Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы: эпизоотическая диарея свиней
1.1. Общая характеристика и распространённость 5
1.2. Этиология 7
1.2.1. Вирусные гастроэнтериты свиней .7
1.2.2. Систематика вируса ЭДС .10
1.2.3. Структура вириона .10
1.2.4. Физико-химические свойства .10
1.2.5. Структурные белки 10
1.2.6. Неструктурный белок ORF3 13
1.2.7. Структура генома .13
1.2.8. Антигенное родство 14
1. 3. Культивирование .16
1.4. Эпизоотологические данные .17
1.5. Патогенез .18
1.6. Клинические признаки .21
1.7. Диагностика 22
1.8. Предупреждение и контроль .25
1.8.1. Общие меры .25
1.8.2. Специфическая иммунопрофилактика 25
1.9. Заключение по обзору литературы .29
1.10. Цель и задачи исследования 33
2. Собственные исследования
2.1. Материалы и методы .34
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Культуральные свойства и aттeнуация полевого изолята вируса ЭДС с целью получения вакцинного штамма .49
2.2.1.1. Серийное пассирование вируса в культуре клеток Vero и оценка его аттенуации 49
2.2.1.2. Антигенность штамма ИС в зависимости от длительности аттенуации вируса 52
2.2.1.3. Изменения в геноме штамма ИС вируса ЭДС как результат адаптации к культуре клеток Vero .54
2.2.2. Оптимизация условий массового культивирования вируса. 56
2.2.2.1. Состояние культуры клеток .56
2.2.2.2. Зависимость накопления вируса от дозы заражения 58
2.2.2.3. Культивирование вируса ЭДС в роллерных и статических условиях 59
2.2.2.4. Размножение штамма ИС в других линях клеток и в сублиниях клеток Vero 59
2.2.3. Разработка технологии изготовления и контроля живой сухой вакцины в экспериментальных условиях 62
2.2.3.1. Изготовление сухой вакцины 63
2.2.3.2. Контроль вакцины на безопасность и реактогенность .70
2.2.4. Разработка способа применения живой вакцины против ЭДС. 71
2.2.4.1. Способ введения вакцины 71
2.2.4.2. Антигенность штамма ИС в зависимости от прививочной дозы 74
2.2.4.3. Антигенность штамма ИС в зависимости от кратности введения и дозы вакцины .75
2.2.4.4. Применение экспериментальной серии сухой вакцины в неблагополучном по ЭДС хозяйстве .78
2.2.5. Изготовление и применение живой сухой вакцины ИС-ЭДС в хозяйствах, неблагополучных по ЭДС 81
2.2.5.1. Изготовление и контроль живой сухой вакцины в производственных условиях 81
2.2.5.2. Распространение ЭДС в крупных свиноводческих хозяйствах России 82
2.2.5.3. Вакцинопрофилактика ЭДС в производственных условиях .83
2.2.5.4. Сравнительная эффективность двух вариантов живой вакцины против ЭДС 90
2.2.6. Одновременная и последовательная вакцинация свиней против ЭДС и ТГС .92
2.2.6.1. Антигенность моновалентных живых вакцин 94
2.2.6.2. Антигенность бивалентной живой вакцины (ЭДС+ТГС) 94
2.2.6.3. Одновременное введение вакцин ИС-ЭДС и ТР-1 95
2.2.6.4. Последовательная вакцинация супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС 96
3. Обсуждение результатов исследования 98
4. Выводы и практические предложения 118
5. Список литературы .121
6. Приложения 138
- Вирусные гастроэнтериты свиней
- Культуральные свойства и aттeнуация полевого изолята вируса ЭДС с целью получения вакцинного штамма
- Применение экспериментальной серии сухой вакцины в неблагополучном по ЭДС хозяйстве
- Одновременное введение вакцин ИС-ЭДС и ТР-1
Введение к работе
1.1. Актуальность темы
Эпизоотическая диарея свиней (ЭДС) является высококонтагиозным вирусным заболеванием свиней, характеризующимся изнурительной диареей и дегидратацией организма. Заболеванию подвержены свиньи всех возрастов, но наиболее восприимчивыми являются новорождённые поросята до двухнедельного возраста, смертность среди которых колеблется в пределах 30-100%. ЭДС по клиническим признакам, патологоанатомической картине и эпизоотологии очень сходна с трансмиссивным гастроэнтеритом свиней (ТГС). Фактически ТГС и ЭДС – заболевания-двойники, вызываемые двумя кишечными коронавирусами свиней, не имеющими антигенного родства. Оба заболевания характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью новорождённых поросят. Главными отличиями ЭДС являются отсутствие рвоты и более низкая смертность новорождённых поросят, более тяжёлое течение болезни у свиней в период откорма, а также латентное инфицирование и более медленное распространение. Летальность среди свиней, начиная с послеотъёмного возраста, составляет обычно 1-3 %. ЭДС, как правило, возникает внезапно и после одной или нескольких вспышек часто приобретает стационарный (энзоотический) характер.
