Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Ламинариевые и фукусовые водоросли Баренцева и Белого морей и их характеристика 10
1.2. Фитохимический состав промысловых бурых водорослей 11
1.2.1. Моносахариды, маннит 12
1.2.2. Полисахариды: альгиновая кислота и ее соли, фукоидан, ламинаран 13
1.2.3. Липиды и пигменты 16
1.2.4. Макро- и микроэлементы 18
1.2.5. Азотсодержащие вещества 18
1.3. Методы анализа БАВ водорослей 19
1.3.1. Количественное определение маннита 19
1.3.2. Качественный и количественный анализ полисахаридов бурых водорослей 20
1.3.2.1. Качественный анализ полисахаридов бурых водорослей 20
1.3.2.2. Количественный анализ полисахаридов бурых водорослей. 20
1.3.3. Качественный и количественный анализ липидов и пигментов 22
1.3.3.1. Липиды: качественный анализ 22
1.3.3.2. Количественное определение общей суммы липидов 22
1.3.3.3. Качественный и количественный анализ пигментов 23
1.4. Терапевтическое действие БАВ, выделяемых из бурых водорослей 23
1.5. Особенности технологии БАВ, получаемых из водорослей 30
1.6. Современные аспекты гранулирования лекарственных веществ и их фасовки в капсулы 43
1.6.1. Методы грануляции 43
1.6.2. Факторы, влияющие на качество гранул 45
1.6.3. Фасовка гранул в капсулы 47
Заключение 48
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Материалы исследования 49
2.1.1. Характеристика фукуса пузырчатого 49
2.1.1.1. Определение числовых показателей сырья 49
2.1.1.2. Определение технологических показателей сырья 51
2.2. Методы исследования 52
2.2.1. Выбор метода количественного анализа полисахаридов в сырье 52
2.2.2. Выбор метода и разработка методики количественного анализа маннита в сырье 59
2.2.3. Выбор метода и разработка качественного и количественного анализа полисахаридов в лекарственных средствах из фукуса пузырчатого 62
2.2.4. Выбор метода и разработка качественного и количественного анализа густого экстракта фукуса пузырчатого 65
2.2.5. Методы и приборы, используемые для анализа и физико-химического изучения БАВ, густого и сухого экстрактов фукуса пузырчатого 69
2.2.6. Методы и приборы, используемые для анализа порошков, гранул, капсул 71
2.2.7. Математическая обработка результатов эксперимента и оптимизация процессов 74
Выводы к Главе 2 74
Глава 3. Совершенствование технологии комплексной переработки фукуса пузырчатого 75
3.1.1. Получение густого экстракта фукуса пузырчатого 75
3.1.2. Установление срока годности густого экстракта фукуса пузырчатого 79
3.2. Получение маннита 82
3.3. Разработка оптимальной технологии сухого экстракта фукуса пузырчатого 86
3.3.1. Выбор экстрагента и метода экстрагирования 86
3.3.2. Изучение кинетики экстрагирования фукоидана спиртоводными смесями 92
3.3.3. Исследование влияния температуры на выход фукоидана при экстрагировании 10% этиловым спиртом 95
3.3.4. Оптимизация процесса экстрагирования шрота фукуса пузырчатого 10% этиловым спиртом 97
3.3.5. Выбор условий очистки и сушки фукоидансодержащего экстракта 101
3.3.6. Изучение химического состава сухого экстракта фукуса пузырчатого 104
3.3.7. Изучение технологических свойств сухого экстракта фукуса пузырчатого 106
3.3.8. Исследование гигроскопичности сухого экстракта фукуса пузырчатого 107
3.3.9. Установление срока годности сухого экстракта фукуса пузырчатого 110
3.4. Получение альгината натрия 113
3.4.1. Выбор метода экстрагирования 113
3.4.2. Исследование влияния температуры на концентрацию альгиновой кислоты при экстрагировании 2% раствором карбоната натрия 115
3.4.3. Изучение кинетики экстрагирования 2% раствором карбоната натрия методом перколяции 117
3.4.4. Выбор метода очистки альгината натрия 118
3.5. Технологическая схема комплексной технологии переработки фукуса пузырчатого 120
Выводы к главе 3 122
Глава 4. Изучение фармакологической активности сухого экстракта фукуса пузырчатого 124
4.1. Определение острой токсичности сухого экстракта фукуса пузырчатого 124
4.2. Изучение иммуномодулирующей способности сухого экстракта фукуса пузырчатого 125
4.3. Исследование сорбционной способности сухого экстракта фукуса пузырчатого 126
Выводы к главе 4 129
Глава 5. Разработка технологии лекарственного препарата на основе сухого экстракта фукуса пузырчатого в виде гранул в твердых желатиновых капсулах 130
5.1. Гранулирование 130
1. Выбор состава вспомогательных веществ 130
2. Выбор способа грануляции 132
3. Оптимизация процесса гранулирования сухого экстракта фукуса пузырчатого 134
4. Описание технологического процесса грануляции сухого экстракта фукуса пузырчатого и фасовки гранул в капсулы 142
Определение технологических свойств гранул 143
Выбор размера капсул для фасовки гранул сухого экстракта фукуса пузырчатого 145
Определение показателей качества капсул с гранулами сухого экстракта фукуса пузырчатого 147
Изучение гигроскопичности капсул с гранулами сухого экстракта фукуса пузырчатого 148
Установление срока годности капсул с гранулами сухого экстракта фукуса пузырчатого 149
Выводы к главе 5 152
Общие выводы 153
Литература 154
Приложения.
