Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 14
2.1 Краткая характеристика блютанга 14
2.1.1 Историческая справка 14
2.1.2 Экономическое значение 14
2.1.3 Географическое распространение 15
2.1.4 Эпизоотологические особенности 19
2.1.5. Патогенез блютанга 25
2.1.6 Клинические признаки и патологоанатомические изменения..25
2.2 Краткая характеристика возбудителя блютанга 26
2.2.1 Таксономическое положение вируса блютанга 26
2.2.2 Структура вируса 26
2.2.3 Антигенная вариабельность и родство вируса блютанга с другими представителями рода Orbivirus 28
2.2.4 Устойчивость вируса к физико-химическим факторам 28
2.3 Лабораторная диагностика блютанга 29
2.3.1 Выделение вируса 29
2.3.2 Идентификация вируса 33
2.3.3 Типирование вируса блютанга 34
2.3.4 Выявление специфических антител к вирусу блютанга 34
2.3.5 Молекулярно-биологические методы - выявление РНК вируса блютанга 37
2.3.6 Статистические диагностические показатели методов 38
2.5 Заключение по обзору литературы 40
3 Собственные исследования 42
3.1 Материалы 42
3.1.1 Вирусы 42
3.1.2 Сыворотки 42
3.1.3 Животные 42
3.1.4 Культуры клеток 43
3.1.5 Питательные среды, сыворотки и растворы 43
3.1.6 Реактивы и препараты 43
3.1.7 Диагностические препараты, наборы, тест-системы 44
3.1.8 Оборудование и расходные материалы 44
3.2 Методы 45
3.2.1 Воспроизведение блютанга на восприимчивых животных 45
3.2.2 Отбор проб крови 46
3.2.3 Получение сыворотки 46
3.2.4 Отбор проб органов 46
3.2.5 Подсчет количества лейкоцитов в крови 47
3.2.6 Определение инфекционной активности вируса в культуре клеток 47
3.2.7 Определение инфекционной активности вируса на куриных эмбрионах 47
3.2.8 Определение вируснейтрализующих антител к вирусу блютанга 48
3.2.9 Определение специфических антител к вирусу блютанга реакцией длительного связывания комплемента (РДСК) 48
3.2.10 Определение специфических анти-УР7 антител к вирусу блютанга конкурентным ТФ ИФА 48
3.2.11 Выделение вируса блютанга 49
3.2.12 Идентификация изолята вируса реакцией прямой иммунофлюоресценции (РПИФ) 52
3.2.13 Типирование выделенного вируса блютанга реакцией нейтрализации (РН) с типоспецифическими сыворотками 54
3.2.14 Определение стерильности 54
3.2.15 Статистические методы анализа результатов 55
3.3 Результаты собственных исследований 56
3.3.1 Сравнительная оценка эффективности методов выделения вируса блютанга 56
3.3.2 Выделение вируса блютанга от импортированного в Россию крупного рогатого скота и полученных от них телят 71
3.3.3 Характеристика изолятов вируса блютанга 78
3.3.4 Патогенность выделенного вируса для крупного рогатого скота и овец 83
3.3.5 Иммунный ответ у зараженных вирусом блютанга телят и овец 101
3.3.6 Сравнительная оценка эффективности основных серологических методов диагностики блютанга 108
4 Обсуждение результатов исследований 116
5 Выводы 123
6 Практические предложения 124
7 Список использованной литературы 125
Приложения 150
- Эпизоотологические особенности
- Сравнительная оценка эффективности методов выделения вируса блютанга
- Патогенность выделенного вируса для крупного рогатого скота и овец
- Сравнительная оценка эффективности основных серологических методов диагностики блютанга
Введение к работе
1.1 Актуальность темы
В настоящее время блютанг зарегистрирован на всех континентах, где развито овцеводство. Блютанг наносит овцеводству многих стран мира огромный экономический ущерб [Savini G. et al., 2004,. Meiswinkel R. et al., 2008., Papadopoulos O. et al., 2008].
При выполнении с 2006 года приоритетного национального проекта «Развитие АПК» основным экспортером племенного скота в нашу страну оказались европейские страны. В конце того же года ряд европейских стран объявили о своем неблагополучии по блютангу 8 серотипа, в том числе Германия и Нидерланды [МЭБ: [сайт]. URL: . За период с 2006 по 2010 гг. было импортировано более 120 тыс. животных в хозяйства, расположенные на всей европейской территории РФ, Урала и Сибири.
В настоящее время система диагностики блютанга, как совокупность связанных между собой вирусологических и серологических методов, основана на выявлении специфических антигенов и антител у наиболее восприимчивых к нему животных - овец, инфекция у которых обычно протекает в острой и подострой форме, и включает комплекс методов выделения вируса с использованием мышат-сосунов и культуры клеток.