В России ЭДС впервые обнаружена в крупных свиноводческих хозяйствах в 2006 г. (НПО НАРВАК). В полевых условиях разные штаммы вируса ЭДС обладают различной вирулентностью. Штаммы вируса, циркулирующие в странах Азии, в целом характеризуются более высокой вирулентностью по сравнению со штаммами, циркулирующими в странах Европы [Sueyoshi et al., 1995; Song and Park, 2012]. Причина данной географической зависимости неясна. Существенные экономические потери, причиняемые ЭДС некоторым странам азиатского региона, явились основанием для интенсивного изучения заболевания и его возбудителя. Можно выделить следующие направления исследований по ЭДС, в которых достигнут наибольший прогресс: этиология, эпизоотология, иммунобиология, диагностика и специфическая профилактика. Результаты исследований в данных направлениях являются научной основой для разработки эффективных мер борьбы против ЭДС. Изучены иммунобиологические свойства вируса ЭДС, особенности его репродукции in vitro, строение вириона и вирусного генома.
Центральным звеном в научном и практическом отношении явилась разработка метода культивирования вируса ЭДС вне организма. Решение этой важной и трудной задачи обеспечило возможность его выделения и изучения, а также разработки и изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Размножение вируса ЭДС в культуре клеток позволило лишить его вирулентности при сохранении защитных свойств, а также обеспечило возможность оценивать его биологическую и антигенную активность, что определило успех при разработке средств специфической защиты. Размножение вируса ЭДС in vitro связано с необычным явлением в биологии вирусов. Линии клеток естественного хозяина – свиньи (СПЭВ, ПП, РК-15 и др.), высокочувствительные к вирусу ТГС, оказались нечувствительными к вирусу ЭДС. В то же время линия клеток Vero, произошедшая от естественно нечувствительного хозяина – обезьяны, оказалась чувствительной к вирусу ЭДС, но не к вирусу ТГС. При выделении полевого вируса ЭДС в культуре клеток Vero после нескольких пассажей его репликация сопровождается выраженным ЦПЭ. Однако в этой уникальной по чувствительности к вирусу ЭДС культуре клеток он накапливается в невысоком титре не выше 6,0 – 7,0 lg ТЦД50 /мл даже после продолжительной адаптации [Song et al., 2003]. Серийное пассирование вирулентных штаммов вируса ЭДС в культуре клеток быстро приводит к снижению и потере вирулентности и получению аттенуированных вакцинных штаммов [Kweon et al., 1999]. Молекулярной основой аттенуации вируса ЭДС и её необратимости при серийном размножении в культуре клеток считается делеция в последовательности вспомогательного гена ORF3.
Многие вопросы эпизоотологии ЭДС остаются невыясненными, в частности, частота латентного инфицирования и носительство вируса ЭДС различными технологическими и возрастными группами свиней. Известно, что в хозяйствах при ЭДС острая инфекция чаще, чем при ТГС переходит в хроническую форму [Pensaert and Yeo, 2006]. В качестве возможного объяснения этому и другим особенностям ЭДС можно считать тропизм вируса in vivo - предпочтительное размножение вируса ЭДС в энтероцитах крипт тонкого кишечника свиней.
Предварительный диагноз ТГС/ЭДС ставят на основании клинических признаков, патологоанатомических изменений и эпизоотологических данных. Окончательный (этиологический) диагноз устанавливают на основании результатов лабораторных исследований. Лабораторная диагностика включает обнаружение вирусного антигена или вирусной нуклеиновой кислоты и специфических антител. Серологические методы, помимо диагностического значения, представляют ценность для оценки иммунитета в практических условиях. Наиболее чувствительным и специфическим методом дифференциальной диагностики ТГС/ЭДС является гнездовая (дуплексная) версию ПЦР [Kim et al., 2000, 2001]. Для дифференциации вирусов ЭДС и ТГС в практических условиях удобным оказался метод иммунохроматографии на стрипах [Kang et al., 2007].
Специфическая профилактика ЭДС представляет собой актуальную проблему для ряда стран с развитым свиноводством. Как и в случае ТГС, основу стратегии специфической профилактики ЭДС составляет пассивный лактогенный иммунитет, то есть иммунизация супоросных свиноматок и защита потомства антителами молозива и молока [Saif, Wesley, 1999]. Основным медиатором лактогенного иммунитета служит иммуноглобулин IgA, который нейтрализует вирус на поверхности слизистой оболочки и предупреждает развитие инфекции [Stokes, Waly, 2006]. Роль клеточного иммунитета в защите свиней от ЭДС не изучена [Song, Park, 2012].