- Терапевтическое действие БАВ, выделяемых из бурых водорослей
- Выбор экстрагента и метода экстрагирования
- Исследование сорбционной способности сухого экстракта фукуса пузырчатого
- Оптимизация процесса гранулирования сухого экстракта фукуса пузырчатого
Введение к работе
з
Актуальность темы. Значительное место в современной медицине занимают лекарственные препараты из растительпого сырья. Несмотря на широкий ассортимент существующих фитопрепаратов, поиск и создание новых эффективных и удобных для применения лекарств на основе биологически активных веществ (БАВ) растительного происхождения не теряют своей актуальности.
Источниками ценных БАВ служат бурые водоросли: ламинариевые и фукусовые. Фукусовые водоросли, в отличие от ламинариевых, традиционно мало используются как для получения пищевых продуктов, так и для выделения БАВ, хотя являются продуцентами веществ с широким спектром фармакологических свойств.
Fucus vesiculosus L. (фукус пузырчатый, далее фукус) является массовым видом литорали Баренцева и Белого морей и содержит такие БАВ, как альгиновая кислота и ее соли, маннит, полиненасыщенные жирные кислоты, стерины, пигменты и другие. Кроме того, в состав фукуса пузырчатого входит полисахарид фукоидан, обладающий иммуномодулирующими свойствами, гепариноподобным действием, противовирусной и противомикробной активностью. Доказаны также гастропротекторный эффект, общеукрепляющее воздействие фукоидана, противоопухолевая активность этого полисахарида. Однако ни в нашей стране, ни за рубежом не создано препаратов на основе фукоидана, притом, что фармакологические исследования проводятся более 30 лет. Отсутствие научно обоснованной технологии фукоидансодержащих препаратов сдерживает внедрение этого ценного полисахарида в медицинскую практику.
В связи с вышеизложенным представляется актуальным совершенствование комплексной технологии, позволяющей получать наряду с традициошгыми веществами из бурых водорослей (маннита и альгината натрия) новые высокоэффективные лекарственные средства, с созданием на их основе перспективных лекарственных форм, удобных в применении и стабильных при хранении.
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы — совершенствование комплексной технологии переработки фукусовых водорослей с получением маннита, альгината натрия и новых лекарственных средств: густого экстракта и сухого экстракта.
В соответствии с заявленной целью нами были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать качественные и количественные характеристики сухого сырья
и шрота фукуса пузырчатого, используемых для получения БАВ.
2. Изучить влияние технологических факторов на кинетику процессов
экстрагирования сырья (слоевищ фукуса и шрота), выходы и концентрацию
БАВ.
3. Разработать оптимальную технологию сухого экстракта фукуса
пузырчатого (СЭФП), содержащего полисахарид фукоидан. Изучить
технологические свойства и стабильность ПрдЗфЗДір|ірд,(
TLKA J
09 юоу.і
4. Разработать методики качественного и количественного анализа новых
лекарственных средств - густого экстракта фукуса пузырчатого (ГЭФП) и
СЭФП.
5. Определить физико-химические показатели выделяемых в процессе
комплексной технологии маннита и альгината натрия в соответствии с
нормативной документацией.
Провести комплекс исследований по разработке рационального состава и технологии гранул СЭФП в твердых желатиновых капсулах. Установить срок годности препарата на основе СЭФП.
Разработать нормативную документации на слоевища фукуса пузырчатого, густой и сухой экстракты фукуса, капсулы с гранулами СЭФП.
Научная новизна. Изучение фитохимического состава слоевищ фукуса пузырчатого позволило установить перспективность использования данного вида сырья для производства лекарственных средств. 'Впервые показана возможность получения маннита, густого и сухого экстрактов, альгината натрия методом последовательных экстракций из фукуса. Выявлено, что изменение последовательности использования экстрагентов приводит к более полному извлечению БАВ сырья, к повышению степени чистоты конечных продуктов. Разработан оригинальный способ получения СЭФП в процессе комплексной переработки фукуса. Получены данные о гигроскопичности СЭФП при влажности воздуха более 75%. Обоснован состав вспомогательных веществ при гранулировании СЭФП.
Практическая значимость Разработан и утвержден лабораторный регламент ЛР 02699872-01-2003 на производство густого экстракта фукуса, маннита, сухого экстракта фукуса, альгината натрия. Новая комплексная технология прошла апробацию на базе научно-производственной лаборатории Института Химии Коми научного центра РАН (г. Сыктывкар) и на предприятии
000 «Сирена» (г. Санкт-Петербург), что подтверждено соответствующими
актами.
Разработаны состав и способ получения гранул СЭФП в твердых желатиновых капсулах. Составлена технологическая схема и описание технологии гранул СЭФП, определены технологические параметры, необходимые для лабораторного регламента на производство готового лекарственного средства — СЭФП в виде гранул в твердых желатиновых капсулах.
