Содержание к диссертации
Введение
1. Отходы кожевенного производства: пути использования и перспективы эффективной переработки
1.1. Основные группы отходов и продукты их переработки 9
1.2. Архитектоника фибриллярного коллагена и связи, стабилизирующие его структуру 12
1.3. Молекулярное строение коллагена 19
1.4. Способы получения продуктов растворения коллагена из отходов кожевенного производства 25
1.5. Основные направления использования золей коллагена 29
2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования 37
2.2. Методы исследования 38
2.2.1. Исследование показателей химического состава 38
2.2.2. Определение рН золя коллагена 38
2.2.3. Определение степени микробной загрязненности гольевой спилковой обрези шкур крупного рогатого скота и золей коллагена методом посева на плотных питательных средах и подсчета КМАФАнМ 38
2.2.4. Определение теплофизических параметров структурной стабильности гольевой спилковой обрези шкур крупного рогатого скота...39
2.2.5. Исследование агрегативной устойчивости золя коллагена методом поточной ультрамикроскопии 39
2.2.6. Определение весомости свойств и отдельных показателей качества экспертным методом 40
2.2.7. Статистическая обработка результатов эксперимента 40
3. Характеристика гольевой спилковои обрези шкур крупного рогатого скота как исходного сырья для наработки золей коллагена
3.1. Оценка санитарно-гигиенической безопасности гольевой спилковои обрези шкур крупного рогатого скота по показателю микробиологической чистоты 41
3.2. Химический состав гольевой спилковои обрези шкур крупного рогатого скота 42
3.3. Характеристика теплофизических свойств гольевой спилковои обрези шкур крупного рогатого скота как исходного сырья для получения золей коллагена 43
4. Влияние пероксидно-щелочных воздействий на свойства гольевой спилковои обрези шкур крупного рогатого скота в процессе получения золей коллагена
4.1. Разработка новых технологических подходов к получению высокоочищенных золей коллагена 53
4.2. Сравнительная оценка влияния пероксидно-щелочных и щелочно-солевых композиций на показатели структурной стабильности гольевой спилковои обрези шкур крупного рогатого скота 66
5. Оценка качества коллазоля
5.1. Оценка санитарно-гигиенической безопасности коллазоля по показателю микробиологической чистоты 72
5.2. Оценка химической чистоты полученного золя коллагена 73
5.3. Дисперсность и агрегативная стабильность частиц коллазоля, полученного пероксидно-щелочным методом 74
5.4. Оценка качества коллагенсодержащих отходов и получаемых из них золей коллагена 80
Выводы 89
Список использованной литературы 91
Приложения
- Архитектоника фибриллярного коллагена и связи, стабилизирующие его структуру
- Определение степени микробной загрязненности гольевой спилковой обрези шкур крупного рогатого скота и золей коллагена методом посева на плотных питательных средах и подсчета КМАФАнМ
- Химический состав гольевой спилковои обрези шкур крупного рогатого скота
- Сравнительная оценка влияния пероксидно-щелочных и щелочно-солевых композиций на показатели структурной стабильности гольевой спилковои обрези шкур крупного рогатого скота
Введение к работе
Актуальность проблемы. Промышленная переработка сырья животного происхождения в кожевенно-обувном производстве, даже при использовании современных малоотходных технологий, неизбежно связана с образованием производственных белоксодержащих отходов, в том числе и недубленых.
Ранее такие отходы чаще всего перерабатывали в гидролизаты и использовали для производства желатина, кормовых добавок, клеев, биоминеральных удобрений, строительных материалов.
В последние годы благодаря всесторонним исследованиям, направленным на изучение такой многокомпонентной и многофункциональной системы как соединительная ткань, была предложена концепция более полной и рациональной переработки коллагенсодержащих отходов.
Над решением данной проблемы активно работали такие известные ученые как И.С. Шестакова, Е.В.Минкин, О.О. Баблоян, С.А. Каспарьянц, Л.П. Истранов, И.М. Гордиенко, А.И. Сапожникова, В.И. Хачиянц, M.Chvapil, G. Reich, P.P.Fietzek, K.Kuhn, W.Friess и др.