Несмотря на имеющиеся в научной литературе данные о биологии вируса, роль крупного рогатого скота в распространении инфекции и вопросы выделения вируса от него пока в России не изучали.
Необходимость совершенствования средств и методов диагностики с учетом новых достижений науки и постановки диагноза при бессимптомном течении болезни у крупного рогатого скота поставило перед нами задачу разработки усовершенствованной системы диагностики блютанга у жвачных животных.
1.2 Степень разработанности проблемы
Среди отечественных ученых проблему выделения вируса блютанга изучали Вишняков И.Ф., Стрижаков А.А., Новикова М.Б. и др. [1], Хижинский П.Г. [2].
Оценку различных методов выделения вируса блютанга проводили Foster
N.M. et al. [10], Howard Т.Н. et al. [12], Gard G.P. et al. [11], Wechsler S.J. и Luedke
A.J. [18], Billinis С et al. [5]. Как правило, в данных работах сравнивали только
методы выделения вируса с использованием куриных эмбрионов и различных
культур клеток. При этом отсутствуют данные по комплексной сравнительной
оценке методов с использованием куриных эмбрионов и культуры клеток, применяемых согласно рекомендациям МЭБ, и метода с использованием новорожденных мышат-сосунов, успешно применявшегося многими исследователями, в том числе и в России.
Длительность виремии у овец и крупного рогатого скота изучали MacLachlan N.J. et al. [6, 17], Foster N.M. et al. [16], Barratt-Boyes S.M. и MacLachlan N.J. [4], Koumbati M. et al. [7], Bonneau K.R. et al. [8], Singer R.S. et al. [14], однако исследования в течение длительного периода после заражения животных (более 3-4 месяцев) в литературе практически не описаны.
В России разработкой методов ТФ ИФА на основе моноклональных антител для диагностики блютанга занимался Стрижаков А.А. [3]. Иммунный ответ у крупного рогатого скота и овец при инфицировании вирусом блютанга описан в работах Stott J.L. и Osburn B.I. [15], Foster N.M. et al. [16], Shringi S. и Shringi B.N. [13], Dal Pozzo F. et al. [9]. В данных работах не проводили исследований сывороток на наличие антител параллельно РН, РДСК и конкурентным ТФ ИФА.
1.3 Цель и задачи исследования
В соответствии с вышеизложенным целью наших исследований являлось усовершенствование системы лабораторной диагностики блютанга овец и крупного рогатого скота.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- дать сравнительную оценку методов выделения вируса блютанга с
использованием куриных эмбрионов, мышат-сосунов и культур клеток;
определить уровень и длительность виремии у крупного рогатого скота и овец после их экспериментального заражения вирусом блютанга 1 и 8 серотипов;
определить динамику накопления антител у крупного рогатого скота и овец после их экспериментального заражения вирусом блютанга 1 и 8 серотипов;
определить диагностические характеристики серологических методов;
- внести изменения в существующую систему лабораторной диагностики
блютанга.
1.4 Научная новизна результатов исследования
Впервые выделено 5 новых изолятов вируса блютанга 8 серотипа от крупного рогатого скота, импортированного из Нидерландов и Германии в
хозяйства Курской, Калининградской и Нижегородской областей РФ, в том числе 2 - от рожденных от них телят.
Установлено, что эффективность выделения вируса блютанга из проб крови и органов овец и крупного рогатого скота с использованием куриных эмбрионов в 30-100 раз превышает ранее применявшиеся методы с использованием мышат-сосунов и культуры клеток.
Изучены иммунобиологические свойства выделенного вируса блютанга (штамм ФКл/4-09) в сравнении с вирусом блютанга 8 серотипа, выделенным в Нидерландах, и 1 серотипа, выделенным в Испании.
1.5 Практическая значимость работы
Выделены от импортированного крупного рогатого скота, паспортизированы и заложены в коллекцию ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии новые штаммы вируса блютанга (ФК/1-08, ФК/2-09, ФК/3-09, ФКл/4-09, ФН/5-09).
Разработанные «Методические рекомендации по лабораторной диагностике блютанга» рассмотрены, одобрены на секции «Инфекционной патологии животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 30.09.2010 г. и утверждены Академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 24.11.2010 г.
1.6 Апробация работы
Основные результаты исследований по теме диссертации доложены на:
- научной конференции в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии
«Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины»,
г.Покров, 2009г.;
международной научно-практической конференции в ГНУ УрНИВИ «Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц», г. Екатеринбург, 2010г.;
выездном заседании секции «Инфекционной патологии животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 30.09.2010 г.;
- заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии в 2008-
2010 гг.
1.7 Публикации
По материалам диссертации опубликовано пять научных работ, из них две статьи - в рекомендованном ВАК журнале «Ветеринария», 2010г. - №8. - С. 23-26. и№10. -С. 58-59.