Составлены проекты фармакопейных статей предприятия на слоевища фукуса пузырчатого, ГЭФП, СЭФП и гранулы СЭФП в твердых желатиновых капсулах.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на ежегодных конференциях молодых ученых Мурманского морского биологического института 1999-2004; I и II Всероссийских конференциях «Химия и технология растительных веществ», 2000 и 2002 гг.;
1 Всероссийской конференции «Морские прибрежные экосистемы: водоросли,
беспозвоночные и продукты их переработки», Москва - Галицыно, 2002;
Всероссийской конференции молодых ученых, посвящ. 140-летию со дня рожд.
Н.М. Книповича, Мурманск, 2002. Материалы работ представлены на V и VI
Международных съездах «Актуальные проблемы создания новых
5 лекарственных препаратов природного происхождения», 2001 и 2002 гг.; 7th International Phycological Congress, Thessaloniki, Greece, 2001; International Symposium «Chemistry and Biology ofMarine Organism», Greece, 2003 и других.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии и Мурманского морского биологического института КНЦ РАН.
Объем в структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав, содержащих результаты экспериментальных исследования и их
обсуждении, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на
страницах машинописного текста, содержит 65 таблиц, 18 рисунков. Список литературы включает 288 источника.
В обзоре литературы сриведены краткие сведепия о химическом составе бурых водорослей, рассмотрены основные БАВ макрофитов, их терапевтическое действие, препараты и биологически активные добавки на их основе. Обобщены современные аспекты гранулирования и создания лекарственных препаратов в виде капсул. Вторая глава содержит характеристику объектов исследования, выбор методов и разработку методик анализа слоевищ фукуса и препаратов на его основе, описание методов и приборов, используемых в работе. В третье главе изложены результаты экспериментальных исследований по совершенствованию' технологии комплексной переработки фукуса. Четвертая глава посвящена изучению фармакологической активности СЭФП. В пятой главе представлены результаты исследований по разработке оптимальной технологии лекарственного препарата па основе СЭФП в виде гранул в твердых желатиновых капсулах. Приложение включает проекты ФСП на слоевища фукуса пузырчатого, густой и сухой экстракты фукуса, капсулы сухого экстракта, акты и другие материалы.
Считаю своим долгом поблагодарить руководство и администрации Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии и Мурманского морского биологического института за предоставленную возможность выполнить диссертационную работу, и лично директора академика РАН Г. Г. Матишова за поддержку и вникание к исследованиям молодых ученых, и аспирантов.
На защиту выносятся:
Результаты экспериментальных исследований по совершенствованию комплексной технологии лекарственных средств из фукуса - манкита, густого и сухого экстрактов, альгиката натрия; материалы по разработке методик анализа фукуса, густого и сухого экстрактов фукуса; экспериментальные данные по созданию препарата с сухим экстрактом фукуса в виде гранул в твердых желатиновых капсулах; экспериментальные данные по изучению стабильности СЭФП и гранул СЭФП в твердых желатиновых капсулах.
Терапевтическое действие БАВ, выделяемых из бурых водорослей
Скрининг морских водорослей на наличие биологически активных веществ (БАВ) показал, что макрофиты являются продуцентами БАВ и их можно использовать в фармацевтической промышленности для получения лекарственных средств (Спичак и др., 1994; Парчевский, 1998; Биопрепараты и продукты..., 2000; Konig et al., 1994). БАВ потенциально медицинского назначения обнаружены практически среди всех отделов водорослей -красных, бурых, зеленых и других (Подкорытова и др., 1996; Аминина и др., 2003; Clare, 1993; Kuda et al., 1998).
Всего в мире человеком используется около 300 видов морских водорослей. В настоящее время в Белом и Баренцевом морях добывается 6 видов бурых водорослей: 2 вида ламинариевых Laminaria saccharina, L. digitata, 4 вида фукусовых Fucus vesiculosus, F. distichus, F. serratus, Ascophyllum nodosum и 1 вид красной водоросли Ahnfeltia plicata (Макаров B.H. и др., 1993; Макаров В.Н. и др., 1998) Это наиболее массовые, зарослеобразующие виды (Сорокин и др., 1991; Ефимова, 1995; Schoschina et al., 1996)
Маннит. Маннит используется при производстве таблеток, как антисептический порошок для присыпки ран, для приготовления диетических продуктов как заменитель сахара (Воронова и др., 1993; Матишов и др., 1997; Норре, 1979). Маннит - осмотический диуретик, при его введении происходит значительное выделение натрия без существенного выделения калия. Показания к применению: отек головного мозга, острая почечная и почечно-печеночная недостаточность, при операциях с искусственным кровообращением для уменьшения задержки жидкости в организме (Тринус, 1988; Машковский, 1997).
Полисахариды.