Прогресс в данном направлении стал возможен благодаря разработке научно-обоснованных методов выделения нативного коллагена из соединительной ткани, позволяющих сохранить молекулярную структуру и биологическую активность этого белка при максимальном уровне его очистки от сопутствующих биополимеров. Все это значительно расширило возможности применения коллагенсодержащих отходов. Так, например, гольевую спилко-вую обрезь шкур крупного рогатого скота, как один из основных видов белоксодержащих отходов, перерабатывающие предприятия в настоящее время стали активно использовать в качестве сырья для получения растворимых форм коллагена, применяемых в ветеринарии, медицине, косметике и пищевой промышленности, что позволило создать ряд принципиально новых препаратов и биоматериалов.
Из вышесказанного следует, что коллагенсодержащие отходы стали представлять ценность как сырье для перерабатывающих предприятий, т.е. приобрели потребительную стоимость и статус промышленного товара. То же можно сказать и о растворимых формах коллагена, получаемых из указанных отходов.
Такого рода товары, несмотря на пока еще высокую стоимость, пользуются большим спросом, хотя ассортимент их невелик, а к качеству предъявляются достаточно жесткие требования.
В виду того, что коллагенсодержащие отходы и получаемый из них коллаген обладают определенными свойствами, обуславливающими их ценность, как для производителей, так и для потребителей данной товарной продукции, исследование этих свойств и их изменений на этапах заготовки, технологической переработки и последующего использования является весьма актуальным.
Цель и задачи исследования.
Цель работы - предложить критерии оценки качества недубленых бе-локсодержащих отходов кожевенного производства и получаемых из них золей коллагена на основе комплексного изучения их свойств.
При этом необходимо было решить следующие задачи:
на примере гольевой спилковой обрези (ГСО) шкур крупного рогатого скота определить значения показателей, характеризующих химический состав и архитектонику белоксодержащих отходов с точки зрения целесообразности использования их как исходного сырья для получения золей коллагена;
изучить влияние различных способов консервирования и режимов хранения на показатели теплофизических свойств ГСО;
проанализировать влияние пероксидно-щелочных воздействий на показатели химического состава и структурной стабильности ГСО;
предложить и обосновать новые технические решения, позволяющие
эффективно перерабатывать недубленые коллагенсодержащие отходы в золь коллагена, сохраняющий свойства нативного коллагена;
-дать оценку качества исходного сырья и полученного коллагенового золя по комплексу физико-химических и биологических показателей;
-предложить номенклатуру показателей качества и экспериментально установить значения показателей качества, характеризующие свойства коллагенсодержащих отходов и получаемых из них золей коллагена.
Научная новизна:
на основе комплексного изучения химического состава и его изменений под влиянием различных технологических факторов обоснована целесообразность использования коллагенсодержащих отходов как сырья для получения золей коллагена, обладающих потребительной ценностью для предприятий фармацевтического и биотехнологического профиля;
дана оценка теплофизических свойств коллагенсодержащих отходов, отвечающих за структурную стабильность коллагена на тканевом уровне;
установлено влияние различных способов консервирования и режимов хранения на свойства коллагенсодержащих отходов;
изучено влияние пероксидно-щелочной и щелочно-солевой композиций на структурную стабильность коллагенсодержащих отходов;
разработан и запатентован пероксидно-щелочной способ выделения коллагена из отходов животного сырья, концентрации реагентов и режимы которого позволяют получать золь коллагена, по качеству не уступающий продукту, получаемому стандартным щелочно-солевым методом;
разработана номенклатура показателей качества и установлены их значения, как для коллагенсодержащих отходов, так и для получаемых из них золей коллагена.
Практическая значимость работы. Проведенные исследования и полученные результаты позволили:
- расширить ассортимент источников сырья, используемых для нара-
ботки растворимых форм коллагена фармацевтического, ветеринарного и косметического назначения за счет использования ГСО, занимающей значительный удельный вес в общем объеме недубленых отходов кожевенного производства;
-обосновать целесообразность замены традиционного щелочно-солевого способа получения растворимых форм коллагена пероксидно-щелочным способом, позволяющим уменьшить концентрации используемых реагентов, не снижая качества конечного продукта;
-разработать номенклатуру показателей качества коллагенсодержащих отходов и получаемых на их основе золей коллагена;
-разработать проект ТУ на золь коллагена, полученный пероксидно-щелочным методом.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертации представлены и обсуждены на Межвузовской научно-технической конференции РосЗИТЛП «Современные проблемы текстильной и легкой промышленности», 1998 г.; XI, XII, XIII, XVI и XVIII Международных Плехановских чтениях 1998,1999, 2000, 2003, 2005 г.г.; Международной конференции «Высокоэффективные технологии переработки отходов кожевенного производства», 2001г., Международной научно-практической и научно-методической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ и 60-летию факультета ТЭС, 2004 г.; Научно-практической конференции «Актуальные вопросы товароведения, технологии и оценки качества сырья и продуктов животного происхождения», посвященной 100-летию профессора Б.А.Кузнецова, 2006 г.
