Введение к работе
Актуальность работы. В связи с интенсивным развитием молочной промышленности в настоящее время существует проблема производства кисломолочных продуктов с заданными стабильными показателями качества. Для контроля их качества до сих пор нет четко выработанной схемы, по которой бы определялась не только технологическая пригодность, но и безопасность использования чистых культур бактерий и бактериальных заквасок для производства кисломолочных продуктов.
Проблема достоверного определения качества и, прежде всего, видовая идентификация молочнокислых бактерий, входящих в состав бактериальных заквасок, являются особенно актуальными.
Одним из подходов к решению описанных проблем, связанных с контролем за качеством и экспертизой молочных продуктов, является использование тест-систем, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР), для точной идентификации микроорганизмов, входящих в состав бактериальных заквасок, бактериальных концентратов и чистых культур, используемых в производстве кисломолочной продукции.
Бактерии Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus являются основным компонентом кисломолочных продуктов функционального питания. Употребление молочных продуктов, содержащих эти микроорганизмы, способствует нормализации кишечной микрофлоры, укреплению иммунитета организма.
В работах отечественных исследователей (А.Г. Точилина, С.Г. Ботина), посвященных использованию ДНК-методов для видовой идентификации молочнокислых бактерии, были показаны важные достоинства ПЦР - универсальность, высокая чувствительность и специфичность, способность к дифференцированию близкородственных бактерий.
Однако в доступной нам литературе, мы не обнаружили сведений об использовании разработанных ПЦР-тест-систем в промышленных условиях производства молочных продуктов, позволяющих совершенствовать систему контроля за качеством бактериальных заквасок и проводить экспертизу кисломолочных продуктов на более высоком уровне. Именно поэтому разработка ПЦР-тестов остается актуальной задачей и представляет самостоятельный научный и практический интерес.
Цель работы и задачи исследований. Целью диссертационной работы являлись: изучение биохимических свойств, структуры генома, разработка ПЦР-тест-системы для родовой и видовой идентификации микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus.
Для достижения поставленной цели определены следующие задачи исследования:
- изучение биохимических и фенотипических свойств микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus;
- проведение анализа нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей синтез 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus;
- подбор и синтез композиции универсальных праймеров для амплификации гена 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus;
- оптимизация параметров амплификации гена 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus;
- изучение специфичности и чувствительности разработанной ПЦР-тест-системы;
- проведение сравнительной оценки метода видовой идентификации микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus, с использованием ПЦР и классического биохимического метода;
- описание ПЦР-тест-системы для идентификации микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus и расчет затрат на проведение исследования в микробиологических лабораториях молочных предприятий.
Научная новизна работы. Сконструированы родо- и видоспецифичные праймеры для амплификации гена 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus, содержащихся в кисломолочных продуктах.
Проведена сравнительная оценка видовой специфичности методом ПЦР с классическим биохимическим методом.
Практическая значимость работы. В итоге проведенной диссертационной работы была разработана тест-система для идентификации молочнокислых бактерий в кисломолочных продуктах, что позволит совершенствовать контроль за качеством и проведение экспертизы производимой кисломолочной продукции.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были предметом докладов и обсуждений на международных и межрегиональных научно-технических конференциях, семинарах, конгрессах: Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Инструментальные методы для исследования живых систем в пищевых производствах» (Кемерово, 2009); III ежегодного смотра-сессии аспирантов и молодых ученых по отраслям наук (Вологда, 2009); II Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы развития современной науки, техники и технологии» (Москва, 2010); Международного научно-практического семинара «Современные технологии продуктов питания: теория и практика производства» (Омск, 2010); III Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово, 2010); VII Специализированного конгресса Молочная промышленность Сибири (Барнаул, 2010); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Проведение научных исследований под руководством приглашенных исследователей в 2010 году» (Кемерово, 2010); конкурса "Участник молодежного научно-инновационного конкурса" («У.М.Н.И.К.») Федерального Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере на территории Кемеровской области (Кемерово, 2010); VI Всероссийской научно-практической конференции «Качество продукции, технологий и образования» (Магнитогорск, 2011); IV Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе – три в журналах, рекомендованных экспертным советом ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих основных разделов: введение, аналитический обзор, объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, практическая реализация результатов работы, результаты и выводы, список использованных источников и приложения. Основное содержание работы изложено на 106 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 151 наименование.