Полисахариды являются наиболее изученными и широко применяемыми метаболитами водорослей (Лоенко и др., 1991; Подкорытова и др., 1996; Clare, 1993; Nagumoto et al., 1996; Kuda et al., 1998). Они находят применение и в различных сферах пищевого производства (Подкорытова и др., 1994; Способ приготовления..., 1994; Arazaki et al., 1983; Nisizawa, 1987; Tramier, 1991) , медицинской и фармацевтической промышленности (Foster et al., 1990; Vrecer et al., 1994; Schaeffer et al., 2000), при приготовлении кормовых смесей и концентратов в животноводстве (Некрасова и др., 1997; Indergaard, Minsaas, 1991). Водорослевые полисахариды обладают широким спектром биологической активности и оказывают противовирусное действие, антилипемический и антикоагулянтный эффект, антисекреторное действие, предотвращают язвенное поражение желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), обладают гемостатическим действием, сорбируют соли тяжелых металлов и радионуклиды, проявляют противоопухолевый и антимутагенный эффекты. (Ажгихин, 1980; Добродеева и др., 1996; Воскобойников и др., 1998; Изучение и применение..., 2000; Indergaard, Ostgaard, 1991; Itoh et al, 1993; Hajela et al., 1996; Xue et al., 2001).
Наиболее интересными полисахаридами бурых водорослей с точки зрения медицины являются альгиновая кислота и её соли, фукоидан и ламинаран.
Альгиновая кислота и ее соли. Спектр применения альгинатов в фармации очень широк: они применяются в производстве безжирных смазывающих желеобразных веществ (Подкорытова, Кушева и др., 1998) , как связующее вещество при изготовлении таблеток, гранул, пилюль, как стабилизатор и эмульгатор мазевых основ, суппозиториев (Ясницкий и др., 1979; Indergaard, Ostgaard, 1991; Vrecer et al., 1994), в стоматологической практике при изготовления слепков и составов для лечения кариеса и парадонтоза (Воскобойников и др., 1998; Ertesvag et al., 1998), как лекарственное вещество при лечении заболеваний ЖКТ (Подкорытова и др., 1998; Boren et al, 1993), для лечения ран и ожогов, как шовные и перевязочные материалы (Никаноров и др., 1996; Первушкин и др., 1998)
Соли альгиновой кислоты являются наиболее сильными сорбентами в отношении радионуклидов, солей тяжелых металлов и жирных кислот (Воскобойников, 1998; Fourestet al., 1997; Williams et al., 1998). Альгинаты, включенные в пищевой рацион, не теряют свойств радиопротекторов, снижают уровень холестерина и триглицеридов в крови, обладают регенерирующей способностью (Френкель и др., 1995; Игнатова и др., 1999; Биопрепараты..., 2000; Nagumoto et al., 1996).
В нашей стране Архангельским опытно-промышленным водорослевым комбинатом (АОВК) выпускаются альгинаты, разрешенные Минздравом России к применению в лечебно-профилактических целях (Добродеева и др., 1996): альгиновая кислота, альгинат калия, альгинат магния, альгинат кальция.
Фукоидан обладает биологической активностью, связанной со способностью этого полисахарида модифицировать свойства клеточной поверхности (Усов и др., 2001). Считается, что фукоидан может найти применение при разработке новых медицинских препаратов иммуномодулирующего, противовирусного, противовоспалительного, противоопухолевого, контрацептивного и антикоагулянтного действия (Запорожец и др., 1995; Изучение и применение..., 2000; Itoh et al., 1993; Nagumoto et al., 1996; Millet et al., 1999; Thorlacius et al., 2000; Xue et al., 2001).
Исследованы иммунологические свойства фукоидана. Российскими специалистами предложен способ лечения и профилактики бронхо-легочных заболеваний (Дробышев, 1997) путем введения в рацион питания пациентов водорослей вида Fucus vesiculosus, одно из основных биологически активных веществ которого - фукоидан. Также курс лечения включает ингаляции водными отварами этих водорослей и вдыхание из воздуха испарений, образованных воздушно - сухими водорослями при комнатной температуре. Этот метод повышает эффективность лечения, сокращая его срок, а также уменьшает общее количество фармакологических средств, применяемых в процессе лечения.
Иммунотропными свойствами обладают водные растворы высокосульфатированного а -L-фукана, выделенного из водорослей L. cichorioides, с концентрацией 0,5-0,7 мг/мл. Уменьшение содержания сульфата с 36% до 9% не вызвало снижения иммуномодулирующего эффекта растворов фукоидана (Zvyagintseva et al., 2000).
Изучается также противоопухолевая активность фукоидана. Так, например, сотрудниками кафедры фармакологии одного из японских медицинских университетов (г. Токио) (Itoh et al., 1993; Itoh et al., 1995) исследованы антиопухолевая активность и иммунологические свойства фукоидана, выделенного из саргассовых водорослей. В результате проведенных экспериментов показано, что фукоидан обладает ярко выраженной антиопухолевой активностью, которая связана с повышением иммунного ответа организма на его введение.
Проводятся исследования о возможном влиянии водорослевых полисахаридов, в частности фукоидана, на бактериальную флору и функции желудочно-кишечного тракта (Fujii et al., 1992; Kuda et el., 1998). В результате экспериментов показано, что фукоидан обладает послабляющим эффектом и оказывает позитивное воздействие на кишечную флору.
Фукоидан применяют для профилактики и лечения СПИДа и СПИД-ассоциированных заболеваний. (Быковский и др., 1994; Beress et al., 1993; Schaeffer et al., 2000). Фукоидан, выделенный из водорослей F. vesiculosus, и коммерческий фукоидан (Sigma), до начала эксперимента были очищены с помощью колоночной хроматографии и лиофильно высушены (Beress et al., 1993). Полученные вещества были протестированы на наличие СПИД-ингибирующей активности. Было показано, что оба исследуемых препарата не проявляют цитотоксичных свойств и эффективно ингибируют формирование вируса СПИДа.