1.8 Соответствие диссертации паспорту научной специальности
В соответствии с формулой специальности 06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология, охватывающей проблемы разработки и применения средств и методов диагностики, лечения, профилактики и ликвидации болезней, включая области исследований - биологические свойства вирусов, методы выделения вирусов из патологического материала, средства и методы лабораторной диагностики инфекционных болезней животных, частная инфекционная патология, серология инфекционных болезней животных, в диссертационном исследовании усовершенствована система диагностики блютанга посредством включения в диагностические процедуры выделения вируса с использованием куриных эмбрионов и комплекса серологических и вирусологических методов, применяемых в зависимости от формы течения болезни, дана сравнительная оценка методов выделения вируса, определена диагностическая характеристика серологических и вирусологических методов.
Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности- 1, 5, 6,14.
1.9 Структура диссертации
Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы, методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 20 отечественных и 247 иностранных источников, дополнена приложениями. Диссертация содержит 16 таблиц и 57 рисунков. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
1.10 Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Результаты сравнительной оценки эффективности методов выделения вируса блютанга.
-
Иммунобиологические свойства выделенного вируса блютанга (штамм ФКл/4-09) в сравнении с вирусом 8 серотипа, выделенным в Нидерландах, и 1 серотипа, выделенным в Испании.
-
Диагностические показатели серологических методов для выявления специфических антител к вирусу блютанга.
4. Обоснование предлагаемой схемы лабораторной диагностики блютанга.
1.11 Личный вклад автора в выполнение работы
Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные
этапы работы выполнены при методической и консультативной помощи сотрудников лаборатории Диагностики к.в.н., с.н.с. Фёдорова Г.П., к.б.н., с.н.с. Хижинского П.Г. и сотрудников лаборатории Биологии и культивирования вирусов д.в.н. Закутского Н.И. и аспиранта Нестерова Е.А. Данные результатов серологического мониторинга импортированного крупного рогатого скота для статистической обработки получены из материалов диагностических исследований лаборатории Диагностики.
Эпизоотологические особенности
Спектр патогенности в естественных условиях
В естественных условиях к блютангу наиболее восприимчивы овцы, «также инфицируются КРС и козы. Овцы европейских пород более чувствительны, чем овцы африканских и азиатских пород [258]. Из дикой фауны блютангом болеют олени [53, 101, 126, 131], лоси [179, 217], снежные [121] и болыыерогие бараны [126], антилопы [46], альпаки [98], гауры [48], яки [44], газели [114], ориксы [210] и другие парнокопытные. Также есть данные об обнаружении антител к БТВ, а в некоторых случаях вирусного антигена, у хищных [92], кошачьих (рысь) [45], слонов [88], носорогов [211], но об эпизоотологическом значении этих животных не известно.
Источники и пути передачи инфекции
Блютанг носит сезонный характер и его возникновение, как правило, совпадает с периодом наибольшей активности насекомых. Основным переносчиком возбудителя служат мокрецы рода Culicoides, которые могут переносить также и вакцинный вирус от привитых животных непривитым [28]. Мокрецы Culicoides распространены практически повсеместно. В распространении болезни могут участвовать комары некоторых видов {Anopheles) [145], кровососки {Melophagus ovinus) [113, 160] и клещи [192, 219].
Особый интерес в изучении блютанга представляет вопрос трансплацентарной передачи БТВ, сопровождающейся увеличением количества абортов, мертворождениями, а также рождением инфицированных ягнят и телят. Врожденное уродство у ягнят связывают как с естественным инфицированием БТВ, так и с аттенуированными вакцинами против БТ [42, 96, 97, 200, 205]. Так, инфицирование овец на 50-58-е сутки беременности часто приводит к некротизирующей энцефалопатии у плодов, которая при рождении выявляется как гидроэнцефалит. Инфицирование в 75-78- дней беременности часто ведет к развитию многоочагового энцефалита и вариоляции белого вещества головного мозга у плодов, в то время как инфицирование в 100 дней беременности приводит к умеренному очаговому энцефалиту с минимальными патологическими последствиями [96].
У телят наблюдают гидроэнцефалит и другие врожденные уродства в результате естественной или экспериментальной инфекции БТВ [36, 154, 155, 201]. Инфицирование эмбриона в период формирования иммунной системы может привести к возникновению явления иммунологической толерантности к БТВ [154, 156].
Так, при эпизоотии 2007 года в Бельгии, вызванной БТВ 8 серотипа, описан значительный рост случаев абортов с подозрением роли данного вируса, геном которого выявлен методом ОТ-ПЦР у абортированных плодов в 41% случаев. Геном БТВ выявлен у молодняка 1-4-х месяцев в 11% и 2,3% случаев при подозрении и без подозрения на БТ, соответственно. При изучении парных проб сывороток корова/теленок уровень трансплацентарной инфекции новорожденных телят достигал 10%, а явная иммунологическая толерантность телят наблюдалась в 2,4% случаев [252]. При данной эпизоотии зарегистрированы случаи гидроэнцефалита у трансплацентарно инфицированных БТВ абортированных плодов и телят до 3-х месячного возраста [57]. Также был выделен вирус от новорожденных телят, полученных от коров, давших отрицательный результат в ОТ-ПЦР [252].