Для специфической профилактики ЭДС в разных странах применяют различные живые вакцины из культуральных аттенуированных штаммов вируса ЭДС. Создание инактивированной вакцины против ЭДС представляется экономически невыгодным направлением. Живые вакцины вводят супоросным свиноматкам, как правило, внутримышечно, хотя одна группа авторов показала, что оральное введение вакцины приводит к более выраженному иммунитету у свиноматок и лучшей защите потомства от инфекции по сравнению с внутримышечным введением [Song et al., 2007]. Однако оральное введение неприемлемо при массовой вакцинации в условиях крупных свиноводческих хозяйств. Существуют опасения некоторых исследователей, что напряжённость иммунитета, индуцированного некоторыми коммерческими живыми вакцинами, часто недостаточна, так как после вакцинации свиноматок вирус ЭДС выделяется с фекалиями у экспериментально зараженных поросят примерно так же, как у серонегативных поросят контрольной группы [Yuan et al., 1998]. Однако главным критерием практической ценности живых вакцин против ЭДС является их безопасность и эпизоотическая эффективность, которая тесно коррелирует с уровнем лактогенного иммунитета (титр ВНА в молозиве и молоке) у вакцинированных свиноматок.
1.2. Цель и задачи исследования
Целью исследования являлась разработка эффективной живой вакцины против ЭДС и условий её применения в ветеринарной практике.
В задачи исследования входило:
-
Получить вакцинный культуральный штамм вируса ЭДС и изучить его антигенные (иммуногенные) свойства;
-
Определить генетическую основу аттенуации вируса ЭДС;
-
Оптимизировать условия размножения вакцинного штамма вируса ЭДС в перевиваемой культуре клеток;
-
Разработать условия изготовления и контроля живой сухой вакцины и режим её хранения;
-
Определить оптимальную схему вакцинации свиней в практических условиях;
-
Изготовить экспериментальные серии вакцины и испытать их эффективность в лабораторных и производственных условиях;
-
Изготовить производственные серии вакцины и испытать их в неблагополучных по ЭДС хозяйствах;
-
Изучить возможность одновременной иммунизации свиней против ЭДС и ТГС;
-
Составить и утвердить нормативную документацию на живую сухую вакцину против ЭДС в установленном порядке.
1.3. Научная новизна работы
Выявлено существенное различие между «вирусами-близнецами» ЭДС и ТГС при культивировании in vitro. Различие заключалось в том, что полевой вирус ЭДС вопреки общеизвестной закономерности не размножался в культуре клеток естественного хозяина – свиньи (линии клеток СПЭВ, ППС, РК-15), но размножался в культуре клеток нечувствительного вида – зелёной мартышки (линия клеток Vero). Вирус ЭДС размножался in vitro мене интенсивно, чем вирус ТГС. В культуре клеток Vero он накапливался незначительно даже после 40 пассажей (104,0 – 105,0 ТЦД50 / мл), что исключало возможность его использования для изготовления инактивированной вакцины. В результате пассирования полевого вирулентного вируса ЭДС в культуре клеток Vero получен авирулентный штамм ИС, отвечающий требованиям, предъявляемым к штаммам для изготовления живых вакцин. Вирулентность полевого вируса ЭДС исчезла относительно быстро (после 26 – 28 пассажей в культуре клеток Vero) и связана с делецией в гене ORF3. Длительное пассирование аттенуированного штамма ИС в культуре клеток Vero (110 пассажей) сопровождалось лишь незначительным повышением его инфекционности (105,0 – 106,3 ТЦД50 / мл) при сохранении антигенности. При аттенуации различных вирусов такое явление наблюдается редко и свидетельствует о необычной стабильности антигенных свойств штамма ИС вируса ЭДС при длительной репликации in vitro.
Определены условия удовлетворительного накопления вакцинного штамма ИС в культуре клеток Vero. Различные изменения условий культивирования не привели к повышению его репликации.
Ревакцинация свиней сопровождалась повышением иммунного ответа. Наилучшие результаты получены при двукратном внутримышечном введении вакцины ИС в дозе 104,0 ТЦД50 с интервалом 15-20 дней.
Одновременное введение инактивированной вакцины против ТГС и живой вакцины против ЭДС сопровождалось подавлением иммунного ответа против обоих заболеваний. Последовательное введение указанных вакцин супоросным свиноматкам с интервалом 21 день приводило к образованию выраженного иммунитета против каждого заболевания.
В период вспышки ЭДС (2008-2010 гг.) выявлены некоторые особенности течения болезни. В отдельных свиноводческих комплексах отмечена высокая заболеваемость свиней в период доращивания (>60%) и в период откорма (>90%), а также спонтанная латентная иммунизация свиноматок полевым вирусом и, как следствие, низкая заболеваемость поросят (около 20%) в возрасте до 2 недель.