В настоящее время проводится широкое исследование антикоагулятных свойств фукоидана (Розкин и др., 1991; Colliec et al.,1991; Nishino et al., 1991; Mauray et al., 1995; Giraux et al., 1998; Chevolot et al., 1999; Boissonvidal et al., 2000; Chevolot et al., 2001), в результате которого установлено, что фукоидан влияет на реологию крови, подобно гепарину.
Ламинаран. Ламинаран является эффективным иммуностимулятором растений и животных, проявляет антилипемическйй эффект, не влияет на время свертывания крови, оказывает ингибирующее действие на рост и развитие многих вирусов (Лоенко и др., 1991; Биопрепараты..., 2000; Аминина и др., 2003; Larripa et al., 1987; Mayer et al., 1987; Clare, 1993; Harada et al., 1997). Изучено влияние ламинарана и альгиновой кислоты на кишечную микрофлору и рН, количество общего азота, фекальную массу и массу тела у крыс (Fujii et al., 1992; Kuda et al., 1998). В случае потребления 10% раствора ламинарана общее количество жизнеспособных бактерий увеличивалось, и значение рН кишечника снижалось. С другой стороны, при назначении диеты, содержащей 10% раствор альгиновой кислоты, общее количество жизнеспособных бактерий уменьшалось, фекальная масса увеличивалася. Количество общего азота возрастало с увеличением дозы альгиновой кислоты. Результаты экспериментов показывают, что употребление полисахаридов бурых водорослей позволяет регулировать значение рН кишечника, а также количественные характеристики кишечной флоры.
Выбор экстрагента и метода экстрагирования
Из литературных данных (Усов и др., 1994; Макарова и др., 1995; Звягинцева и др., 1999; Black et al., 1952) известно, что для получения фукоидана используют следующие экстрагенты: вода, разбавленные кислоты (чаще всего ОД н раствор НО), раствор хлористого кальция в концентрации 2-4%, этиловый спирт в концентрациях до 50%. Для разработки эффективного способа получения фукоидансодержащего экстракта, было изучено содержание фукоидана в вытяжках при экстрагировании следующими экстрагентами: водой очищенной, 0,1 н раствором НС1, 2% раствором СаСЬ, и этанола с концентрациями 10%, 20%, 30%, 40%. Сырье экстрагировали методом мацерации с перемешиванием при комнатной температуре и при нагревании, а также методом перколяции. В качестве сырья использовали шрот водорослей фукуса пузырчатого, оставшегося после получения ГЭФП и маннита. Технологические и физико-химические показатели шрота были исследованы. Установлено, что шрот содержит те же количества фукоидана и альгиновой кислоты, что и первоначальное сырье, имеет удовлетворительное значение насыпной массы, и может быть использован для получения данных полисахаридов (табл. З.З.1.1.).
Получение вытяжек методом двухступенчатой мацерации проводили следующим образом: 50 г водорослевого шрота смачивали экстрагентом, помещали в колбу вместимостью 1 л, приливали экстрагент (гидромодуль 1:12). Перемешивали содержимое колбы на магнитной мешалке в течение 12 ч при температуре 18±2С. Полученное на 1-ой ступени извлечение отфильтровывали через 3 слоя марли, шрот снова помещали в колбу и экстрагировали еще раз экстрагентом (гидромодуль 1:8) в течение 12 ч при тех же условиях. По окончании процесса вытяжку фильтровали через 3 слоя марли, объединяли с извлечением 1-ой ступени. Объединенную вытяжку фильтровали через бумажный фильтр на нутч-фильтре и определяли содержание фукоидана, альгиновой кислоты и сумму экстрактивных веществ. Результаты определений представлены на рисунке 3.3.1.1.
Технологический выход фукоидана в вытяжки, полученные методом мацерации, оценивали относительно содержания этого полисахарида в сырье. Выход фукоидана составил
при экстрагировании ОД н раствором соляной кислоты - 25,34±1,12%;
при экстрагировании 2% раствором хлорида кальция - 13,45±1,12%;
при экстрагировании водой очищенной - 15,15±0,56%;
при экстрагировании 10% этанолом - 21,26±0,89%;
при экстрагировании 20% этанолом - 17,64±0,82%;
при экстрагировании 30% этанолом - 12,16±0,41%; при экстрагировании 40% этанолом - 9,66±0,69%.
В таблице 3.3.1.2. представлены метрологические характеристики результатов определения выхода фукоидана в % к абс. сух. масс, сырья.
Согласно полученным данным наиболее эффективным экстрагентом для выделения фукоидана методом мацерации является ОД н раствор соляной кислоты (технологический выход 24-25%). При этом наблюдается переход в вытяжку значительного количества экстрактивных веществ (15-16%), а также альгиновой кислоты (2-3%). Экстрагирование шрота 10% этанолом данным методом приводит к получению вытяжки с меньшим выходом фукоидана (20-21%) и одновременно с меньшим содержанием экстрактивных веществ (10-11%) и альгиновой кислоты (1-2%).
