Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Эпизоотология заболеваний, специфическая профилактика и оценка ее эффективности при РМ, НБ, ИБК и ССЯ-76 8
2.2. Вакцинация - основа эпизоотического благополучия в промышленном птицеводстве 21
2.3. Общая характеристика инактивированных вакцин 22
2.4. Подбор микроорганизмов для инактивированных вакцин 24
2.5. Характеристика инактивантов вакцинных антигенов 26
2.6. Основные классы иммуноадъювантных веществ и их краткая характеристика 30
3. Собственные исследования 35
3.1. Материалы и методы 35
3.1.1. Материалы исследований 35
3.1.2. Методы исследований 37
3.2. Результаты собственных исследований 51
3.2.1. Создание инактивированной эмульсионной вакцины против респираторного микоплазмоза птиц 51
3.2.1.1. Подбор оптимальных препаратов для инактивации микробной массы штамма «S6» М. gallisepticum 51
3.2.1.2. Подбор оптимального масляного адъюванта для изготовления инактивированной эмульсионной моновакцины против РМ 53
3.2.1.3. Определение оптимальной концентрации антигена М. gallisepticum в инактивированной эмульсионной вакцине 55
3.2.1.4. Определение антигенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против РМ при введении ее разными методами 57
3.2.1.5. Определение антигенных и физических свойств вакцины инактивированной эмульсионной против РМ при хранении 59
3.2.1.6. Производственные испытания вакцины инактивированной эмульсионной против РМ 61
3.2.2. Усовершенствование технологии изготовления ассоциированной вакцины против ИБК, НБ и ССЯ-76 инактивированной эмульсионной 63
3.2.2.1. Сравнительное испытание ассоциированной вакцины против ИБК, НБ и ССЯ-76 изготовленной на основе адъювантов «АВИВАК» и «ISA-70 VG» 63
3.2.2.2. Определение антигенных и физических свойств вакцины инактивированной эмульсионной против ИБК, НБ,ССЯ-76 при хранении 67
3.2.3. Лабораторные испытания ассоциированных инактивированных эмульсионных вакцин 70
3.2.4. Оценка иммунологической активности инактивированных вакцин против «РМ» и «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» 78
4. Обсуждение результатов исследования 82
5. Выводы 92
6. Предложения для практики 93
7. Список опубликованных работ по теме диссертации 94
8. Список сокращений 95
9. Список литературы 96
10. Приложения 121
- Эпизоотология заболеваний, специфическая профилактика и оценка ее эффективности при РМ, НБ, ИБК и ССЯ-76
- Определение антигенных и физических свойств вакцины инактивированной эмульсионной против РМ при хранении
- Определение антигенных и физических свойств вакцины инактивированной эмульсионной против ИБК, НБ,ССЯ-76 при хранении
- Оценка иммунологической активности инактивированных вакцин против «РМ» и «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76»
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время проблема смешанных инфекций в промышленном птицеводстве чрезвычайно актуальна в связи с возрастающей частотой проявления ассоциированных форм патологии птиц. При смешанных вирусных и вирус-бактериальных инфекциях затруднена не только своевременная и точная диагностика болезни, но также снижается эффективность противоэпизоотических мероприятий, что наносит существенный экономический ущерб отрасли (Алиев А.С. и др., 2013). Одним из эффективных средств профилактики инфекционных болезней является применение ассоциированных вакцин включающих как вирусные, так и бактериальные антигены (Рождественская Т.Н., Панкратов С.В. и др., 2010).
Главным преимуществом ассоциированных инактивированных вакцин по сравнению с моновакцинами, как известно, является: создание у привитых птиц напряженного и продолжительного иммунитета одновременно к нескольким возбудителям, сокращение количества вакцинаций и стрессовых факторов, снижение трудозатрат на проведение иммунизации (Борисов В.В. и др., 2009).