1.4. Практическая значимость работы
На основании результатов исследований, представленных в диссертационной работе, впервые в России разработана и внедрена в ветеринарную практику сухая живая вакцина против эпизоотической диареи свиней (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) и определены условия её практического применения. Доказана безопасность и высокая эпизоотическая эффективность применения вакцины в промышленном свиноводстве. Разработаны и внедрены СТО на производственное изготовление сухой живой вакцины против ЭДС и инструкция по её применению. Вакцина ВЕРРЕС-ЭДС против эпизоотической диареи свиней используется в ветеринарной практике с 2008 года. Изготовление и применение вакцины проводится в соответствии с нормативной документацией, утверждённой и зарегистрированной в установленном порядке.
1.5. Личное участие автора
Экспериментальные исследования были выполнены автором лично либо при его непосредственном участии в коллективных работах. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в постановке целей и задач, планировании и проведении экспериментов и интерпретации полученных результатов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
1.6. Апробация
Основные положения диссертации опубликованы, доложены и одобрены на: заседаниях Учёного совета ООО Ветбиохим в 2008 – 2010 гг., заседаниях Учёного совета ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России, XVII Московском международном ветеринарном конгрессе (2009), V Международном конгрессе по вакцинам (Сиэтл, США, 2011).
1.7. Публикация результатов исследования
По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 11 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, в том числе 1 патент.
1.8. Объём и структура работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и практических предложений, списка литературных источников и приложений. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, включает 31 таблицу, 7 рисунков, 184 источника литературы.
1.8. Основные положения, выносимые на защиту
1. Выбор культуры клеток для размножения вируса ЭДС с целью изготовления вакцины
2. Получение вакцинного штамма ИС вируса ЭДС в результате пассирования в культуре
клеток
3. Оптимизация условий размножения вакцинного штамма ИС in vitro
4. Антигенность (иммуногенность) вакцинного штамма ИС при длительном пассировании в
культуре клеток
5. Разработка живой сухой вакцины из аттенуированного штамма ИС
6. Изготовление и контроль живой сухой вакцины против ЭДС в лабораторных
и производственных условиях
7. Разработка оптимальной схемы применения живой сухой вакцины против ЭДС
в ветеринарной практике
8. Результаты применения живой сухой вакцины против ЭДС в производственных условиях
Вирусные гастроэнтериты свиней
Патологию желудочно-кишечного тракта свиней вызывают вирусы пяти семейств: Coronaviridae, Reoviridae, Caliciviridae, Astroviridae и Adenoviridae. Однако, несмотря на это многообразие, ведущая роль в этиологии массовых острых гастроэнтеритов свиней и особенно поросят в неонатальный период развития принадлежит коронавирусам. По экономическому ущербу, причиняемому промышленному свиноводству, особое значение имеют коронавирусные гастроэнтериты: трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГС) и эпизоотическая диарея свиней (ЭДС) [3, 10, 11, 19]. ТГС и ЭДС – два массовых вирусных диарейных заболевания свиней, очень сходные по характеру течения, клиническим проявлениям, патологоанатомической картине и патоморфологическим изменениям. Много общего имеет их эпизоотология. Фактически ТГС и ЭДС – заболевания-двойники, вызываемые двумя кишечными коронавирусами свиней, не имеющими антигенного родства. Оба заболевания характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью новорожденных поросят. Поскольку поросята заболевают и гибнут в первые дни жизни, возможность их активной иммунизации исключается.
Вирус ТГС является более патогенным по сравнению с вирусом ЭДС. Он вызывает гибель 80-100% поросят до 10-дневного возраста. Более выраженная патогенность вируса ТГС обусловлена более масштабным разрушением энтероцитов от основания до вершины ворсинок тонкого кишечника (рис. 1А). Инфицированные энтероциты разрушаются и слущиваются в просвет кишечника, ворсинки быстро атрофируются. В первые сутки после заражения резко нарушается пищеварение и всасывание и развивается диарея, следствием которой является тяжелая дегидратация. Потеря воды с фекалиями у поросят в первые дни после рождения достигает 150 мл в сутки. У поросят 3-недельного возраста энтероциты поражаются только в отдельных участках тощей и подвздошной кишок [10].
