В составе КСБМ в рассматриваемых средах фермент сохраняется хуже, чем в составе БАП. Причем, наименьшее значение активности пРНКазы в составе БАП имело место при соотношении компонентов 1:1 в дистиллированной воде, а наибольшее - при соотношении компонентов 1:2 в физиологическом растворе. В этом случае высокая активность рибонуклеазы (до -80%) сохранялась и через 3 суток.
Характер изменения активности пРНКазы в составе КСБМ и композиционного БАП при температурах плюс 4±2С и плюс 20±2С был различен. Следует отметить, что при хранении препаратов в течение 2 суток максимальное снижение активности пРНКазы (на 25-30%) вявлено при температуре плюс 4±2С, тогда как при плюс 20±2С активность пРНКазы снижается не более чем на 10%, что особенно выражено в составе БАП соотношении компонентов 2:1. Однако уже на третьи сутки хранения при комнатной температуре активность фермента начинает резко снижаться во всех испытуемых образцах, значительно опережая динамику снижения активности препарата, хранящегося при температуре плюс 4±2С. Наименьшее падение активности пРНКазы на протяжении всего рассматриваемого срока хранения, как при плюс 4±2С, так и при плюс 20±2С отмечено в образцах БАП при соотношении компонентов 1:2 в физиологическом растворе.
Йогурт
При разработке БАП для обогащения молочных продуктов, в том числе кисломолочных, к компонентам, входящим в его состав предъявляют ряд технологических требований. Прежде всего, добавление биологически активных препаратов не должно изменять качественных характеристик готового продукта, а именно органолептические, физико-химические и микробиологические показатели. Кроме того, введение БАП не должно влиять на продолжительность технологического процесса и способствовать снижению сроков годности и хранения продуктов. В связи с тем, что в состав БАП «МОБЕЛИЗ» входят компоненты, обладающие антимикробным действием, проводили исследование влияния БАП на развитие микрофлоры закваски в процессе сквашивания молочного сырья и, как следствие, продолжительности сквашивания, а также развитие микроорганизмов (в том числе способных вызывать порчу) при хранении готового продукта.
Образцы йогурта были получены в лабораторных условиях на базе МГУПБ, технологический процесс получения которых проводили, как описано выше. Внесение БАП «МОБЕЛИЗ» из расчета 0,32-0,35 г сухой формы препарата на 1 кг продукта проводили в опытные образцы йогурта №1 на стадии заквашивания; в опытные образцы №2 - после сквашивания. В контрольные образцы йогурта БАП не вносили. Готовый продукт разливали в стерильную посуду и хранили при температуре плюс (4±2С) в течение 14 суток.
В условиях промышленного производства выработка йогурта осуществлялась по традиционной схеме получения данного вида продукта, согласно действующей НТД. После внесения БАП в состав йогурта продукт был расфасован в полистирольные стаканчики по 0,25 кг. Готовый продукт хранили при температуре плюс (4±2С) в течение 14 суток.
Как следует из графика, приведенного на рисунке 45, введение БАП «МОБЕЛИЗ» в состав молочного сырья на стадии заквашивания не оказывает существенного влияния на продолжительность процесса сквашивания.
Изменение активной и титруемой кислотности в трех исследуемых образцах сквашиваемого йогурта были достаточно сравнимы (рисунок 45), статистически достоверные различия между ними отсутствуют.
Это может свидетельствовать о том, что компоненты БАП «МОБЕЛИЗ» не оказывают ингибирующего влияния на развитие микроорганизмов, входящих в состав закваски для йогурта (Str.termophilus, Lact.bulgaricus) в процессе сквашивания.
Анализ, обогащенного БАП «МОБЕЛИЗ» йогурта по показателям качества свидетельствует: продукт представляет собой однородную, в меру вязкую жидкость молочно-белого цвета, с характерным для йогурта кисломолочным вкусом. По физико-химическим показателям йогурт соответствовал следующим показателям: массовая доля жира - 2,5%, белка — 3,23%, в том числе белковые компоненты БАП «МОБЕЛИЗ» - 0,03%; массовая доля сухих и обезжиренных веществ - 9,6%.