Смешанные инфекции очень часто сопровождаются проявлением респираторного синдрома, ключевую роль в развитии которого играет Mycoplasma gallisepticum (Рождественская Т.Н. Борисенкова А.Н., и др., 2006).
За рубежом для специфической профилактики респираторного микоплазмоза (РМ) широко применяют инактивированные масляно-эмульсионные вакцины (Б.У. Кэлнек, 2011).
В отечественной литературе имеются данные по применению моновакцины против РМ (Гирин М.В., 2004; Зоткин Г.В. и др., 2004; Черняева Е. и др., 2007) и различные варианты ассоциации с вирусными антигенами (Джавадов Э.Д. и др., 2007, 2009; Дубовой А.С. и др.,2004). Однако, авторы не приводят сведения об основных параметрах технологии их производства, а также о результатах испытаний эффективности вакцин с многокомпонентным составом в экспериментальных и производственных условиях.
В связи с этим исследования, по разработке технологии изготовления и схем применения отечественной моновакцины против РМ птиц и ее ассоциированных форм с антигенами инфекционного бронхита кур (ИБК), ньюкаслской болезни (НБ), синдрома снижения яйценоскости (ССЯ-76) и реовирусной инфекции (РЕО) являются весьма актуальными и соответствуют требованиям современного промышленного птицеводства.
Цель и задачи исследований. Цель исследований – усовершенствование технологии изготовления и контроля качества инактивированной эмульсионной вакцины против РМ и её ассоциированных форм с вирусными антигенами (ИБК, НБ, ССЯ-76 и РЕО) и оценка протективных свойств полученных препаратов.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить ряд задач:
- отработать методику инактивации M. gallisepticum;
- подобрать адъювант, обеспечивающий физические свойства, безвредность и повышение антигенной активности моновакцины против РМ и её ассоциированных составляющих компонентов против вирусных болезней птиц;
- разработать технологию производства и методов контроля вакцин против «РМ» и «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76»;
- оценить эффективность разработанных препаратов в лабораторных и производственных условиях;
- организовать промышленное производство инактивированной эмульсионной вакцины против РМ и её ассоциированных форм с вирусными антигенами (ИБК, НБ, ССЯ-76 и РЕО) и внедрить их в ветеринарную практику.
Научная новизна. Усовершенствован технологический процесс изготовления вакцины инактивированной эмульсионной против респираторного микоплазмоза птиц, включающий отработку режима инактивации M. gallisepticum теотропином и мертиолятом, определено оптимальное содержание антигена в одной иммунизирующей дозе, предложены методы контроля качества серий биопрепарата, сроков и режима её хранения.
Подобран масляный адъювант обеспечивающий высокую антигенную активность и ареактогенность моно- и ассоциированных форм эмульсионных вакцин против респираторного микоплазмоза птиц .
Теоретически обоснована и внедрена технология промышленного производства ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» с учетом оптимального соотношения антигенных компонентов и адъюванта. Доказана высокая протективная эффективность вакцины в лабораторных условиях.
Практическая значимость работы. На основании полученных результатов разработаны и утверждены:
- Регламент производства вакцины инактивированной эмульсионной против респираторного микоплазмоза птиц «АВИВАК-РМ»;
- Технические условия (ТУ) 9384-002-46262188-04 на инактивированную эмульсионную вакцину против респираторного микоплазмоза птиц «АВИВАК-РМ»;
- Инструкция по применению вакцины инактивированной эмульсионной против респираторного микоплазмоза птиц «АВИВАК-РМ»;
- Вакцина инактивированная эмульсионная против респираторного микоплазмоза птиц «АВИВАК-РМ» зарегистрирована в РФ (регистрационное свидетельство лекарственного препарата для ветеринарного применения 29-1-5.12-0572№ПВР-1-3.5/01540);
Подготовлен и утвержден проект документации на ассоциированную вакцину инактивированную эмульсионную против РМ, ИБК, НБ и ССЯ-76, который рассмотрен и одобрен на заседании научно-технического совета НПП «АВИВАК» (протокол № 3 от 12.03.2012г.).