Вирус ЭДС размножается в энтероцитах нижней части ворсинок и крипт (рис. 1 Б). По-видимому, по этой причине вирус ЭДС вызывает менее интенсивную диарею и меньшую смертность по сравнению с вирусом ТГС, но по той же причине может длительно персистировать в кишечнике животных [122, 126]. 1.2.2. Систематика вируса ЭДС
Возбудителем ЭДС является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Соronaviridае (порядок Nidovirales). На основе антигенных и генетических критериев вирус ЭДС вместе с коронавирусами человека NL63 и 229 Е и несколькими коронавирусами летучих мышей принадлежат роду Alphacоronavirus (до недавнего времени антигенная группа 1) [67, 142]. В данный род также входит недавно установленный вид альфакоронавирус 1, который включает вирусы, недавно считавшиеся самостоятельными видами: вирус ТГС, коронавирус собак, коронавирусы кошек типов I, II и вирус инфекционного перитонита кошек [49].
Вирионы вируса ЭДС обладают всеми характеристиками семейства Соronaviridае [35, 124]. Они представляют собой плеоморфные частицы диаметром 95-190 (в среднем 130) нм (Рис. 2 А). Они состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются характерные радиальные булавовидные пепломеры (выступы) длиной 18-23 нм, формирующие «корону» [55, 160].
Плавучая плотность вирионов вируса ЭДС в градиенте сахарозы равна 1,18 г/см3. Адаптированный к культуре клеток вирус ЭДС теряет инфекционность при 600С в течение 30 мин, но сохраняет стабильность при 500С. При 40С вирус стабилен при рН 4,0 - 9,0, при 370С он стабилен при рН 6,5-7,5 [28, 98]. Вирус ЭДС является чувствительным к эфиру, хлороформу и другим жирорастворителям, детергентам и ультрафиолетовым лучам, быстро инактивируется формалином (0,03%). 1.2.5. Структурные белки В вирионах вируса ЭДС обнаружено 4 белка. В состав липопротеидной оболочки вирионов входят поверхностный (пепломерный) гликопротеин S, формирующий выступы, большой мембранный гликопротеин М и негликозилированный белок оболочки Е. С вирусной РНК ассоциирован негликозилированный белок N, вместе они формируют спиральный нуклеокапсид (рис. 2 Б) [110, 131].
Белок S является гликопротеином типа I. Он состоит из 1 383 аминокислотных остатков (штамм CV777) и имеет молекулярную массу 150-220 кД (различных штаммах вируса). Гликопротеин S отвечает за адсорбцию вирионов на энтероцитах кишечника посредством связывания вириона с клеточными рецепторами и за слияние липопротеидной оболочки вируса с плазматической мембраной клетки [51, 135, 162]. Для вируса ЭДС выявлена связь между белком S, адаптацией вируса к размножению в культуре клеток и вирулентностью [118, 144]. Гликопротеин S также обусловливает гемагглютинирующую активность вируса ТГС, однако вирус ЭДС гемагглютинирующей активностью не обладает [28]. Гликопротеин S индуцирует синтез вируснейтрализующих антител (ВНА), в его составе идентифицированы четыре вируснейтрализующих эпитопа [34, 42, 65, 78, 161].
Белок М (20-30 кД) является наиболее многокопийным компонентом вирионной оболочки. Он представляет собой структурный мембранный гликопротеин, трижды пронизывающий мембрану, с коротким N-концевым доменом на поверхности вириона и долгим С-концевым доменом внутри [79, 168]. Показано, что гликопротеин М играет важную роль в процессе сборки вирионов [113, 134], в чём не исключено также участие белка Е (7 кД) [22]. Гликопротеин М индуцирует синтез антител, способных нейтрализовать вирус в присутствии комплемента [135], и, возможно, альфа интерферона [97].
Культуральные свойства и aттeнуация полевого изолята вируса ЭДС с целью получения вакцинного штамма
Полевой вирус эпизоотической диареи свиней (ЭДС) был передан в ЗАО НПО НАРВАК в виде культуральной жидкости. Данный вирус был выделен в культуре клеток Vero из кишечника больного поросёнка и к моменту передачи прошёл шесть серийных пассажей в культуре клеток Vero. 2.2.1.1. Серийное пассирование вируса в культуре клеток Vero и оценка его аттенуации Прежде всего, предстояло выяснить культуральные и вирулентные свойства полученного вируса. Выявление спектра чувствительных линий клеток естественного хозяина представляло интерес с целью выбора наиболее пригодного клеточного субстрата для исследовательских и производственных целей. На первом этапе исследовали чувствительность линий клеток СПЭВ и ППК, используемых в работе с вирусом ТГС. В отличие от линии клеток Vero, обе линии клеток оказались нечувствительными к вирусу ЭДС. Поэтому для дальнейших исследований и прежде всего для аттенуации вируса ЭДС использовали линию клеток Vero.