Публикации. По результатам исследований опубликованы 14 научных статей и получен 1 патент на изобретение.
Структура и объем работы. Работа изложена на ПО страницах машинописного текста, включает 17 таблиц, 16 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, содержащего 170 источников и приложений.
Архитектоника фибриллярного коллагена и связи, стабилизирующие его структуру
Основой практически всех видов белоксодержащих отходов кожевенного производства является плотная неоформленная соединительная ткань, а именно дерма, измененная в ходе начальных этапов технологического процесса. При отмоке происходит частичное вымывание растворимых глобулярных белков и эмульгированных жиров [77].
Последующее золение ведет к разрушению белков волоса, дальнейшему гидролитическому расщеплению неколлагеновых компонентов, удалению их и, тем самым, к разрыхлению структуры дермы [70, 72], основными элементами которой являются фибриллярные образования в виде пучков коллагеновых, эластиновых и ретикулиновых волокон. Практически все исследователи рассматривают волокна как высший, надмолекулярный уровень структурной организации коллагена [71, 141, 163].
Коллагеновое волокно как морфологическая единица считается гетерогенным образованием, содержащим кроме коллагена и другие химические компоненты [135,156]. Стабилизирующая функция коллагенового волокна обеспечивается за счет его необычных физико-химических и биологических свойств (устойчивость к действию физических и химических агентов и т.д.), которое оно приобретает, главным образом, в результате упорядоченной боковой и линейной агрегации молекул коллагена [87, 88].
Коллагеновое волокно состоит из фибрилл, покрытых аморфным «чехлом» из гликопротеинов и протеогликанов. При образовании коллагеновых волокон гликопротеины и протеогликаны входят в их состав, причем первые скрепляют между собой первичные агрегаты (протофибриллы), а вторые -фибриллы. Большинство современных исследователей считают, что фибрилла образуется путем соединения бок о бок первичных агрегатов молекул (фила-ментов, протофибрилл или микрофибрилл). Диаметр ее ограничивается, по всей видимости, протеогликановым «чехлом». Колебания ширины коллагеновых фибрилл обычно объясняют различной локальной концентрацией факторов, регулирующих рост фибрилл [73].
Характерной особенностью коллагеновых образований является формирование спирали буквально на всех уровнях организации, начиная с надмолекулярного: частое скручивание фибрилл в волокне и волокон в пучке, также филаментов и субфибрилл в фибрилле, спиральное скручивание молекул в первичном филаменте, трехцепочечная суперспираль молекулы коллагена и, наконец, спиральная полипептидная цепь [71,91].
Одним из важнейших принципов строения соединительной ткани на тканевом уровне организации является соответствие архитектоники функциональным особенностям ткани, прежде всего механической функции. Общепризнано, что главной причиной механических различий являются разные геометрические способы укладки волокон и пучков, т. е. архитектура тканей, а также характер взаимодействия коллагена и других компонентов [67,71,72]. В работах многих отечественных и зарубежных авторов [73, 169] неоднократно отмечался тот факт, что высокая прочность на разрыв, жесткость, малые величины относительных удлинений при растяжении и очень низкая растворимость тканей, архитектоника которых представлена в основном надмолекулярными коллагеновыми образованиями, свидетельствуют о наличии сложной многоуровневой сети поперечных связей различной химической природы на всех структурных уровнях коллагена.
Стабилизация структуры молекулы коллагена и коллагенового волокна в процессе фибриллогенеза осуществляется по типу, характерному для белков вообще, а также с помощью специфических для белков коллагеновой группы реакций, приводящих к образованию внутри- и межмолекулярных поперечных ковалентных связей [73, 109, 114]. Имеется большое количество работ, посвященных выяснению природы некоторых внутри- и межмолекулярных связей в коллагене [114, 152].
