Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Фармако-технологическая характеристика плодов софоры японской 9
1.1.1.Общие сведения о софоре японской (Sophorajaponica L. сем. Fabacea). Ботаническое описание, распространение, запасы и особенности заготовки плодов .9
1.1.2. Химический состав 11
1.1.3. Применение и препараты 13
1.2. Современное состояние исследований по технологии экстракционных препаратов
из лекарственного растительного сырья и мягких лекарственных форм 15
1.2.1. Классификация экстракционных фитопрепаратов, их номенклатура 15
1.2.2. Современные подходы к экстрагированию лекарственного сырья и пути повышения эффективности экстракции 16
1.2.3. Закономерности процесса экстрагирования высушенного растительного сырья 19
1.2.4. Факторы, влияющие на полноту и скорость экстракции 21
1.3. Современное состояние исследований по технологии мягких лекарственных форм
28
Выводы по обзору литературы 39
Глава 2. Фитохимическое исследование плодов софоры японской 40
2.1. Исследования по стандартизации плодов софоры японской 40
2.2. Исследование содержания и состава полисахаридного комплекса в плодах и настойке софоры японской 49
Выводы по главе 2 54
Глава 3. Исследования но подбору оптимальных условий экстракции плодов софоры японской 55
3.1. Изучение влияния состава экстрагента на эффективность экстракции флавоноидов из плодов софоры японской 55
3.2. Сравнительное исследование антиоксидантної! активности различных извлечений из плодов софоры японской 64
3.3. Содержание полисахаридов в извлечениях плодов софоры японской 69
3.4. Выбор оптимальных условий экстрагирования при получении извлечения из плодов софоры японской водными растворами ПАВ 71
Выводы по главе 3 73
Глава 4. Исследования по разработке состава, технологии и стандартизации мази плодов софоры японской 75
4.1. Разработка оптимального состава мази плодов софоры японской 75
4.2. Биофармацевтическая оценка мазей с извлечениями из плодов софоры японской, полученные в присутствии ПАВ 80
4.3. Изучение структурно-механических свойств мазей из плодов софоры японской на различных основах 81
4.4.Разработка технологической схемы производства мази плодов софоры японской .91
4.5. Оценка качества и стабильности мази плодов софоры японской 94
Выводы по главе 4 110
Глава 5. Исследования фармакологической активности мази из плодов софоры японской 111
5.1. Исследования острой и хронической токсичности мази плодов софоры японской 111
5.2. Исследования венопротекторной активности мази плодов софоры японской 112
5.3 Исследования ранозаживляющей активности мази плодов софоры японской 113
5.4. Оценка антиоксиданти ой активности мази плодов софоры японской на моделях in vitro и in vivo 115
Выводы по главе 5 123
Список литературы 126
Приложение 14D
- Классификация экстракционных фитопрепаратов, их номенклатура
- Исследование содержания и состава полисахаридного комплекса в плодах и настойке софоры японской
- Сравнительное исследование антиоксидантної! активности различных извлечений из плодов софоры японской
Введение к работе
Актуальность темы
Плоды софоры японской издавна используются в народной и клинической медицине при различных заболеваниях. Биологическая ценность плодов софоры японской определяется высоким содержанием флавоноидов, тритер-пеноидов и полисахаридов.
Лекарственные препараты из плодов софоры японской могут оказывать противовоспалительное и иммуномодулирующее действие. Однако в настоящее время изготавливается только настойка 1:2 на 50% этиловом спирте, которую используют наружно для лечения экзем, острых и хронических гнойных воспалительных процессов. При этом большая часть биологически активных веществ, не извлекаются указанным экстрагентом.
В 80-х годах профессором В.А.Бандюковой установлено, что при экстрагировании 50% этиловым спиртом в настойку переходит лишь часть флавоноидов, другие биологически активные вещества переходят еще в меньшей степени.
Одной из причин этого является то, что экстрагенты, основой которых является этиловый спирт, не позволяют извлекать ко мплекс биологически - активных веществ. В тоже время существуют предпосылки для более рационального использования сырья за счет применения новых экстрагентов и более эффективных способов экстракции. Это возможно путем применения некоторых поверхностно-активных веществ (ПАВ). В литературе имеются примеры использования ПАВ для получения фитопрепаратов. Некоторые авторы доказали, что с помощью экстрагентов на основе ПАВ достигается не только большая эффективность экстракции, но также увеличивается число экстрагируемых веществ. В отношении плодов софоры японской эти вопросы не исследованы.