В процессе решения различных задач вирус ЭДС прошёл более 100 серийных пассажей в культуре клеток Vero. Размножение вируса постоянно сопровождалось характерным ЦПЭ, который выражался в интенсивном формировании вакуолизированных синцитиев, сливающихся в симпласты (рис. 6). По мере пассирования период наступления выраженного ЦПЭ постепенно сокращался, а накопление вируса постепенно повышалось. Так, в течение первых 20 пассажей вирус накапливался в титре 3,0-3,5 lg ТЦД50/мл, а после 40 пассажей титр вируса был в пределах 4,0-5,0 lg ТЦД50/мл.
Результаты проведенных исследований (таблица 1) показали, что время наступления цитопатического эффекта и накопления вируса зависели от длительности пассирования и множественности заражения культуры клеток Vero. После 80 пассажей вирус накапливался максимально в титре 5,50 – 6,50 lg ТЦД50/мл.
Начиная с 40 пассажа, вирус периодически использовали для изготовления экспериментальных образцов живой вакцины.
С целью аттенуации полевой вирус серийно пассировали в культуре клеток Vero. Вирулентность культурального вируса ЭДС на уровне 15, 26 и 30 пассажей в культуре клеток Vero изучали в опытах на 2-3-дневных безмолозивных поросятах, полученных от свиноматок, серонегативных к вирусам ЭДС и ТГС. Культуральную вируссодержащую жидкость поросятам вводили орально в объёме 2 мл. Доза вируса составляла 3,33 lg ТЦД50 (15 пассаж) и 3,66 lg ТЦД50 (26 и 30 пассажи). Каждый вариант вируса вводили двум поросятам. В течение опыта (7 дней) поросят содержали при температуре 25-270С и в течение первых суток после заражения кормили стерилизованным коровьим молоком через соску каждые 4-6 часов. Вирус 15 пассажа вызвал слабовыраженную диарею через 16 часов после введения, которая прекратилась через 48 часов. У поросят, которым ввели вирус 26 пассажа, отклонений от нормального состояния не отмечали в течение всего периода наблюдения. Безмолозивные поросята, которым ввели вирус 30 пассажа, оставались нормальными в течение всего периода наблюдения (7 дней).
Из результатов этого опыта следует, что после 25-30 серийных пассажей в культуре клеток Vero вирус ЭДС полностью утратил вирулентность для новорождённых поросят.
Авирулентный штамм вируса ЭДС получил название ИС (по названию страны первичного выделения вирулентного вируса - Испания). Штамм ИС депонировали в коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (удостоверение ГКВ 2467 от 08.10.2009). В дальнейшем его использовали в исследовательских целях и разработке живой вакцины.
Антигенные свойства штамма ИС, аттенуированного в культуре клеток
Vero, определяли на серонегативных к вирусу ЭДС поросятах послеотъёмного возраста (35-40 дней). Поросят иммунизировали внутримышечно, однократно. Через 21 день после введения вируса определяли титр ВНА в сыворотке крови.
В первом опыте вирус, прошедший 40 пассажей в культуре клеток Vero, вводили в дозе 4,0 и 5,0 lg ТЦД50. Введение вируса вызывало образование ВНА в титре 1:32 – 1:40 и 1:60 – 1:80 соответственно дозе инокуляции. Данные этого опыта показали антигенность вакцинного штамма вируса ЭДС для свиней, степень которой зависит от дозы вакцины.
В следующем опыте с целью определения возможного диапазона пассирования вакцинного штамма ИС без снижения его антигенной активности исследовали вирус 40, 60 и 80 пассажей в культуре клеток Vero. Вирусом одного уровня пассажа прививали группу 35-40-дневных поросят, которых в соответствии с технологией в период доращивания содержали в одном секторе (53-71 голов). Доза иммунизации составляла 4,0 lg ТЦД50. Титр ВНА в сыворотке крови определяли у 5 поросят из каждого сектора.
Результаты исследования показали, что штамм ИС, прошедший 40, 60 и 80 пассажей в культуре клеток Vero, не различается по антигенной активности для свиней. Поросята, иммунизированные вирусом всех трёх уровней пассажа, развили антительный ответ сходной интенсивности. Титр ВНА составлял 1:30 – 1:40 (таблица 2).