Экстрагирование методом перколяции осуществляли по следующей методике: 50 г водорослевого шрота смачивали экстрагентом, послойно загружали в перколятор, заливали экстрагентом до образования «зеркала», прижимали грузом и настаивали 24 ч. Затем проводили вытеснение вытяжки путем подачи чистого экстрагента сверху, слив концентрированной вытяжки -снизу, при этом создается разность концентраций, которая является движущей силой процесса массопереноса (Настойки..., 2001). Скорость перколяции составляла 180 мл/ч. Процесс вели до получения вытяжки объемом 500 мл. Извлечения фильтровали через бумажный фильтр на нутч-фильтре и определяли концентрацию фукоидана, альгиновой кислоты и суммы экстрактивных веществ (Рис. 3.3.1.2.)
Количество фукоидана в извлечениях, полученные методом перколяции, относительно содержания полисахарида в сырье, составил
при экстрагировании 0,1 н раствором соляной кислоты - 40,22±0,79%;
при экстрагировании 2% раствором хлорида кальция - 19,51±0,93%;
при экстрагировании водой - 34,53±0,87%;
при экстрагировании 10% этанолом - 42,40±0,69%;
при экстрагировании 20% этанолом - 28,52±0,97%;
при экстрагировании 30% этанолом - 15,06±0,49%;
при экстрагировании 40% этанолом - 12,46±0,91%.
В таблице 3.3.1.3. представлены метрологические характеристики результатов определения выхода фукоидана.
Анализируя полученные данные, можно сделать вывод: более высокие значения концентраций и выходов фукоидана в вытяжках получены при использовании метода перколяции. Экстракция водными растворами соляной кислоты и хлористого кальция, а также водой очищенной помимо невысоких выходов, приводит к увеличению содержания суммы экстрактивных веществ, что в свою очередь приведет к повышению количества балластных веществ в экстракте. Кроме того, извлечение данными экстрагентами альгиновой кислоты нежелательно ввиду дальнейшего выделения альгината натрия в ходе комплексной переработки фукуса.
Исследование сорбционной способности сухого экстракта фукуса пузырчатого
Многочисленными исследованиями подтверждена высокая сорбционная активность растительных полисахаридов - пектинов различного происхождения (яблочный пектин, свекловичный пектин, зоостерин, выделенный из морских трав семейства Zoosteraceae), растительных слизей (кислых арабино-3,6-галактанов), каррагинанов - полисахаридов красных морских водорослей, альгинатов морских бурых водорослей (Ермак и др., 1997; Воскобойников и др., 1998; Оводов, 1998).
Оценка сорбционной активности экстрактов, содержащих фукоидан, проводилась рядом исследователей (Норре et al., 1979; Макарова и др., 1995; Василенко и др., 2003). Поэтому представляется целесообразным провести изучение СЭФП в этом направлении. Была изучена сорбционная способность СЭФП по отношению к метиленовому синему и к метаболитам (альбумину, глюкозе, креатинину, мочевине).
Краситель метиленовый синий, имитирующий среднемолекулярные токсиканты, принят в качестве маркера для большинства медицинских сорбентов (угли активированные, лигнины, углерод-минеральные сорбенты) (Беляков, 1991). Альбумин применяют для оценки белоксвязывающей активности, обусловливающую детоксицирующую сорбцию патологических агентов белковой природы (микроорганизмы и их токсины) (Воронин и др., 1999). Метаболиты - глюкоза, креатинин и мочевина, образуются в избыточных количествах в процессе некоторых заболеваний организма (сахарный диабет, почечная и печеночная недостаточность и др.), и существует необходимость в выведении их из организма (Беляков и др., 1997).
Сорбционную способность сухого экстракта определяли по метиленовому синему согласно общепринятой методике (Руководство..., 2000) с помощью спектрофотометрии следующим образом:
Около 0,1 г сорбента, предварительно высушенного по ГОСТ 12597-67, взвешивали с погрешностью не более 0,001 г. Навеску сорбента помещали в коническую колбу на 50 мл, добавляли 25 мл раствора метиленового синего (в концентрации 0,15%), закрывали пробкой и взбалтывали на аппарате для встряхивания в течение 20 мин. Затем суспензию сорбента переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 15 мин при 5000 об/мин. Осторожно отбирали пипеткой 5 мл осветленного раствора и определяли его оптическую плотность на спектрофотометре при 664 нм относительно контроля - воды очищенной.
Параллельно измеряли оптическую плотность 0,15% раствора метиленового синего. Сорбционную активность сорбента по метиленовому синему (X) в мг/г вычисляли по формуле:
х= (Д0-Д)-д-0,025 D0-m-Q—0,01-W) где: Do -оптическая плотность исходного раствора красителя;
Di -оптическая плотность раствора красителя после встряхивания с сорбентом;
а - концентрация раствора метиленового синего, мг/л;
т - масса навески сорбента, г;
W- влажность препарата, %;
0,025 - объем раствора метиленового синего, взятого для осветления, л.
За результат принимали среднее арифметическое двух параллельных определений. Допустимые расхождения между ними не должны превышать 10 мг/г.
Определение сорбционной емкости по биохимическому компоненту проводили следующим способом:
В плоскодонных мерных колбах объемом 100 мл готовили водные растворы следующих компонентов с концентрациями: альбумин - 50 мг/л, глюкоза - 9 мг/л, мочевина - 3 мг/л, креатинин 0,3 мг/л.