Полученные результаты оценки образцов йогурта свидетельствуют о том, что введение в его состав БАП «МОБЕЛИЗ» не оказывало существенного влияния на качественные характеристики готового продукта. По органолептическим, физико-химическим показателям йогурт, обогащенный БАП «МОБЕЛИЗ», отвечал требованиям соответствующего действующего нормативного документа.
Известно, что в процессе хранения готовых молочных продуктов происходит развитие не только «полезных» микроорганизмов, входящих в состав закваски, но и «нежелательной» микрофлоры, способной вызвать появление пороков и порчи. В результате жизнедеятельности этих микроорганизмов происходит интенсивное кислотообразование, сопровождающееся снижением показателя рН и, как следствие, резким повышением значения титруемой кислотности, обуславливающие излишне кислый вкус и неприятный запах.
Результаты исследования влияния БАП «МОБЕЛИЗ» на свойства йогурта в процессе хранения представлены на рисунках 46-47.
Из графиков на рисунке 46 видно, что в процессе хранения образцов йогурта в течение 1 суток значительных различий в изменении показателя рН в опытных образцах по сравнению с контрольными не было. Некоторая разница в значении этого показателя наблюдается с третьего, а затем и более отчетливо, с пятого дня хранения исследуемых образцов. Продолжение хранения йогурта до 7 суток сопровождалось дальнейшим снижением активной кислотности во всех исследуемых образцах. Однако в опытных образцах с БАП по сравнению с контрольными наблюдалось менее интенсивное падение этого показателя. Следует отметить, что минимальное снижение активной кислотности в ходе исследования было характерно для опытного образца № 2 (БАЛ введен после процесса сквашивания).
Изучение изменения титруемой кислотности в процессе хранения исследуемых образцов показало, что резкое повышение этого показателя наблюдается после 3 дней хранения йогурта, что особенно выражено в контрольном образце.
В течение последующих дней хранения отмечается сохранение тенденции увеличения кислотности во всех образцах. Замечено, что в опытном образце № 2 после 5 дней хранения изменение титруемой кислотности было ниже по сравнению с опытным образцом № 1 на 13±2Т, а по сравнению с контрольным образцом - на 29±3Т. Хранение йогурта в течение 7 дней привело к значительному нарастанию показателя титруемой кислотности. Тем не менее, в составе обогащенного БАП «МОБЕЛИЗ» йогурта это показатель был несколько ниже по сравнению с контрольным образцом.
Во всех исследуемых образцах йогурта в процессе хранения происходило развитие микрофлоры. Причем, введение БАП «МОБЕЛИЗ» в состав йогурта не оказывает существенного влияния на развитие микрофлоры в процессе хранения (рисунок 47).
Следует отметить, что внесение БАП после сквашивания йогурта (образец №2) несколько сдерживает рост развития общего количества микроорганизмов в течение 1-3 суток. Ели препарат вносили на стадии сквашивания (образец №1) защитный эффект отсутствовал. После 5 суток хранения образцов йогурта общее количество микроорганизмов (КОЕ/г) в опытном образце № 2 отличалось от образца № 1 и контрольного образца на один порядок. Подобная тенденция сохранилась и на 7 сутки хранения исследуемых образцов. Вероятно, это связано с тем, что в условиях кислой среды продукта биологически активные ферменты БАП «МОБЕЛИЗ» значительно теряют свою активность в течение первых трех суток хранения. Известно, что белки активны в определенных пределах концентрации водородных ионов, которая, как правило, соответствует физиологическим значениям рН среды (6,0 -8,0). Кроме того, для каждого фермента существует интервал рН оптимального действия. Согласно литературным данным для биологически активных белков, входящих в состав БАП «МОБЕЛИЗ» эти показатели следующие: рН = 5,5-6,5 (ЛП), рН = 7-8 (АНГ), рН = 7,5 (пРНКаза), рН = 6-7 (к-ЛЦ), рН = 6 (ЛФ). Сочетание низких значений рН и температуры хранения (6±2С) приводит к снижению проявления активности компонентами БАП.