Применение экспериментальной серии сухой вакцины в неблагополучном по ЭДС хозяйстве
Первую пробную серию сухой вакцины, изготовленную в конце 2008 г., применили в начале 2009 г. с целью испытания в неблагополучном по ЭДС хозяйстве СПК «Агрофирма Красная Звезда» Вологодской области. Результаты применения данной серии вакцины имели прототипное значение для дальнейшего массового изготовления и применения вакцины в неблагополучных по ЭДС хозяйствах. Экспериментальная серия сухой вакцины, приготовленная из вируса 40-45 пассажа в культуре клеток Vero, имела активность 4,0 lg ТЦД50 /мл. Свиней прививали двукратно с интервалом 15 дней в объёме 2 мл. Супоросных свиноматок и ремонтных свинок прививали на 75-80 и 90-95 дни супоросности (примерно за 40 и 25 дней до опороса). Кроме того, прививали двукратно поросят в возрасте 30-35 дней. Специфическую сероконверсию, обусловленную вакцинацией, оценивали по титру ВНА в сыворотке крови привитых животных (таблица 20) и в молозиве свиноматок через сутки после опороса (таблица 21), а также в крови поросят через 2, 4, 7 и 15 дней после рождения (таблица 22). Результаты исследования, приведённые в таблице 20, показали, что сухая вакцина в дозе 4,0 lg ТЦД50 /мл вызывала выраженную сероконверсию у всех трёх групп свиней, особенно после двукратного применения. Кроме того, вакцинация поросят в послеотъёмный период показала возможность их использования при оценке вакцины в зависимости от дозы и схемы вакцинации. В данном неблагополучном по ЭДС хозяйстве специфическая серопозитивность перед вакцинацией была наиболее выраженной у основных свиноматок, по-видимому, за счёт предшествовавшего латентного инфицирования полевым вирусом (одна из характерных особенностей течения ЭДС в полевых условиях).
Исследование колострального иммунитета у двукратно вакцинированных свиней показало наличие в молозиве в день опороса специфических ВНА в высоком титре. У основных свиноматок – 1:120 –1:320, у ремонтных свинок – 1:120 – 1:240 (таблица 21).
Анализ динамики колостральных антител в сыворотке крови поросят в течение первых 15 дней жизни (таблица 22) показал постепенное снижение концентрации ВНА более чем в 3 раза (с 1:190 до 1:60). Исходя из этих данных можно заключить, что период полужизни колостральных антител против вируса ЭДС составляет около 7 дней.
В неблагополучных по ЭДС хозяйствах применяли три разработанные в НПО НАРВАК варианта вакцины против ЭДС: инактивированную «кишечную», живую замороженную и живую сухую. При изготовлении производственных серий сухой вакцины использовали технологию, разработанную для изготовления экспериментальных серий сухой вакцины (раздел 2.2.3.1). В 2010-2011 гг изготовлено восемь серий сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС. Лиофилизацию вакцины проводили в аппарате Christ Epsilon. Использовали вирус, прошедший 60 - 100 пассажей в культуре клеток Vero, с титром инфекционной активности 5,50 - 6,33 lg ТЦД50 / мл. Перед лиофилизацией смесь вируссодержащей жидкости с защитной средой расфасовывали по 1 мл в 3 см3 флаконы, как описано в разделе Материалы и методы. Количество флаконов с вакциной в одной серии значительно различалось, от 1500 до 30 000. После определения активности вируса в сухой вакцине рассчитывали число прививочных доз вакцины в единице фасовки (1 мл во флаконе), исходя из значения 4,00 lg ТЦД50 для одной Из данных, представленных в таблице 23, видна прямая зависимость снижения титра инфекционной активности вируса с увеличением объёма серии сухой вакцины. Так, например, при лиофилизации вакцины объёмом 1,2 – 2,3 л (серии 1-3) потеря инфекционности вируса составила 0,66 lg ТЦД50 / мл, тогда как при лиофилизации вакцины объёмом 12 – 21,5 л (серии 4-8) потеря инфекционности составила 0,83 – 1,00 lg ТЦД50 / мл. Однако следует отметить, что указанное различие не выявлялось при испытании серий вакцины методом ускоренного старения.
Одновременное введение вакцин ИС-ЭДС и ТР-1
Приведённые выше данные показали, что при одновременном применении вакцины против ТГС (инактивированная вакцина ТР-1) и ЭДС (живая вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) защитный эффект вакцинации против ТГС может быть значительно снижен. Кроме того, возникают технические неудобства (введение вакцин с двух сторон шеи), Поэтому представлялось целесообразным изучить эффективность последовательной вакцинации супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС. В опыте использовали две группы по 7 супоросных свиноматок. Одну группу супоросных свиноматок (группа 1) вакцинировали вначале против ТГС (вакцина ТР-1), а спустя 21-30 дней – против ЭДС (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС). Другую группу супоросных свиноматок (группа 2) вакцинировали вначале против ЭДС, а спустя 21-30 дней – против ТГС. В каждой группе вакцинировали по 7 серонегативных свиноматок. Кровь для определения титра ВНА у свиноматок обеих групп брали дважды через 21 день после введения первой вакцины и через 21 день после введения второй вакцины. Результаты этого опыта (таблица 31) показали, что при последовательной вакцинации супоросных свиноматок против ТГС (вакцина ТР-1), а затем против ЭДС (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) и наоборот с интервалом между вакцинациями 21 день антигенность указанных вакцин не снижается. Для гуморального иммунитета не имеет существенного значения, какую из двух вакцин применяли сначала, а какую - потом. Такая схема вакцинации удобна для практического применения против обоих заболеваний и может быть использована в случае необходимости.