Навеску сорбента 0,1 г (с точностью 0,001 г) помещали в стеклянные центрифужные пробирки, вносили по 10 мл соответствующего компонента (альбумина, глюкозы, мочевины, креатинина), тщательно перемешивали.
Пробирки выдерживали при комнатной температуре 3 часа при периодическом встряхивании.
Через 3 часа из пробирок отбирали по 0,5 мл раствора компонента с сорбентом, добавляли 0,5 мл физиологического раствора и проводили оценку сорбционной емкости на анализаторе ШТАСШ (Япония, сделано по лицензии фирмы «ROCHE», Франция). В качестве контроля использовали растворы компонентов без сорбента в количестве 0,5 мл, с добавлением 0,5 мл физиологического раствора). Расчет производился по формуле:
С = (С,-С2)-У2 1000 т
где: С - сорбционная емкость, (мг/г);
С\ -концентрация введенного компонента, мг/л;
С2 - концентрация оставшегося компонента, мг/л;
v - объем рабочего раствора, (мл);
2 - коэффициент разведения;
т - масса навески, г.
Параллельно проведено определение адсорбционной активности пектина яблочного модифицированного.
Результаты оценки сорбционной способности фукоидансодержащего экстракта, а также литературные данные (Решетников, 2003) представлены нарис. 4.3.1.
Анализируя полученные данные, можно сказать, что сухой экстракт фукуса пузырчатого обладает более низкими значениями сорбционной активности, чем препарат сравнения пектин яблочный, но достаточно высокими по сравнению с другими энтеросорбентами, такими как лигнин, Полисорб, МКЦ-102. Сорбционная способность экстракта фукуса пузырчатого по своим значениям приближается к активности лигнина гидролизного. Таким образом, сухой экстракт фукуса пузырчатого может быть рекомендован для дальнейшего изучения как энтеросорбент.
Оптимизация процесса гранулирования сухого экстракта фукуса пузырчатого
Гранулирование лекарственных веществ осуществляется для улучшения их технологических характеристик, сам процесс грануляции определяется рядом технологических факторов (Вилесов, 1976). Для установления оптимальных условий грануляции был применен метод математического планирования эксперимента по Боксу-Уилсону с использованием !Л реплики от полного факторного эксперимента (Адлер и др., 1976; Саутин и др., 1978; Драйпер и др., 1987).
Большое значение при математическом планировании процесса гранулирования имеет выбор критериев оптимизации, факторов и интервалов их варьирования. В качестве критериев оптимизации выбраны насыпная масса (Yi), фракционный состав (Уг), сыпучесть с предварительной вибрацией (Уз) и естественная сыпучесть (УД поскольку эти параметры напрямую влияют на качество гранул, наполняющих капсулы.
Оптимизация по критерию Yi выбрана для достижения максимального значения насыпной массы с целью обеспечения равномерности дозирования сухого экстракта, кроме того, насыпная масса определяет выбор размера (объема) капсул; чем меньше размер капсул, тем легче пациенту применять препарат, легче проглатывать.
Второй критерий оптимизации Y2 выбран с целью минимизации количества пылевидной фракции в смеси и получения максимально возможного выхода частиц размером от 0,25 мм до 1,00 мм, так как монодисперсность фракционного состава оказывает положительное влияние на насыпную массу, следовательно, на однородность дозирования лекарственного вещества.
Проведение оптимизации по критериям Уз и Y4 (сыпучесть с предварительной вибрацией и естественная сыпучесть) мы посчитали целесообразной, поскольку от сыпучести гранулята зависит время заполнения капсул, что, в свою очередь, влияет на производительность установки по заполнению капсул, эффективность используемого оборудования. Нахождение отличий между значениями естественной сыпучести и сыпучести с предварительной вибрацией позволит определить тип насыпного бункера.
Из множества факторов, влияющих на процесс грануляции и качество гранул, выбраны следующие:
XI - количество наполнителя (лактозы), вводимого в состав гранул для уменьшения гигроскопичности СЭФП, а также для создания необходимой массы капсул.
Х2 - количество увлажнителя или гранулирующего агента (в нашем случае воды, так как экстракт в ней хорошо растворим), от которого зависит фракционный состав и прочность гранул.
ХЗ - количество опудривающего компонента (стеарата кальция), так как его наличие улучшает сыпучесть.
Х4 - размер частиц Dcp, мм (размер отверстий гранулирующей сетки), который определяет фракционный состав гранул.
Х5 - остаточная влажность гранулята, оказывающая влияние на сыпучесть, насыпную массу и фракционный состав.
Интервалы варьирования выбраны на основании экспериментальных данных (таблица 5.1.З.1.). Для реализации опытов был взят экстракт фукуса пузырчатого в количестве 10 г (содержание СЭФП в одной капсуле 0,2 г).