Возможные пути сохранения вируса блютанга в межэпизоотический период
Передача вируса блютанга происходит, как правило, через укусы самок определенных видов мокрецов рода Culicoides [171, 172]. Однако, наблюдают длительные периоды отсутствия переносчиков, которые превышают максимальную длительность виремии у жвачных животных. Это происходит при неблагоприятных для мокрецов климатических условиях, например во время засухи, а также в зимний период. При отсутствии переносчиков, вспышки БТ прекращаются. Обычная схема передачи БТВ (рисунок 1) предполагает, что, если период отсутствия переносчиков длится более 100 дней, то вирус не сможет его пережить [84, 174].
Однако после окончания этих периодов вспышки часто возобновляются [47, 90, 181, 231, 265]. В Нидерландах после эпизоотии 2006 года БТ вновь появился в 2007 году [266]. Возобновление болезни при этом совпадает с периодом максимального накопления переносчиков [174].
1. Сохранение в переносчиках
- переживание во взрослых мокрецах. Взрослые мокрецы Culicoides при температурах, близких к нулевым, выживают не более 10-20 дней, [173]. Есть данные, что в лабораторных условиях при 10 С мокрецы выживают влечение трех месяцев [163]. Таким образом, существует возможность выживания небольшой части зараженных вирусом блютанга мокрецов, при- умеренных зимах. Хотя, большинство европейских видов мокрецов, Culicoides не встречается в зданиях, при ряде исследований установлено, что. часть насекомых переживают период пониженных температур в закрытых помещениях и остаются активными в течение зимы [39, 62, 87, 142, 206, 234].
Поэтому круглогодичное присутствие взрослых зараженных мокрецов Culicoides рассматривают как вероятное объяснение цикла передачи вируса блютанга [66, 183, 195].
- трансовариальная передача вируса от зараженных БТВ мокрецов потомству. Большинство Culicoides переживает неблагоприятный период на стадии личинки[149]. Однако не описано ни одного случая удачного выделения инфекционного БТВ из личинок или взрослых особей, родившихся от инфицированных мокрецов, хотя у них и выявляли фрагменты РЕК [175, 226]. Это объясняется тем, что через мембрану в развивающееся яйцо возможно проникновение фрагментов РНК и других частиц размером не более 11 нм в диаметре, что механически препятствует проникновению неповрежденных вирионов [27]. Таким образом, данный механизм передачи вируса до настоящего времени не имеет подтверждения.
- альтернативные переносчики. Другие переносчики вируса блютанга помимо мокрецов Culicoides также могут играть роль в сохранении вируса. Так, клещи, которые могут являться биологическими переносчиками БТВ [219, 265], живут в течение нескольких лет. Кроме того, механическим переносчиком БТВ являются бескрылые мухи Melophagus ovinus, живущие в шерсти овец [160, 265]. 2. Сохранение в животных
1) Персистенция вируса у животных
Инфекционный БТВ при экспериментальном и естественном заражении может быть выделен из крови КРС дольше, чем от овец и коз, но; как правило; не более 58 дней. Однако некоторые ученые предполагают, что.у отдельных особей вирус может сохраняться, намного дольше [125, 265]. Есть свидетельства, согласно которым при кормлении больших количеств незараженных мокрецов на переболевшем КРС происходит стимуляция репродукции вируса в различных клетках кожи в месте воспаления [159], а другие опровергают эту возможность [52, 264]. Аналогичные эксперименты на овцах позволяли выделить вирус из кожи животного в течение более двух месяцев после заражения [24]. In vitro показана возможность сохранения вируса в уб Т-клетках [24], что позволило бы объяснить длительную персистенцию вируса в организме животного с периодами отсутствия вируса в крови и последующими периодами виремии в летний период при появлении мокрецов, их многочисленных укусах и развитии кожной воспалительной реакции. Такой механизм позволял бы вирусу сохраняться в течение нескольких месяцев без заражения новых хозяев, и таким образом переживать периоды отсутствия переносчиков.
Кроме этого, предполагается, что резервуаром БТВ может быть пока еще неизвестный хозяин с длительным периодом виремии при отсутствии или слабо выраженных клинических признаках [265]. При этом продолжительность виремии у инфицированных блютангом диких жвачных животных не достаточно изучена. У белохвостых оленей и лосей виремия при инфицировании БТВ не превышает 16 дней [179, 215], у бизонов - 28 дней [233]. Однако одно исследование предполагает, что виремия у лосей может продолжаться до трех месяцев после инфицирования [179].