Поэтому разработка новой эффективной технологии переработки плодов софоры японской с помощью некоторых ПАВ является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.
Другим актуальным вопросом является создание мягких лекарственных форм с противовоспалительным и ранозаживляющим действием на основе извлечений из плодов софоры японской.
Цель и задачи исследований
Целью диссертационной работы является разработка способа экстракции, позволяющего извлечь более широкий спектр биологически активных веществ (БАВ) из плодов софоры японской в максимальном количестве, и создание мази, содержащей полученные извлечения.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. На основании результатов фармакологического скрининга осуществить подбор экстрагента, обеспечивающего извлечение наиболее широкого спектра БАВ из плодов софоры японской в максимальном количестве.
2. Оптимизировать параметры экстракции плодов софоры японской выбранным экстрагентом.
3. Осуществить подбор вспомогательных веществ и разработать технологию мази на основании результатов биофармацевтических и реологических исследований.
4. Разработать и предложить нормы и методики оценки качества мази и оценить её стабильность.
5. Провести исследования венотонизирующей, капилляропротекторной, антиоксидантной и ранозаживляющей активности разработанной мази.
6. Выбрать и оптимизировать методику количественного определения флавоноидов в плодах и извлечениях софоры японской.
Научная новизна
Изучена возможность использования ПАВ для экстракции биологически активных веществ из плодов софоры японской. Сравнительное изучение показало, что наиболее эффективными экстрагентами являются растворы ПАВ ионогенного характера. Использование ПАВ позволяет про вести экстракцию за одну стадию технологического процесса. Доказано, что замена этилового спирта как экстрагента на водный раствор ПАВ увеличивает качественный состав извлечения и выход БАВ. Сравнительное изучение антиоксидантной активности спиртоводных извлечений и извлечений, полученных предлагаемым экстрагентом, показало более высокую активность последних.
Разработана технология получения мази на основе извлечений из плодов софоры японской водными растворами ПАВ, преимуществом которой является то, что при получении мази исключается стадия сгущения или сушки.
На основании биофармацевтических и реологических исследований установлено, что оптимальным основообразующим компонентом для создания мази, содержащей извлечения из плодов софоры японской, полученные водными растворами ПАВ (натрия олеата и натрия лаурилсульфата), является карбопол.
В исследованиях in vitro установлено, что разработанная мазь по антиоксидантной активности (АОА) превосходит широко использующиеся для лечения ран мази «Левомеколь» и «Актовегин».
На основании исследований АОА in vivo показано, что по ранозажив-ляющему действию разработанная мазь плодов софоры японской также превосходит «Левомеколь».
Практическая значимость результатов исследования
Разработан способ экстракции плодов софоры японской водными растворами ПАВ, позволяющий извлекать в максимальном количестве комплекс флавоноидов и полисахаридов.
Разработан состав и технология гидрофильной мази, с извлечениями из плодов софоры японской, полученными в присутствии ПАВ (натрия олеата и натрия лаурилсульфата), в качестве гелеобразующего компонента содержащей карбопол, вошедшие в разработанный проект ФСП и лабораторный регламент.
Разработана и валидирована методика количественного определения флаво-ноидов в мази плодов софоры японской методом дифференциальной спек-трофотометрии.
Результаты исследований, посвященных изучению показателей качества и стабильности мази плодов софоры японской, заложены в основу проекта ФСП.
В результате исследований на животных (крысах) установлено, что мазь плодов софоры японской обладает выраженным вено- и капилляропро-текторным, а также ранозаживляющим действием.
Внедрение результатов исследований в практику
Разработан проект ФСП, а также лабораторный регламент на разработанную мазь, прошедшие апробацию ЗАО НПО «Институт экологии питания» (г.Москва) и ЗАО «Ростовская фармацевтическая фабрика».
На защиту выносятся:
1. Результаты исследований по выбору экстрагента, обеспечивающего экстракцию наиболее широкого спектра БАВ из плодов софоры япон \
ской в максимальном количестве и позволяющего использовать полученное извлечение непосредственно для введения его в мазь.
2. Итоги сравнительных исследований АОА различных извлечений из плодов софоры японской, подтверждающие эффективность выбранного эктрагента.
3. Результаты исследований по оптимизации условий экстракции плодов софоры японской предложенным экстрагентом.
4. Состав и технология мази плодов софоры японской, разработанные на основании результатов биофармацевтических и реологических исследований.
5. Результаты исследований острой и хронической токсичности, АОА, ранозаживляющей, вено- и капилляропротекторной активности разработанной мази плодов софоры японской.