Уравнение регрессии [5.1.3.1] показывает, что наибольшее влияние на насыпную массу оказывает размер частиц (размер отверстий гранулирующего сита) (степень влияния фактора 37,83%, bi4=-82,3), количество наполнителя (степень влияния фактора 26,62%, Ьц=-69,1), количество увлажнителя (степень влияния фактора 17,01%, bi2=55,2), и остаточная влажность гранулята (степень влияния фактора 9,17%, bi5=-40,5). Количество опудривающего компонента не оказывает существенное влияние на данный технологический показатель (фактор незначим). Анализ уравнения [5.1.3.1] позволяет выявить следующие закономерности: насыпная масса увеличивается с уменьшением размера частиц гранулята, поскольку происходит более плотная укладка частиц относительно друг друга. Уменьшение количества наполнителя также положительно влияет на увеличение насыпной массы, что вероятно связано с образованием частиц высокой плотности, имеющих меньшую пористость.
Количество вносимого в процессе грануляции увлажнителя (воды) необходимо увеличивать, что способствует образованию более прочных гранул с меньшим образованием пылевидной фракции. Получение гранул оптимального фракционного состава приводит к увеличению насыпной массы гранулята.
Сушка гранул является одной из заключительных стадий их производства и снижение остаточной влажности гранул препятствует образованию крупных частиц, что способствует улучшению их сыпучести и фракционного состава, и тем самым увеличивает насыпную массу.
Анализ уравнения [5.1.3.2] свидетельствует о зависимости гранулометрического состава гранулята от количества опудривающего компонента (степень влияния фактора 57,60%, Ь2з=6,41), от размера частиц (степень влияния фактора 32,86%, 024=4,84), от остаточной влажности гранулята (степень влияния фактора 7,62%, Ь25=-2,32), а также от количества наполнителя (степень влияния фактора 1,75%, b2i=l,14). Количество увлажнителя в выбранном диапазоне не оказывает заметного влияния на фракционный состав (фактор не значим). Увеличение опудривающего вещества будет способствовать возрастанию доли мелких фракций гранулята. Для получения монодисперсного гранулометрического состава требуется увеличение количества вносимого наполнителя, так как в этом случае происходит образование гранул приблизительно одного размера за счет технологических свойств лактозы, имеющей кристаллы равноосной формы. Размер отверстий гранулирующих сит необходимо увеличивать с целью снижения количества пылевидной фракции. Уменьшение значения остаточной влажности гранулята приводит к уменьшению образования крупных гранул, что согласно уравнению [5.1.3.1], способствует достижению оптимального фракционного состава.
Уравнения [5.1.3.3] и [5.1.3.4] показывают, что на сыпучесть (естественную и с вибрацией) влияют количество опудривающего компонента (степень влияния фактора Хз 38,67% и 41,75% соответственно) и увлажнителя (степень влияния фактора Хг 37,08% и 35,13% соответственно), остальные факторы не значимы. Тот факт, что количество антифрикционного вещества увеличивает сыпучесть давно установлено (Ажгихин, 1975). Снижение количества гранулирующего агента в процессе грануляции приводит к получению более мелких гранул, имеющих лучшую сыпучесть.
Все полученные уравнения регрессии [5.1.3.1-5.1.3.4] адекватны реальному процессу по критерию Фишера (см. таблицу 5.1.З.4.).
Обобщая результаты по оценке влияния факторов на технологические характеристики гранул СЭФП можно сделать следующие выводы: количество наполнителя (лактозы) следует уменьшать, что приведёт к увеличению насыпной массы [5.1.3.1], что в свою очередь позволит уменьшить размер капсул. Введение в состав лекарственных средств как можно меньшего количества вспомогательных веществ позволяет уменьшить массу принимаемого пациентом препарата (капсулы или таблетки). Кроме того, большое содержание наполнителя может снизить биодоступность лекарственного вещества (Белоусов и др., 1980; Тенцова, 1981).
Количество увлажнителя необходимо уменьшать, поскольку таким способом можно существенно увеличить сыпучесть гранулята за счет уменьшения размера гранул [5.1.3.3-5.1.3.4], при снижении значения этого фактора (Хг) происходит улучшение прохождения влажной массы через гранулятор, снижаются технологические потери, и уменьшается время сушки гранул.
Увеличение содержания опудривающего вещества приводит к оптимизации всех выбранных критериев [5.1.3.1-5.1.3.4]. Размер отверстий гранулирующих сит мы считаем целесообразным выбрать в значении 0,50 мм, так как наибольшей сыпучестью обладают гранулы размером 0,2-0,6 мм. Остаточную влажность гранулята требуется уменьшать, что не только положительно влияет на насыпную массу гранул, но и диктуется высокой гигроскопичностью СЭФП.
В условиях адекватности (по критерию Фишера) уравнения регрессии реальному процессу проведено крутое восхождение для критерия оптимизации У1 (насыпная масса). Процедуру крутого восхождения проводили по градиенту фактора XI; фактор Х2 зафиксировали на основном уровне, поскольку влияние данного фактора на критерии оптимизации не однозначно; фактор Х4 зафиксировали на нижнем уровне (0,50 мм) по вышеуказанным причинам; фактор Х5 зафиксировали на нижнем уровне, так как снижение данного фактора оказывало положительное влияние как на насыпную массу, так и на фракционный состав гранулята. Выше было отмечено, что СЭФП высоко гигроскопичен, что также диктует необходимость уменьшения остаточной влажности гранул. Режим проведения процедуры крутого восхождения и результаты представлены в таблице 5.3.1.5.
