Введение к работе
Актуальность темы исследования. Развитие животноводства требует ускорения селекционного процесса, что невозможно без увеличения надежности оценки генетического потенциала племенного поголовья. В этих целях разрабатываются методы применения молекулярно-генетических маркеров развития желательного фенотипа (количества и качества конечной продукции, устойчивости к условиям содержания, контроля наличия наследственных заболеваний и инфицированности патогенами) (Зиновьева Н.А. и др., 2010). ДНК микроматрицы (матрицы ДНК проб) позволяют осуществлять одновременное генотипирование многих геномных участков по мононуклеотидным полиморфизмам (Single Nucleotide Polymorphisms - SNP), оценивать активность транскрипции различных генов (профили генной экспрессии - ПГЭ). Включение генетических маркеров в селекционные программы увеличивает надежность селекционной работы при сохранении оптимального уровня генетического разнообразия, обеспечивает проведение отбора и подбора животных с учетом генотипической оценки (Дунин И.М. и др., 1994; Калашникова Л.А. и др., 2001; Харченко П.Н., Глазко В.И., 2006; Эрнст Л.К., 2008). В свиноводстве с использованием ДНК микроматриц получено огромное количество данных о ткане- и органо специфической экспрессии генов как у здоровых свиней (Lin C.S., Hsu C.W., 2005; Li M.Z. et al, 2008; Damon M. et al., 2012), так и при различных патологических состояниях (Chomwisaratkun К. et al., 2011; Maak S. et al., 2009). Выявлены определенные ассоциации между SNP в структурных и регуляторных областях генов и желательным развитием хозяйственно-полезных признаков (Wyszynska-Koko J. et al., 2006; Guiatti В. et al., 2011). Однако низкая воспроизводимость таких данных ограничивает внедрение маркерной селекции в животноводство. Это может быть связано с рядом причин: сложностью систем регуляции генной экспрессии (Шихов И.Я., 2007; Cheon Y. et al., 2005), возможностью перекрестной гибридизации ДНК проб (Okoniewski М. J., Miller С. J., 2006), техническими и статистическими погрешностями обработки данных (Nguyen Т.Т. et al., 2010), изменчивостью вкладов генотипической и паратипической компонент в проявление признака в разных условиях окружающей среды. В этой связи особую актуальность приобретают
исследования возможных причин неоднозначности выявленных ассоциаций между ПГЭ, SNP регуляторных областей предполагаемых «критических» генов и желательным проявлением хозяйственно-полезныхпризнаков.
Целью работы являлось повышение надежности прогнозирования
развития основных хозяйственно-полезных признаков у свиней на основе
использования современных методов молекулярно-генетического анализа.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Оценить и проанализировать профили генной экспрессии почек, печени, сердца и тимуса у свиней породы ландрас на основе использования метода гибридизации флуоресцентно-меченных ДНК;
-
Сопоставить результаты полученных оценок экспрессии структурных генов с пробами ДНК микроматриц, гомологичных к разным участкам кДНК;
-
Провести анализ индивидуальной изменчивости оценок экспрессии структурных генов и выявить факторы, её определяющие в группе свиней породы ландрас;
-
Оценить степени взаимосвязи показателей мясной продуктивности у свиней двух- и трехпородных помесей в различных половозрастных группах на основе ассоциаций мононуклеотидного полиморфизма регуляторных областей (промоторов) ключевых генов контроля липидного метаболизма (Lep, Scd) и миогенеза (Myf-6, Myod);
-
Оценить уровень изменчивости показателей мясной продуктивности и
скорости роста помесных животных в зависимости от структуры
комплексных генотипов по мононуклеотидным полиморфизмам в промоторах
генов Lep, Scd, Myf-6, Myod, Орп.