Апробация работы
Материалы диссертации прошли апробацию на 61-й и 62-й межрегиональной конференции по фармации «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г.Пятигорск, 2006 и 2007г.) и на IX и X Международном съезде «Фитофарм 2005» и «Фитофарм 2006» (г.Санкт-Петербург).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 2 работы в изданиях, рекомендованных ВАК.
Связь задач исследования с планом НИР учреждения, где выполнялась диссертация.
Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 06/1049).
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 141 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы и 4-х глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы и приложений. Работа содержит 28 таблиц и 31 рисунков. Список литературы включает 139 источников, из них 20 на иностранных языках.
Классификация экстракционных фитопрепаратов, их номенклатура
Согласно определению, фитопрепараты - это лекарственные средства, получаемые исключительно из растительного сырья или целого растения, применяемые для лечения и профилактики различных заболеваний. Термины «фитопрепараты» и «фитотерапия» были введены в обращение французским врачом A.M. Леклерком (1870-1955г.). В настоящее время существует три направления переработки лекарственного растительного сырья: ,.
1) выделение из растений химически чистых индивидуальных веществ или их смесей, полностыо освобожденных от сопутствующих им в растениях различных веществ. Это направление принято называть фотохимическим и полученные препараты можно отнести к фитопрепаратом с большой натяжкой ;
2) получение из растений максимально очищенных (новогаленовых) фитопрепаратов, т.е. продуктов, освобожденных от балластных веществ, но сложных по составу, содержащих комплекс действующих веществ, имеющихся в растении. Для приготовления новогаленовых препаратов используют мягкие, бережные методы обработки растительного материала, стремясь сохранить действующие вещества растений в неизменном состоянии;
3) приготовление суммарных (галеновых) препаратов - это наиболее старый приём переработки растений, благодаря которому получают препараты, содержащие весь комплекс экстрактивных веществ, растворимых в данном растворителе. К этой группе фитопрепаратов относятся настойки и экстракты [106].
Основной стадией получения всех экстракционных препаратов является экстрагирование лекарственного растительного сырья [56].
Значительный вклад в теорию и практику экстрагирования внесли: И.А. Муравьев, Ю.Г. Пшуков, Г.К. Гончаренко, А.Г. Натрадзе, В. Д. Пономарев и др. [82,88,89,90].
Процесс экстрагирования относится к массообменным и определяется основными общими законами массопередачи: молекулярной диффузией, массопроводимостыо и массоотдачей [82].
В современной промышленности, в частности фармацевтической, широко распространена экстракция в системе твердое тело-жидкость. При экстрагировании, в отличие от растворения, переход вещества в раствор осуществляется частично. При этом образуются 2 фазы: раствор экстрактивных веществ в экстрагенте, омывающем сырье и раствор веществ в сырье. Пере- ход веществ из одной фазы в другую осуществляется до тех пор пока имеется разность концентраций между фазами, являющаяся движущей силой процесса экстрагирования. Предельным состоянием массообмена является достижение равновесия системы, выравнивания скорости перехода вещества из одной фазы в другую и обратно при данных условиях. Скорость массопередачи пропорциональна движущей силе процесса [19,82]
А — движущая сила массообменного процесса, кг/м3. Перенос веществ в экстрагент осуществляется молекулярной и конвективной диффузией. Молекулярная диффузия обусловлена хаотическим беспорядочным движением молекул, граничащих друг с другом и находящихся в макроскопическом покое. Интенсивность диффузии зависит от кинетической энергии молекул. Жидкости и растворы диффундируют медленнее, чем газы, т.к. движение молекул в них ограничено. Математическое выражение молекулярной диффузии, определяющей скорость процесса, представлено уравнением первого закона Фика:
(с), через единицу площади (м ) при разности концентраций, рав ной единице (кг/м ) и толщине слоя - 1м;
F-поверхность раздела фаз
Знак « - » означает направление процесса в сторону меньшей концентрации (из клетки).
Математическое выражение представлено уравнением Эйнштейна:
D= Lx 1- , (3)
N бхлхцхг
R-газовая постоянная 8,32, Дж/грам моль; Т-абсолютная температура; N-число Авогадро (6,06x1023); rj- вязкость, Н/(с/м );
r-радиус диффундирующих частиц, м;
Скорость молекулярной диффузии зависит от температуры, радиуса диффундирующих молекул вещества, вязкости среды [62].