Имеющиеся в настоящее время экспериментальные данные позволяют четко дифференцировать реакции, протекающие при агрегации молекул коллагена (образование межмолекулярных связей), от реакций, стабилизирующих молекулярную структуру коллагена (образование внутримолекулярных связей) [49,55].
К связям, обеспечивающим стабильную конфигурацию молекул коллагена и их агрегатов, относятся нековалентные и ковалентные межцепьевые связи. Благодаря объективной информации о количестве и энергетическом спектре связей, скрепляющих структурные элементы тканей в единое целое, можно более обоснованно осуществлять целенаправленную наработку отдельных фибриллярных белков [130,136]. К нековалентным связям, в первую очередь, относятся вандерваальсо-вы силы ориентационного, индукционного и дисперсионного характера, имеющие заметную величину на расстояниях между структурными элементами порядка 0,1-1,0 нм. Энергия этих связей обычно не превышает 4 кДж/моль. Сюда же следует отнести водородные связи, которые образуются за счет положительно заряженного протона атома водорода и не общей пары электронов атома кислорода [114]. Водородные связи играют существенную роль в обеспечении структурной стабильности фибриллярных белков и содержащих их тканей. Исследователи особо отмечают роль межцепьевых связей типа -СО ... HN-, образуемых карбонильным кислородом и NH-группой пептидной связи [73].
Определение степени микробной загрязненности гольевой спилковой обрези шкур крупного рогатого скота и золей коллагена методом посева на плотных питательных средах и подсчета КМАФАнМ
Для оценки свойств исходного сырья, изменений, происходящих с ним в процессе различных обработок, а также определения некоторых показателей качества полученных материалов были использованы различные химические, физические, физико-механические методы исследования. Отбор проб, подготовку их к анализу проводили в соответствии с ГОСТ 4288-76[27]иГОСТ7269-79[28]. Исследование показателей химического состава: содержание влаги, минеральных и жировых веществ определяли по традиционным методикам химического анализа [29,30]; содержание коллагена по оксипролину определяли колориметрическим методом, основанным на цветной реакции продуктов его окисления с парадиметиламинобензоальдегидом [ 105]; содержание неколлагеновых белков по тирозину определяли колориметрическим методом [105]; расчет содержания биополимеров проводили по уравнениям прямой и обратной связи между значениями концентрации и оптической плотности мономеров. Изменение щелочности рабочих растворов в процессе обработки образцов ГСО пероксидно-щелочными растворами различной степени интенсивности исследовали методом кислотно-основного титрования.
В основе метода лежат реакции ионного обмена (реакции нейтрализации), с помощью которых определяют концентрацию кислот и оснований [23]. Содержание Н202 (пероксида водорода) в рабочих растворах определяли по методике, описанной в ГОСТ 177-88, заключающейся в титровании исследуемого раствора перманганатом калия [26]. Определение рН осуществляли потенциометрическим методом [23]. При потенциометрическом определении рН измеряли электродвижущую силу, возникающую на электродах при погружении их в исследуемый раствор и зависящую от концентрации в нем ионов водорода. В работе использовали рН-метр фирмы "Piccolo" со стеклянным электродом, обеспечивающим быстрое измерение с точностью, соответствующей 0,01—0,03 единицы рН. Анализ проводили в трех параллельных пробах. Определение теплофизических параметров структурной стабильности ГСО проводили при помощи измерительного термодеформационного комплекса [62, 63], позволяющего оценить энергетические условия, при которых происходят обратимые и необратимые термические изменения линейных размеров белка и термодеформационные характеристики исследуемых образцов. Концентрацию и размер коллоидных частиц в золе коллагена определяли методом поточной ультрамикроскопии [59, 60, 61], основанном на использовании способности отдельных коллоидных частиц, размеры которых много меньше длины волны света, рассеивать свет в соответствии с законами дифракции. Определение степени микробной загрязненности гольевой спилко-вой обрези шкур крупного рогатого скота и золей коллагена проводили методом посева на плотных питательных средах и определения КМА-ФАнМ [25]. Определение весомости свойств и отдельных показателей качества проводили экспертным методом [2].