2) Передача вируса между жвачными без участия переносчиков
- половой путь. Есть сообщения о выделении БТВ со спермой у лабораторно инфицированных быков, но отсутствуют опубликованные данные по естественно зараженным животным. Кроме того, данные всех исследований показывают, что это происходит только в период виремии у данного животного [93]. В настоящее время, как правило, используется искусственное осеменение спермой» от быков-производителей, проверенных на основные инфекционные заболевания, в том числе и на блютанг. Поэтому, данный путь - передачи не может играть существенной роли в эпизоотологии блютанга.
- алиментарный путь. Имются сообщения о случае прямого контактного заражения БТВ 8 серотипа, который, вероятно, произошел после поедания инфицированных плацент [91, 109].
- вертикальная (трансплацентарная) передача БТВ описана как у КРС, так и у овец после заражения адаптированными к культуре штаммами различных серотипов [250]. Однако в случае БТВ 8 серотипа трансплацентарную передачу наблюдали как у естественно инфицированных животных [91, 137, 251, 252, 253, 257], так и у экспериментально инфицированных [250]. Трансплацентарная передача БТВ впервые зарегистрирована в 1970-ых годах [108].
Сравнительная оценка эффективности методов выделения вируса блютанга
Для постановки диагноза на блютанг при первичном заносе возбудителя необходимо выделить вирус от подозреваемых в заражении животных. В качестве материалов для выделения вируса используют пробы крови, а в случае падежа или вынужденного убоя животных — пробы органов.
Согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике катаральной лихорадки овец» [11] в РФ применяли два метода выделения вируса блютанга - с использованием предварительного введения 2-3 -х-суточным мышатам-сосунам и напрямую в культуру клеток, в то время как МЭБ [165] рекомендован метод с предварительным внутривенным введением куриным эмбрионам.
Поэтому перед нами стояла задача определить эффективность выделения вируса блютанга из проб крови и различных органов этими тремя методами. Для выполнения этого необходимо было:
- воспроизвести блютанг у крупного рогатого скота и овец при заражении двумя различными серотипами вируса;
- отобрать пробы крови в динамике для последующего выделения вируса;
- выделить вирус напрямую в чувствительных культурах клеток, с предварительным интрацеребральным введением мышатам-сосунам и с предварительным внутривенным введением КЭ.
Все опыты по воспроизведению блютанга на животных проводили по единой схеме (п. 3.2.1).
На первом этапе теленку №3314 черно-пестрой породы в возрасте 4 месяца вводили культуральную жидкость, содержащую БТВ 8 серотипа шт. BTV NET2006-A, в дозе 105 5 ТЦД50 внутривенно и внутрикожно в общем объеме 1 см3.
На 4-8 сутки после заражения отмечали повышение температуры тела до 40,2-40,7 С (рисунок 3), угнетение, снижение аппетита, тахикардию и серозное истечение из носовой полости. Повторный кратковременный подъем температуры до 40,5 С у этого теленка произошел на 11-12 сутки. На втором этапе телятам №1 и 2 черно-пестрой породы в возрасте 3-х месяцев вводили вирус-кровь теленка №3314, отобранную на пике температуры на 11 сутки после заражения в дозе 103 5 ЭЛД5о внутривенно и внутрикожно в общем объеме 1 см .
У теленка №1 на 4-11 сутки после заражения отмечали гипертермию при максимальной температуре тела 40,1 С на 6 сутки после заражения (рисунок 4). У теленка №2 гипертермию практически не отмечали. Других клинических признаков не наблюдали.
На третьем этапе овцам №1 и 2 романовской породы в возрасте 5-6 месяцев вводили кровь телят №1 и 2 , отобранную на пике температуры на 7 сутки после заражения в дозе 104 0ЭЛД50 внутривенно и внутрикожно в объеме I см3.
Со вторых суток у инфицированных овец проявлялось учащение дыхания, гиперемия слизистых оболочек, с третьих-четвертых суток -незначительные катаральные и катарально-слизистые истечения из носа, с седьмых суток - незначительный конъюнктивит. Пик температурной реакции наблюдали на 6-8 сутки после заражения (рисунок 5). У овцы №1 с 7 суток -диарея, с 8 - отсутствие аппетита, с 10 суток - хрипы, угнетение, с 11 -залеживание, с 12 - сильные хрипы, прерывистое дыхание, обильные слизистые истечения из носа, отечность и гиперемия глотки, опухание запястных суставов, увеличение предлопаточных лимфоузлов, на 16 - гибель. У овцы №2 с
II суток отсутствие аппетита, незначительное угнетение, с 13 - увеличение предлопаточных лимфоузлов, с 14 - диарея, угнетение, на 16 — залеживание, на 17-гибель.