В период с 1.01. 2006 г. и по настоящее время выпущено и применено 12,5 млн. доз вакцины «АВИВАК-РМ».
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
- методика инактивации штамма «S6» M. gallisepticum теотропином и мертиолятом;
- компонентный состав и иммунобиологические свойства вакцины инактивированной эмульсионной против РМ;
- компонентный состав, иммунобиологические и физико-химические свойства ассоциированной вакцины инактивированной эмульсионной «АВИВАК-РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» и «АВИВАК-РЕО+РМ»;
- эффективность применения моновакцины «АВИВАК-РМ» и ассоциированной вакцины инактивированной эмульсионной «АВИВАК-РМ+ИБК+НБ-ССЯ-76»;
- результаты производственных испытаний вакцины «АВИВАК-РМ».
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Эффективность ведения промышленного птицеводства в современных условиях» (Санкт-Петербург, 2009 - 2013 г., на VI и VII Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (Москва, 2010 и 2011 гг.) и на заседании Научно-технического совета НПП «АВИВАК» (2013 г.).
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.
Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 130 страницах компьютерного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения. Список использованной литературы включает 225 источников, из которых 105 зарубежных. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 5 рисунками. Приложение включает 5 документов, подтверждающих достоверность результатов исследований.
Эпизоотология заболеваний, специфическая профилактика и оценка ее эффективности при РМ, НБ, ИБК и ССЯ-76
Респираторный микоплазмоз птиц (РМ) - инфекционная субклиническая или хронически протекающая болезнь птиц, для которой характерны поражения органов дыхания и глаз - насморк, чихание, воспаление носовых и подглазничных синусов, воздухоносных мешков, конъюнктивы глаза.
Основным возбудителем РМ является Mycoplasma gallisepticum, хотя сходную симптоматику могут вызывать и другие, менее патогенные виды микоплазм, в т.ч. М. sinoviae, М. meleagridis и М. iowae [26].
Микоплазмы - самые маленькие саморегулирующие формы жизни на нашей планете. Клетки плеоморфные, от сферических или грушевидных (0,3-0,8 мкм в диаметре) до тонких разветвленных нитей, варьирующих по длине от нескольких до 150 мкм. Грамотрицательные. Они не имеют истинной клеточной стенки, а ограничены лишь трехслойной липопротеидной цитоплазматической мембраной. Эволюция позволила им стать факультативными внутриклеточными паразитами, следовательно, труднодоступными для факторов иммунитета, антибиотиков и химиотерапевтических препаратов [90,140].
Респираторный микоплазмоз, вызванный М. gallisepticum, регистрируется во всех странах мира, где птицеводство ведется на промышленной основе. Наиболее восприимчивы к нему куры (цыплята 20-45-сут возраста и куры-несушки в период начала и на пике яйцекладки) и индейки, в меньшей степени - фазаны, цесарки, павлины, куропатки, перепелки и комнатные птицы [8, 49, 75].
В возникновении болезни большое значение имеет инфицированность птицы эшерихиями, стафилококками, синегнойной палочкой, пастереллами ослабленной вирулентности, орнитобактериями, вирусами ГП, НБ, ИБК, ИЛТ, МПВИ, способными как в ассоциации с микоплазмами, так и самостоятельно вызвать респираторный синдром [181]. Это значительно затрудняет своевременную постановку диагноза и разработку мер борьбы [13, 17, 34, 55, 63].