Аналитическую обработку экспериментальных данных проводили на IBM - совместимом компьютере с помощью пакета программ Microsoft Office 2000 Professional, а также Statistika 7 по следующим показателям: среднее арифметическое значение, квадратическое отклонение, средняя квад-ратическая ошибка, относительная ошибка определения средней, оценка расхождения двух средних. Безопасность - важнейшее свойство качества, которым должны обладать все потребительские товары. В отличие от других потребительских свойств, ухудшение или утрата которых приводит к потерям функционального или социального назначения, превышение допустимого уровня показателей безопасности переводит продукцию в категорию опасной [74]. В связи с этим на первом этапе исследований был изучен такой показатель санитарно-гигиенической безопасности как микробиологическая загрязненность исходного сырья. Результаты посева вытяжки из образца ГСО на мясо-пептонный агар (МПА) представлены на рисунке 3. Согласно полученным данным в исследованных образцах общее микробное число составляет (6,8±0,4)»103 КОЕ/г, что отвечает требованиям Сан-Пин 2.3.2.1078-01, предъявляемым к пищевым продуктам (не более 104 КОЕ/г). Данный нормативный документ был выбран для того, чтобы заведомо ужесточить требования по безопасности к исходному сырью (ГСО). Как известно, что общее микробное число для шкур крупного рогатого скота составляет примерно 2 10 КОЕ/г. ГСО получают в результате золения шкур крупного рогатого скота. Высокие значения рН среды, характерные для данной технологической операции, подавляют жизнедеятельность микроорганизмов и их количество резко снижается. Полученные нами результаты подтверждают данные литературы о том, что общее микробное число для ГСО на несколько порядков ниже, чем для шкуры. Поскольку все свойства и, соответственно качество любого материала предопределяются его химическим составом, на первом этапе работы исследовали основные показатели химического состава ГСО. Как видно из таблицы 4, количество белковых веществ в сухом остатке обоих образцов превалирует над остальными компонентами. Процент содержания минеральных веществ в необеззоленной ГСО в несколько раз выше, чем в обеззоленной. Это обусловлено тем, что ГСО проходит операцию золения, во время которой в дерму проникают ионы кальция, увеличивая её минеральную часть, а процесс обеззоливания способствует их удалению. В связи с тем, что содержание белковых веществ было определено по общему азоту, и полученные результаты дают информацию о совокупном содержании коллагена и неколлагеновых белковых компонентов, образцы были проанализированы на количественное содержание в них коллагена. Из данных, представленных в таблице 4 следует, что содержание коллагена значительно превышает содержание неколлагеновых белков. Это дает основание считать эти виды отходов вполне приемлемыми в качестве сырья для производства золей коллагена.
Химический состав гольевой спилковои обрези шкур крупного рогатого скота
Недубленые белоксодержащие отходы кожевенного производства, в частности ГСО шкур крупного рогатого скота, представляет собой сетчатый слой дермы [45, 109]. Будучи разновидностью соединительной ткани, она по своей архитектонике является многокомпонентным образованием, гистост-руктурные элементы которого объединены в единое целое с помощью сложной многоуровневой системы связей различной природы [114, 129, 130].
В связи с тем, что данный вид отходов интересовал нас с точки зрения возможности их переработки в растворы коллагена, на первом этапе работы особое внимание было уделено такому комплексному показателю качества исходного сырья как его структурная стабильность. Именно от значения данного показателя во многом зависит выбор методических приемов физико-химического воздействия на объект исследования при планировании отдельных стадий технологического цикла наработки продуктов растворения коллагена.
Так как данный вид отходов представляет собой соединительную ткань, являющуюся сложной многоуровневой системой, объединенную в единое целое химическими связями различной природы, для того, чтобы целенаправленно нарабатывать продукты растворения коллагена, необходимо вначале с помощью определенных химических и физических воздействий провести деструкцию связей и максимально ослабить взаимодействие между основным компонентом и сопутствующими веществами именно на тканевом уровне.
Как правило, о стабильности структуры коллагена судят с помощью методов калориметрии, определения температуры сваривания и др.ЩЗ, 114, 116]. На наш взгляд, объективно оценить структурную стабильность исходного коллагенсодержащего сырья и получить более полную картину изменений, происходящих в структуре образцов, можно, основываясь на способности биополимеров под действием тепла изменять линейные и объемные размеры, агрегатные и фазовые состояния, а также механические свойства [63, 68,116].
Так как процесс получения коллагена предполагает накопление определенных производственных партий исходного сырья (золеная ГСО), было изучено влияние различных способов консервирования и сроков хранения на его структурную стабильность.