На третьем этапе овцам №1 и 2 романовской породы в возрасте 5-6 месяцев вводили кровь телят №1 и 2 , отобранную на пике температуры на 7 сутки после заражения в дозе 104 0ЭЛД50 внутривенно и внутрикожно в объеме I см3.
Со вторых суток у инфицированных овец проявлялось учащение дыхания, гиперемия слизистых оболочек, с третьих-четвертых суток -незначительные катаральные и катарально-слизистые истечения из носа, с седьмых суток - незначительный конъюнктивит. Пик температурной реакции наблюдали на 6-8 сутки после заражения (рисунок 5). У овцы №1 с 7 суток -диарея, с 8 - отсутствие аппетита, с 10 суток - хрипы, угнетение, с 11 -залеживание, с 12 - сильные хрипы, прерывистое дыхание, обильные слизистые истечения из носа, отечность и гиперемия глотки, опухание запястных суставов, увеличение предлопаточных лимфоузлов, на 16 - гибель. У овцы №2 с
II суток отсутствие аппетита, незначительное угнетение, с 13 - увеличение предлопаточных лимфоузлов, с 14 - диарея, угнетение, на 16 — залеживание, на 17-гибель.
На первом этапе теленку №464 черно-пестрой породы в возрасте 3 месяца вводили культуральную жидкость, содержащую БТВ 1 серотипа, в дозе 105 5 ТЦД50 внутривенно и внутрикожно в общем объеме 1 см .
Клинических признаков у теленка практически не выявляли за исключением повышения температуры тела на 10 сутки после заражения до 40,9 С (рисунок 6).
На втором этапе телятам №846 и 848 черно-пестрой породы в возрасте 3 х месяцев вводили вирус-кровь теленка №464, отобранную на пике температуры на 7 сутки после заражения в дозе 105 0 ЭЛД5о внутривенно и внутрикожно в объеме 1 см .
На третьем этапе овцам №19, 20 породы меринос, №28 курдючной породы и №29 романовской породы в возрасте 10-12 месяцев вводили кровь телят №846 и 848, отобранную на пике температуры на 7 сутки после заражения в дозе 105 -105 5ЭЛД5о внутривенно и внутрикожно в объеме 1 см3.
У овец наблюдали перемежающуюся лихорадку в течение месяца после заражения с выраженными температурным пиком на 4-10 сутки после заражения, при этом максимальная температура тела достигала 41,7С (рисунок 10).
Патогенность выделенного вируса для крупного рогатого скота и овец
На первом этапе теленку №50 голштино-фризской породы в возрасте 1,5 месяца вводили культуральную жидкость, содержащую вирус блютанга 8 серотипа шт. ФКл/4-09, в дозе 106 0ТЦД5о внутривенно и внутрикожно в общем объеме 1 см3.
У теленка наблюдали перемежающуюся лихорадку, с пиками температуры тела на б, 13 и 34 сутки после заражения, при которых температура тела достигала 40,5-41,1 С (рисунок 21).
Изменение количества лейкоцитов в крови теленка имело перемежающийся характер с выраженными пиками лейкоцитоза до 11,3-16,7 тыс./мкл на 4, 12, 24, 33, 36 и 44 сутки после инфицирования (рисунок 22).
На 7-13 сутки начинались серозно-слизистые истечения из носа и глаз, с 2 недель после заражения - одышка, кашель, признаки пневмонии, с 20-х по 25-е сутки после заражения - помутнение роговицы глаза (кератит) (рисунок 23), на 10-12-е и на 30-36-е сутки после заражения - угнетение, снижение аппетита, на 34-36 сутки возник парез задних конечностей, в результате чего теленок лежал. Теленок в течение всего периода наблюдения значительно отставал в росте (рисунок 24).
На втором этапе теленку №16 голштино-фризской породы в возрасте 2 месяца вводили вирус-кровь, отобранную у теленка №50 на 7 сутки после заражения, в дозе 105 5 ЭЛД5о внутривенно и внутрикожно в общем объеме 1 см3.
У теленка №16 клинических признаков практически не выявляли за исключением незначительного повышения температуры до верхней границы нормы (рисунок 25).
Изменение количества лейкоцитов в крови теленка также носило перемежающийся характер с периодами лейкопении на 9 сутки до 2,6 тыс./мкл и лейкоцитоза на 11, 16, 21, 27, 46, 60 и 135 сутки после заражения до 8,5-10,5 тыс./мкл (рисунок 26).
На третьем этапе трем овцам (№17, 18 и 22) романовской породы в возрасте 5-6 месяцев вводили вирус-кровь, отобранную у теленка №16 на 8 сутки после заражения, в дозе 104 5 ЭЛД5о внутривенно и внутрикожно в объеме 1см3.
У овец №17 и 22 наблюдали непрерывную гипертермию в течение первых 2-3 недель после заражения с выраженным температурным пиком на 3-10 сутки после заражения, когда температура тела поднималась до 41,5С (рисунок 27). У овцы №18 отмечены кратковременные подъемы температуры тела на 15 и 50 сутки после заражения.