Конвективная диффузия — это перенос вещества в виде небольших объёмов раствора. Конвективный перенос вещества происходит в результате сотрясения, изменения температуры, перемешивания и т.д., т.е. причин, вызывающих перемещение жидкости, а вместе с ней и растворённого вещества в турбулентном потоке [89]. Математическое выражение скорости диффузии представлено уравнением: коэффициент конвективной диффузии, который показывает какое количество вещества перейдет через 1м поверхности фазового контакта в воспринимающую среду в течение одной секунды при разности концентрации между слоями, равной единице [80]. При конвективной диффузии размер молекул, вязкость растворителя, кинетическая энергия молекул становятся второстепенными. Главным становятся гидродинамические условия, т.е. скорость и режим движения жидкости.
Конвективная диффузия может быть естественной (за счёт разности плотностей экстрагента и раствора, изменения температуры, гидростатического столба жидкости) и принудительной, которая возникает при перемешивании мешалками, насосами, вибрацией [82].
Молекулярная и конвективная диффузия относятся к свободной диф-фузии, когда массообменные процессы протекают свободно, не встречая на своём пути каких-либо преград. Процесс же извлечения биологически активных веществ из растительного сырья осложняется рядом особенностей, связанных с его клеточной структурой и физико-химическими свойствами [62, 82].
Исследование содержания и состава полисахаридного комплекса в плодах и настойке софоры японской
Перечисленный ранее (глава 1, раздел 1.1) диапазон фармакологической активности трудно связать с содержанием лишь одних флавоноидов в плодах софоры японской, которые считаются основными действующими веществами сырья. Поэтому мы провели исследования полисахаридов, которые так же проявляют ценное фармакологическое действие (иммуномодулирующее, ге-патопротекторное, противовоспалительное) [40,49,74].
Полисахариды в образцах сырья определили в водном извлечении (1:10), полученном при нагревании в колбе с обратным холодильником в течение 30 мин. При добавлении к водному извлечению 3 объемов спирта этилового 95%-го появился хлопьевидный осадок.
Наличие восстанавливающих Сахаров установили реакцией Бертрана по образованию осадка меди оксида при нагревании смеси равных объемов водного извлечения из плодов софоры японской и реактива Фелинга. Появился оранжевый осадок.
Наличие галактуроновой кислоты, входящей в состав полисахаридов плодов софоры японской (слизи и пектиновых веществ), подтвердили карба-золыюй реакцией, основанной на деструкции уронового ангидрида под воздействием кислоты серной концентрированной с последующей конденсацией образующегося фурфурола с карбазолом. Наблюдали образование красно-фиолетового комплекса.
Выделение и разделение полисахаридных фракций проводили по методике Н.К. Кочеткова и М. Sinner [125]. Количественное содержание отдельных фракций полисахаридов определили гравиметрически.
Выделение водорастворимых полисахаридов (ВРПС). Сырье измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметра 1 мм и последовательно очищали хлороформом и спиртом этиловым 96 % в аппарате Сокслета. Шрот высушивали до удаления запаха растворителей и подвергали 3-кратной экстракции водой очищенной при нагревании на кипящей водяной бане 4 ч (соотношение сырья и экстрагента при 1-й экстракции 1:20, время нагревания 2 ч; при 2-й и 3-й экстракциях соотношение: сырье и экстрагент 1:10; время нагревания - по 1 ч).
, ВРПС отфильтровывали через шелковую ткань, объединяли и упаривали до 1/10 первоначального объема. Затем полученное извлечение многократно (5-7 раз) обрабатывали хлороформно-бутанолыюй смесью (соотношение: водное извлечение-смесь 5:1) с целью очистки от белка (метод Сева-га). Сумму ВРПС в супернатанте получали осаждением 3-кратным объемом 96% спирта этилового при комнатной температуре. Осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин, многократно промывали последовательно 96% спиртом этиловым, ацетоном и эфиром диэтиловым, сушили при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния, а затем при 40С в сушильном шкафу до постоянной массы. Полученная сумма ВРПС из плодов софоры японской представляет собой аморфный, сыпучий порошок желтоватого цвета, легко растворимый в воде.
Выделение пектиновых веществ (ПВ). К шроту, оставшемуся после выделения ВРПС, добавляли кипящую воду, подкисленную концентрированной кислотой хлористоводородной (на 100 мл воды добавляли 0,5 мл кислоты хлористоводородной). Смесь выдерживали на водяной бане 1 ч., фильтровали через 4 слоя марли. Пектиновые вещества осаждали после концентрирования до 1/3 первоначального объема и охлаждали 5-кратным объемом 96% спирта этилового. Осадок отделяли центрифугированием, как указано выше, затем его высушивали также до постоянной массы. Фракция пектиновых веществ (ПВ) плодов софоры японской представляет собой блестящий светлосерый порошок.