В ходе экспериментов сравнивали параметры структурной стабильности образцов золеной ГСО I и золеной ГСО II, подвергнутой криоконсерви-рованию при -10С в течение 1-й недели; обеззоленной ГСО III и обеззолен-ной ГСО, подвергнутой криоконсервированию IV при -10С и -30С в течение 1-й и 2-х недель, 1-ого и 3-х месяцев, а также засоленной золеной ГСО V и засоленной обеззоленной ГСО VI.
Для характеристики изменений структурной стабильности образцов использовали такие параметры как: температура начала гидротермического сокращения (Тнгс), температура сваривания (Тсв) или Тнгс при нулевой нагрузке, температура текучести (Тт), увеличение и сокращение первоначальной длины образца (А 1), энергия фазового перехода (АН).
Результаты исследований, характеризующих изменения образцов I, II, V под действием температуры при одинаковом значении внешнего механического напряжения представлены на рисунке 4. Из графиков, приведенных на рисунке 4, следует, что с увеличением температуры исследуемые образцы вначале незначительно удлиняются. Вероятнее всего, это происходит за счет упорядочивания и продольной ориентации структурных элементов в результате напряжения межмолекулярных связей в аморфных зонах фибриллярных белков.
Последующее медленное повышение температуры среды, в которой производится нагрев образца, приводит к усилению движения сегментов белковых структур.
По достижении температуры, называемой температурой начала гидротермического сокращения (Тнгс), начинается процесс ослабления межмолекулярного взаимодействия и необратимого разрушения межмолекулярных связей, в результате чего длина образца сокращается, т.к. белок из фибриллярного состояния стремится перейти в глобулообразное. Такое изменение фазового состояния обусловлено разрушением кристаллических зон в структуре фибриллярного белка. Это связано, как считают некоторые авторы [69, 92], с удалением адсорбционной влаги, сопровождающимся сближением молекул и, вследствие этого, некоторым нарастанием межмолекулярного взаимодействия. Перегиб на ТДК можно рассматривать как результат начала тепловой денатурации, ведущей к нарушению равновесия между структурирующими и глобулирующими силами макромолекул и обуславливающий переход типа «спираль-клубок». Естественно, этот процесс происходит как в кристаллических, так и аморфных зонах фибриллярных структур и носит кооперативный характер. Однако макромолекулы из менее ориентированных аморфных зон должны глобулироваться при более низких температурах, чем это имеет место для кристаллических зон, в результате чего наблюдается темпера-турно-временной интервал перехода из твердого состояния в вязко-текучее.
Процесс напряжения и разрыва межмолекулярных связей в образцах, ведущий к их сокращению, продолжается до достижения температуры текучести (Тт). Затем, образцы вновь начинают удлиняться, вероятно, за счет напряжения и последующего разрыва более прочных, продольно ориентированных ковалентных связей. Не исключено, что при температуре более высокой, чем температура текучести, происходит разрыв внутриспиральных связей. Энергия, необходимая для разрыва межмолекулярных поперечных связей различной природы и перевода образца в вязко-текучее состояние накапливается в нем постепенно по мере увеличения температуры образца и характеризуется энергией фазового перехода АН.
Сравнительная оценка влияния пероксидно-щелочных и щелочно-солевых композиций на показатели структурной стабильности гольевой спилковои обрези шкур крупного рогатого скота
В связи с тем, что дисперсии коллагена представляют интерес как основа или компонент при производстве препаратов медицинского, ветеринарного и косметического назначения существуют определенные требования к их качеству.
Качество конечного продукта напрямую зависит от способа получения ПРК и используемых при этом химических реагентов.
Как известно [1, 43, 80], процесс получения дисперсий коллагена состоит из двух основных стадий: очистка фибриллярного коллагена от сопутствующих биополимеров; растворение фибриллярного коллагена слабыми органическими кислотами.
Стадия получения полуфабриката в виде фибриллярного коллагена должна обеспечить не только высокую степень химической чистоты, но и иметь технологические параметры, удовлетворяющие требованиям эколо-гичности и экономичности. Особую роль здесь играет выбор химических реагентов их соотношений и концентраций.
В процессе очистки фибриллярного коллагена от сопутствующих биополимеров происходит разрыв межмолекулярных связей различной химической природы. В связи с этим возникает необходимость в изучении воздействия на структуру соединительной ткани различных химических композиций, используемых на стадии предварительной обработки. Нами была сделана попытка дать теоретическое обоснование выбора химических реагентов, вызывающих напряжение и разрыв связей в гольевой спилковой обрези.