Изменение количества лейкоцитов в крови овец носило перемежающийся характер (рисунок 28).
У овец №17 и 22 с 3-5-х суток появлялись серозно-слизистые истечения из носа и глаз, незначительная одышка, признаки пневмонии, длящиеся 2-4 недели, с 5-8-х суток - отечность морды (рисунок 29). У овцы №18 клинические признаки заболевания не отмечены.
Пробы крови для исследований брали у телят №50 - до 445 суток, №16 до 428 суток, а у овец №17, 18 и 22 - до 178, 66 и 22 суток после заражения, соответственно.
Несомненный интерес представляло проведение количественной характеризации выраженности клинических признаков. Для этого клинические признаки были ранжированы по баллам (таблица 10).
Для расчетов был взят период наиболее выраженных клинических признаков - первые 17 суток после заражения. Клинические признаки, которые использовали для учёта: гиперемия, концентрация лейкоцитов крови, поражения глаз, отёки, исход болезни. Другие признаки (поражение венчика копытец, хромота, некрозы) не использовали, поскольку они не были обнаружены ни в одном случае.
При оценке клинических признаков в условно определённых баллах (таблицы 11, 12) более патогенным для крупного рогатого скота оказался вирус блютанга шт. ФКл/4-2009 - 31,5 баллов/гол., а менее патогенными был вирус блютанга 1 серотипа - 12,0 баллов/гол. Для овец наиболее патогенными был вирус блютанга 1 серотипа - 80,0 баллов/гол., а менее патогенным полевой изолят вируса блютанга 8 серотипа шт. ФКл/4-2009 - 26,5 баллов/гол.
Отдельную группу овец заражали БТВ 8 серотипа шт. BTV NET2006-A.
Четырем овцам курдючной породы (№№ 11, 12, 13 и 14) в возрасте 12 месяцев вводили вирус-кровь второго пассажа на овцах в дозе 1050 ЭЛД5о внутривенно и внутрикожно в объеме 1 см .
У овец наблюдали непрерывную гипертермию в течение первых 2 недель после заражения с выраженным температурным пиком на 4-14 сутки после заражения, когда температура тела поднималась до 41,5 С (рисунок 30).
У всех овец с 4-6-х суток после заражения появлялись серозно-слизистые истечения из носа и глаз (рисунок 31), признаки воспаления верхних дыхательных путей. У овец №11 и 14на6и 14 сутки после заражения возникло помутнение роговицы глаза - кератит (рисунок 32), который исчезал в течение недели. К 3-4 неделе после заражения состояние животных приходило в норму.
Пробы крови для исследований брали у овец №11 - до 128, №12 - до 33, №№ 13 и 14 - до 43 суток после заражения.
Таким образом, после заражения овец БТВ 8 серотипа шт. BTV NET2006-А, прошедшим два последовательных пассажа на овцах, наблюдали острое течение инфекции с последующим выздоровлением.
После заражения вирусом блютанга произошел падеж 3 овец:
- овцы №1 и 2, зараженные вирусом блютанга 8 серотипа шт. BTV NET2006-A (п. 3.3.1.1);
- овца №19, зараженная вирусом блютанга 1 серотипа (п. 3.3.1.2).
При вскрытии данных овец выявили следующие патологоанатомические изменения.
У овец №1 и 2 наблюдали увеличение предлопаточных лимфоузлов, увеличение запястных суставов. У овцы №19 - фибринозные спайки между легочной, реберной плеврой и перикардом (рисунок 33).
Сравнительная оценка эффективности основных серологических методов диагностики блютанга
Проведение мониторинговых исследований в течение 2006-2010 гг. по выявлению специфических к вирусу блютанга антител дало нам возможность получить большую выборку сывороток от животных, как здоровых, так и подозреваемых в заражении вирусом блютанга 8 серотипа.
Первичный скрининг сывороток на наличие антител к вирусу блютанга проводили РДСК согласно п. 3.2.9.
Если среди исследуемых сывороток крови определенной группы животных часть сывороток была выявлена как положительные и/или сомнительные, то все сыворотки крови этой группы животных в обязательном порядке исследовали ТФ ИФА (п. 3.2.10) и РН с постоянной дозой вируса (п. 3.2.8). Схема исследований представлена на рисунке 56.
За период с сентября 2006 по октябрь 2010 серологическими методами было исследовано 126827 проб сывороток крови от крупного рогатого скота, овец, и коз, ввезенных в РФ из стран Европы (таблица 13). Данные представлены, сотрудниками лаборатории Диагностики. В результате серологического обследования 126827 животных из 734 групп, имевших при ввозе статус «ОТ-ПЦР-отрицательные», РДСК была идентифицирована 31 группа животных (4%), в которых из 5087 тестированных животных выявлено 281 серо-положительное (таблица 15): Как «серо- положительные» были идентифицированы семнадцать групп нетелей, импортированных из Голландии, и четырнадцать - из Германии. Они были ввезены в фермы, находящиеся на территории Северо-Западного, Центрального, Южного, Приволжского, Уральского и Сибирского федеральных округов.