Выделение геминеллюлозы (ГЦ А). Шрот, оставшийся после выделения ПВ, обрабатывали 50 мл 10% раствора натрия гидроксида и отфильтровали через 4 слоя марли. К полученному фильтрату добавляли 20 мл кислоты уксусной и отфильтровывали образовавшийся осадок через фильтр для мелкопористых осадков. На фильтре получали осадок ГЦ А в виде коричнево-бурого порошка
Выделение гем и целлюлозы (ГЦ В). К фильтрату прибавляли 3-кратный объем 96% спирта этилового для осаждения ГЦ В. Полученный осадок также отфильтровывали и высушивали на воздухе. Фракция ГЦ плодов софоры японской представляла собой сероватый аморфный порошок.
В таблице 6 приведены данные по содержанию полисахаридных фракции в плодах софоры японской.
Сравнительное исследование антиоксидантної! активности различных извлечений из плодов софоры японской
Поскольку в плодах софоры японской присутствуют различные по химической структуре соединения флавоиоидной природы, а их качественный и количественный состав в извлечении не может не сказываться на потенциальной биологической активности, для более объективной сравнительной оценки полученных извлечений было решено провести исследование антиок-сидантной активности (АОА) полученных извлечений из плодов софоры in vitro.
Исследования проводили амперометрическим методом. Сущность данного метода заключается в измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности рабочего электрода при определенном потенциале и сравнении полученного сигнала с сигналом антиоксидантного стандарта, измеренного в тех же условиях. Такой подход позволяет непосредственно определять антиоксидантный потенциал и антиоксидантную емкость изучаемого вещества, суммарно оценивая количество легко окисляемых групп (-ОП, -SII, -Nib), что важно для последующего прогнозирования антиоксидантного эффекта iv vivo [77].
Проводили сравнительные исследования антиоксидантной активности извлечений из плодов софоры японской, полученных с применением различных экстрагентов: на 50% спирта этилового в соотношении 1:2 [24] и 1:5, а также 0,5 и 1,0% водных растворов натрия олеата и 0,5% раствора натрия лаурилсульфата по методике, описанной в разделе 4.1 и 4.2. Для определения антиоксидантной активности все полученные извлечения дополнительно разводили водой очищенной 1:50.
Определение антиоксидантной активности выполнялось с помощью специального анализатора «Цвет Яуза-ААА-01», площадь получаемого графика измеряли в нА с. АОА оценивалась непосредственно путем тестирования разведенных извлечений. Стандартизация антиоксидантной активности осуществлялась с помощью раствора рутина, изучение антиоксидантных свойств которого проводилось на этом же анализаторе в рассчитанной конечной концентрации 0,2 мг/л, 0,5 мг/л, 1,0 мг/л, 4,0 мг/л с последующим построением калибровочного графика (у=0,0005х) [77]. Результаты исследования представлены в таблице 14 и на рис. 5.
Результаты определения антиоксидантной активности свидетельствуют о том, что таковая является максимальной для извлечений, полученных с помощью 0,5% растворов натрия олеата и натрия лаурилсульфата. У извлечений, полученных с использованием 1,0% раствора натрия олеата антиоксидантная активность немного ниже.
Кроме того, исследования антиоксидантных свойств проводили с использованием авторских методик [67,77], моделирующих условия окисли-тельного стресса (ОС) в биосистемах, основой которых является комбиниро-ванная индукция перекисных процессов физическими (УФ-облучение) и химическими (Н2Ог) факторами в искусственно созданных водно-липидных дисперсных системах, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты. АОА определяли по степени ингибирования перекисных процессов в модельных тест-системах в присутствии исследуемых извлечений софоры японской. При использовании тест-систем с комбинированной индукцией сво-боднорадикального окисления (УФО/ Fe T) максимальный антиоксидантныи эффект установлен у извлечений из плодов софоры японской, полученных с помощью водных растворов натрия олеата, их АОА составляла 2,11-2,77 Q-ЕД. АОА спиртовых извлечений (0,91 Q-ЕД) более чем в 3 раза уступала АОА водных извлечений (2,5 Q-ЕД), полученных с помощью водных растворов ПАВ (табл. 16). Результаты определения антиоксидантных свойств извлечений из плодов софоры японской подтверждают, что наиболее оптимальным экстраген-том являются водные растворы ионогенных ПАВ