Следует отметить, что эксперимент был спланирован таким образом, чтобы учесть влияние как химической составляющей работы по разрыву связей, так и механической. Для того чтобы выявить химическую работу (энергию) и сравнить тем самым интенсивность каждого вида обработки мы использовали одинаковые минимальные нагрузки при разных химических воздействиях.
В ходе эксперимента образцы ГСО подвергали обработке щелочно-солевой и пероксидно-щелочной композициями с заранее подобранными оптимальными концентрациями компонентов, позволяющими получить фибриллярный коллаген высокой степени чистоты.
Используя установку, описанную в работах [58, 62, 63, 65], в образцах, помещенных в щелочно-солевую и пероксидно-щелочную композиции, создавали внутреннее напряжение, воздействуя на них определенной нагрузкой. Для того чтобы исключить влияние температурного фактора на структурную стабильность образцов в отличие от ранее проводимых исследований [63, 68], опыты проводили при постоянной температуре. Полученные в ходе экспериментов данные регистрировали с помощью специальной приставки, подсоединенной к компьютеру, вносили в отдельный файл, после чего обрабатывали по специальной программе. Результаты выводили на монитор компьютера в виде графического и цифрового материала с последующей распечаткой (рисунок 12).
Как следует из представленного иллюстративного материала, графики, отражающие изменение архитектоники ГСО под влиянием щелочно-солевой и пероксидно-щелочной композиций имеют различный характер. Сочетание химического и силового воздействий приводит к изменению длины анализируемых образцов за счет напряжения и разрыва межмолекулярных связей.
Механизм действия щелочи заключается в нарушении и ослаблении некоторых водородных мостиков, частичном разрыве белково-углеводных мембран, окружающих пучки коллагеновых фибрилл. При щелочно-солевой обработке основное воздействие на образец оказывает механическое напряжение, причем величина относительного удлинения образца прямо пропорциональна прилагаемой к нему нагрузке. Также следует отметить, что чем выше нагрузка на образец, тем быстрее происходит максимальное напряжение межмолекулярных связей. Так при 0,9 Н длина образца максимально увеличивается через 30 часов, а при 2,4 Н - через 10 часов.
При воздействии на образец пероксидно-щелочной композиции деформационная кривая имеет иной характер при тех же нагрузках. Длина образца сразу начинает уменьшаться, что свидетельствует не только о напряжении, но и о начале разрыва межмолекулярных связей.
Так как пероксидно-щелочная композиция более агрессивна (реакци-онноспособна), на наш взгляд, в данном случае на процесс разрушения связей в большей степени влияет не величина нагрузки, а состав реакционной смеси, в которой находится образец.
Изменение длины образцов ГСО при минимальных и максимальных нагрузках одинаково, что позволяет предположить, что основную роль в разрушении связей играет состав реакционной смеси, представляющей собой сочетание щелочи и пероксида. Кооперативное воздействие гидроксида натрия и пероксида водорода способствует лучшему проникновению щелочи в структуру спилковой обре-зи (внутрь образца). Примерно через 10 часов процесс разрыва слабых связей стабилизируется.
Нажор, возникающий при щелочно-солевой обработке, происходит достаточно медленно - в течение 48 часов, так как процессы гидратации и электростатического отталкивания структурных элементов дермы, ведущие к напряжению связей, главным образом водородных, стабилизируются действием соли.
Сочетание щелочно-солевой обработки с внешней нагрузкой приводит к максимальному напряжению межструктурных связей за более короткий промежуток времени - примерно 20 часов. Причем чем выше нагрузка на образец, тем быстрее происходит максимальное напряжение межмолекулярных связей. Так при 0,9 Н - длина образца максимально увеличивается через 30 часов, а при 2,4 Н - через 10 часов.
Кооперативное воздействие гидроксида натрия и пероксида водорода способствуя лучшему проникновению щелочи в структуру спилковой обрези (внутрь образца), вызывает более глубокие структурные изменения за счет замены соли на пероксид водорода. Вышесказанное позволяет рассматривать пероксидно-щелочную композицию как более реакционно-активную смесь. По-видимому, процесс разрыва связей в данном случае в большей степени обусловлен кооперативным влиянием компонентов, составляющих композицию.