Вакцинопрофилактика по праву считается одним из выдающихся достижений биологической науки, характерной чертой развития которой является быстрое использование достижений в других областях науки. Благодаря этому достигнуты большие успехи в борьбе со многими опасными инфекционными заболеваниями человека и животных. Например, с помощью глобальной вакцинопрофилактики в мире искоренена натуральная оспа человека (1979 г.), создан эффективный контроль других опасных заболеваний человека, таких как полиомиелит, грипп, корь, бешенство и другие.
Значительный успех достигнут в ликвидации и профилактике многих глобальных вирусных болезней животных (ящур, классическая чума свиней, чума жвачных, ньюкаслская болезнь птиц и др.).
Специфическая профилактика многих инфекционных болезней сельскохозяйственных животных достигла исключительно широких масштабов и стала неотъемлемой частью технологии промышленного животноводства развитых стран. Изготовление некоторых вакцин исчисляется миллионами и миллиардами доз. Центральным звеном разработки и производства современных вирусных вакцин является размножение вирусов в культуре клеток.
Размножение вирусов млекопитающих и птиц in vitro стало основным методом вирусологии, особенно при изготовлении средств специфической профилактики. За небольшим исключением (калицивирусы, торовирусы, вирусы папилломы человека, геморрагической болезни кроликов, гепатита Е), вирусы человека и животных успешно выращивают in vitro. Оказалось, что разные вирусы значительно различаются по спектру чувствительности культур клеток, способных поддерживать их репликацию. Одни вирусы размножаются в клетках многих типов первичных культур и линий, другие – только в клетках некоторых линий. Например, представители семейств пикорнавирусов и парвовирусов как правило реплицируются в культурах клеток натуральных хозяев, тогда как рабдовирусы обладают широким хозяинным спектром in vitro. Представители семейства парамиксовирусоув значительно различаются между собой по широте хозяинного спектра in vitro. Вообще спектр чувствительных культур клеток к данному вирусу предсказать невозможно. Наиболее чувствительный клеточный субстрат устанавливают экспериментальным путём или на основе данных литературы.
Выбор наиболее продуктивной культуры клеток для данного вируса часто является непростой задачей. Даже при размножении в наиболее чувствительной культуре разные вирусы существенно различаются по уровню накопления, особенно инфекционного вируса. Например, полиовирус и вирус ящура в элективных культурах клеток накапливаются в высоком титре (107 – 109 ТЦД50/мл). Вирус везикулярного стоматита обладает широким хозяинным спектром in vitro и высоким накоплением [9]. Оказалось, что клетки естественно восприимчивого вида, не являясь клетками-мишенями in vivo, могут приобрести высокую чувствительность к вирусу после размножения в культуре клеток. Например, размножение нейротропного вируса полиомиелита в культуре клеток почки приматов стало открытием, положившим начало новому направлению в вирусологии. Другим примером является эпителиотропный вирус ящура, который прекрасно размножался в культуре клеток почки телят. Можно привести множество подобных примеров, которые свидетельствуют об изменении рецепторного аппарата клеток в результате их эксплантации и размножения in vitro.
Уровень накопления вируса в культуре клеток позволяет сделать важный выбор в пользу изготовления живой или инактивированной вакцины. При низком накоплении вируса остаётся возможность изготовления только живой вакцины. Возможность крупномасштабного изготовления культуральных инактивированных вакцин против полиомиелита и ящура является счастливым исключением и венцом биотехнологии 20-го века. Вирус для первой вакцины размножают в первичной культуре (субкультуре) клеток почки обезьян, для второй – в культуре клеток почки сирийского хомяка (в реакторах большой ёмкости 1000 л). Особенно важная роль культурам клеток принадлежит в разработке и производстве средств специфической профилактики вирусных заболеваний человека и животных. За небольшим исключением, вирусы человека и животных размножают in vitro. Однако они значительно различаются между собой по спектру чувствительных культур клеток и интенсивности репликации. Одни вирусы обладают широким спектром чувствительных культур клеток, другие – узким. Например, представители семейств пикорнавирусов и парвовирусов, как правило, реплицируются в культурах клеток естественных хозяев, тогда как рабдовирусы обладают более широким спектром чувствительных клеток независимо от их происхождения. Представители одного и того же семейства вирусов могут значительно различаются между собой по широте хозяинного спектра клеточных культур. Как правило, чувствительными к каждому конкретному вирусу оказываются культуры клеток (первичные, субкультуры, перевиваемые линии), происходящие от естественно восприимчивого вида.