Научная новизна исследований. Впервые выявлены факторы, влияющие на изменчивость оценок экспрессии генов в разных органах и тканях отдельных особей, и между разными животными. Выявлен фактор (перекрестная гибридизация), связанный с наличием гомологичных последовательностей как внутри отдельных структурных генов, так и между разными генами, что приводит к перекрестной гибридизации проб ДНК микроматриц с кДНК более чем одной мРНК. Показано, что индивидуальная изменчивость экспрессии
разных генов тесно связана с функциональными особенностями кодируемых ими белков и количеством метаболических путей, в регуляции которых они участвуют. Впервые выявлены и описаны две, хорошо идентифицируемые, составляющие органоспецифичного ПГЭ, одна включает гены, экспрессия которых отличается у разных животных, обозначенная нами как «вариабельная» часть ПГЭ, и другая объединяет гены, оценки экспрессии которых не имели индивидуальной изменчивости, составляющие, по нашему определению, «конститутивную» часть ПГЭ. Впервые получены данные о том, что продукты генов «вариабельной» части профиля участвуют в контроле в два раза большего количества метаболических путей и находятся в более сложных межгенных сетевых взаимоотношениях по сравнению с генами «конститутивной» части, что позволяет выделить в качестве ведущего фактора индивидуальной изменчивости их экспрессии средовую компоненту. На основании генотипирования SNP в регуляторных последовательностях (промоторах) ключевых генов липидного обмена и миогенеза обнаружено, что ассоциации между моногенными и комплексными генотипами с характеристиками сальности свиней и динамикой миогенеза зависят от пола, возраста исследуемых животных, а также от особенностей типа скрещивания (двух- и трехпородные помеси).
Практическая значимость работы. Обнаруженная в работе подразделение сть ПГЭ на конститутивную и вариабельную части, обусловленная вовлеченностью генов в разное количество метаболических путей, позволяет планировать подбор генов для получения органо специфичных ПГЭ в целях повышения надежности выявления генов, экспрессия которых вносит определяющий вклад в проявление хозяйственно-полезных характеристик свиней.
Впервые получены и проанализированы данные об ассоциациях между мононуклеотидными полиморфизмами промоторов генов кандидатов контроля липидного обмена и миогенеза, как отдельных, так и комплексных генотипов, и проявлением характеристик сальности и динамики миогенеза. Показано, что выявленные моногенные и комплексные генотипы могут быть непосредственно использованы для прогноза проявления хозяйственно-полезных характеристик с учетом ограничений надежности таких связей возрастом, полом и типом скрещивания свиней (двух- и трехпородные помеси).
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Воспроизводимость оценок ПГЭ зависит от наличия/отсутствия
перекрестной гибридизации между пробами ДНК микроматриц и участками гомологии внутри- и между кДНК мРНК разных генов.
2) Подразделейность ПГЭ на конститутивную и вариабельную части
обусловлена функциональными особенностями кодируемых белков и их
участием в контроле разного количества метаболических путей.
3) Ассоциации между молекулярно-генетическими маркерами -
мононуклеотидными полиморфизмами промоторов генов кандидатов контроля
проявления мясной продуктивности у свиней приемлемы для прогноза развития
признаков продуктивности с учетом ограничений надежности такого прогноза
возрастом, полом и типом скрещивания животных (двух- и трехпородные
помеси).
Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертации были представлены в виде докладов на VI Международном научном симпозиуме «Прикладные исследования для улучшения производства свинины и их влияние на развитие сельских территорий» (Быдгощ-Торунь, Польша, 2012); III Международном симпозиуме для аспирантов и студентов аграрный вузов (Быдгощ-Торунь, Польша, 2012), 25й Международной конференции «Генетические Дни» (Вроцлав, Польша, 2012); Международной конференции «Достижения в микрочиповых технологиях» \ АМТ (Гамбург, Германия, 2011); 7й и 8й международных конференциях по биоинформатике регуляции генома и структурной/системной биологии / BGRS\SB (Новосибирск, 2010; 2012); Международной московской конференции по вычислительной молекулярной биологии / МССМВ (Москва, 2009; 2011); XVI, XVII и XIX Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2009; 2010; 2012); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 145-летию академии имени К.А. Тимирязева (Москва, 2010); Международной конференции по бионаукам и биотехнологии / ICBB (Осло, Норвегия, 2009), 49й встрече американского общества по клеточной биологии / ASCB (Сан-Диего, США, 2009); Международной научно-технической конференции: нанотехнологии и наноматериалы (Москва, 2009); 62-й Международной студенческой научной конференции (Москва, 2009) Международной научно-практической конференции Нанотехнологии в сельском хозяйстве (Москва, 2008).
Публикации результатов исследования. По теме диссертации
опубликовано 24 научных работы общим объемом 6,3 п.л. с личным вкладом автора (75%), включая 4 статьи в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК Минобрнауки РФ и 1 статью в иностранном англоязычном издании.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах компьютерного текста, включает введение, три главы (обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные результаты и их обсуждение), заключение, выводы и предложения производству. Основной текст диссертации включает 18 таблиц и 20 рисунков. Библиографический список включает 192 литературных источника, в том числе 178 - на английском языке.