Таким образом, был создан пул сывороток, исследованных тремя серологическими методами, на котором и был проведен расчет диагностической чувствительности и специфичности методов.
Расчет диагностической чувствительности и специфичности проводили согласно п. 3.2! 15.
Из данных таблицы 16 видно, что из всех проверенных сывороток специфические антитела к вирусу блютанга были обнаружены одновременно РДСК, конкурентным ТФ ИФА и РН только у 190 животных (3,7%). Всего, ложно-положительных результатов РДСК было 83 (29,5%), ложно-отрицательных - 91 (32,4%).
Тест-превалентность сероположительных животных обследованных групп по результатам РДСК соответствовала тест-превалентности в конкурентном ТФ ИФА в группах №№ 3, 6, 14 и 26, а в группах №№ 1, 4, 5, 9, 11, 12, 19, 20, 21, 22, 24 и 27 была выше. В остальных случаях, тест-превалентность РДСК была ниже тест-превалентности конкурентного ТФ ИФА (таблица 16).
В связи с тем, что положительные и отрицательные результаты РН и конкурентного ТФ ИФА полностью совпали, сравнивали, диагностические показатели только РДСК и конкурентного ТФ ИФА, которые ввели; в четырехпольную таблицу 2x2.
Относительно) конкурентного ТФ ИФА (эталонный; метод); диагностическая: чувствительность РДСК на уровне индивидуальных скринируемых животных составила 190/( 190+91)х100 = 67,6%, диагностическая специфичность РДСК была 4723/(4723+83)хЮ0 = 98,3%.
Также определяли диагностическую ценность (надёжность) РДСК, т.е. % соответствия между полученными положительными/отрицательными результатами РДСК и реальным наличием или отсутствием инфицированных вирусом блютанга нетелей, путём оценки прогностического положительного (ППР) и прогностического отрицательного (ПОР) результата с использованием данных таблицы. Полученные расчётные показатели свидетельствуют, что в условиях серо-превалентности в среднем 5,3% только 190/(190+83)х100 = 69,6% положительных результатов РДСК точно соответствуют заражённым вирусом блютанга животным, а 30,4% будут ложно-положительными.
ПОР РДСК в условиях низкой превалентности инфицированых вирусом блютанга животных был незначительно ниже диагностической специфичности 4723/(4723+91)х100 = 98,1% ив целом можно считать неплохим показателем. За счёт 100% выборки и низкой превалентности инфицированное нетелей вирусом блютанга отрицательные результаты РДСК не требуют дополнительного подтверждения другими методами и, на уровне «стада» являются убедительными. Это предположение было подтверждено отрицательными результатами в конкурентном ТФ ИФА. при перепроверке 3-х РДСК-отрицательных групп (ОАО «Белгородские молочные фермы», Белгородская область, п=97, ввезены из Нидерландов 14.02.2008 г.;. ОАО «Щапово-Агротехно», Московская область, п=156, ввезены из Германии 10.09.2008 г.; ОАО «Трио», Липецкая область, п=64, ввезены из Германии).
Таким образом, несмотря на низкие статистические диагностические показатели на уровне индивидуальных животных, РДСК точно были классифицированы благополучные и неблагополучные по блютангу группы импортированных нетелей.
В данном случае, на неплохое совпадение положительных и отрицательных результатов в РДСК и конкурентном ТФ ИФА (190+4723)/5087х100 = 96,6%, повлияло хорошее соответствие отрицательных результатов РДСК и ИФА.
Оценивая диагностическую чувствительность комбинации серологических методов (РДСК+конкурентный ТФ ИФА и РН) по отношению к эпизоотической единице «стадо», вероятность обнаружения серо-позитивных групп животных будет 99% и более, так как количество серо-положительных в каждой группе более 1 (за исключением групп №№ 1, 9, 20, 22 и 26).
Несмотря на низкий показатель диагностической чувствительности на уровне индивидуальных скринируемых животных, РДСК показывает высокую эффективность при выявлении инфицированных групп животных, в то время как для выявления индивидуальных инфицированных животных в группах целесообразно применять наиболее чувствительные методы - конкурентный ТФ ИФА и РН. Таким образом, в диагностике блютанга необходимо использовать конкурентный ТФ ИФА, а при выявлении инфицированных животных в стаде (мониторинг, бессимптомное течение) на первом этапе возможно применение РДСК, как более дешевого метода, а в случае выявления сероположительных животных в стаде проводить поголовную проверку конкурентным ТФ ИФА.