РМ занимает одно из лидирующих мест в инфекционной патологии птиц и наносит огромные экономические убытки. Например, экспериментальное заражение суточной бульонной культурой М. gallisepticum индеек, полученных из хозяйства, благополучного по инфекционным болезням, вызвало задержку яйцекладки до 280-285-дневного возраста, что на 4 недели превышает нормативный возраст, а часть индеек (10%) вообще не начала яйцекладку. При последующей яйцекладке количество неоплодотворенных яиц составило 66%, при 25% в контроле. Вывод индюшат составил 29,0 % от заложенных и 57,8% от оплодотворенных яиц, в то время как в контрольной группе (от неинфицированных индеек) эти показатели составили 52,0 и 93,7%, соответственно [89].
Аналогичных примеров экономических потерь при РМ можно привести множество.
Для успешной борьбы с респираторным микоплазмозом необходима правильная и своевременная диагностика болезни [151].
Диагноз на РМ ставят комплексно с учетом эпизоотологической ситуации, клинического и патологоанатомического проявления болезни, данных лабораторных исследований, в т.ч. изоляции и идентификации возбудителя, выявления специфических антител в сыворотке крови птицы и молекулярное обнаружение нуклеиновой кислоты методом ПЦР.
Для серологической диагностики РМ пользуются СКРА (пробирочным или микрометодом на стекле) и ИФА. Отечественные тест-системы СКРА выпускают ГНУ «ВНИВИП», НПП «АВИВАК» и ФГУ «ВНИИЗЖ», а ИФА -НПП «АВИВАК» и ФГУ «ВНИИЗЖ». Благодаря высокой чувствительности и специфичности данные тесты позволяет контролировать динамику энзоотии микоплазмозов, корректировать сроки вакцинации и обоснованно планировать профилактическое применение лекарственных препаратов.
Кроме того, разработаны различные варианты ПЦР-диагностики, которая позволяет выявить возбудитель, а не наличие к нему антител [180, 186]. Однако имеются данные, что у кур-несушек ПЦР лучше всего выявляет М. sinoviae ( в 18 из 19 хозяйств), в то время как М. gallisepticum не обнаружена ни в одном случае. Кроме того были получены различные результаты из лабораторий, использующих один и тот же коммерчески доступный ПЦР-набор, специфичный для определения микоплазм. Следовательно, диагностика, основанная на ПЦР, имеет свои ограничения, в первую очередь связанные с материальными затратами и наличием специализированных лабораторий.
Обеспечение эпизоотического благополучия птицехозяйства в отношении респираторного микоплазмоза гарантирует увеличение продуктивности несушек и бройлеров, повышение эффективности использования кормов, повышение сохранности птицепоголовья и в целом улучшение производственных и финансово-экономических показателей предприятия.
Контроль респираторного микоплазмоза предусматривает три основных подхода: поддержание стад, свободных от патогенов, включая методы комплектования и биобезопасности; лечение и профилактику для предотвращения клинических признаков и снижения экономических потерь; вакцинацию против М. gallisepticum и М. synoviae [14].
Первое направление является наиболее эффективным способом контроля, однако достичь этого уровня очень сложно, так как требуются значительные материальные затраты и возможны рецидивы микоплазменной инфекции [67].
Самым распространенным, на сегодняшний день, средством борьбы с респираторным микоплазмозом являются химиотерапевтические препараты. При правильном подборе антимикоплазменных средств инфекцию можно подавить, при этом вовсе не обязательно полное удаление возбудителя из организма, что практически сделать невозможно. Этим решается задача снижения давления микоплазм на организм птицы и получения генетически запланированной продуктивности птиц.
Наиболее эффективными средствами лечения являются антибиотики, ингибирующие синтез белка: тилан, тилозин, тиамулин, фармазин, фрадизин, тиланик, а также синергические препараты в сочетании с указанными антибиотиками [12, 13, 27, 56, 157, 171, 185].
Тем не менее, применение антибактериальных препаратов с целью профилактики респираторного микоплазмоза за последние годы значительно уменьшилось, что связано с проблемой резистентности к ним у человека, потребляющего продукты птицеводства. Поэтому возрос интерес к специфической профилактике этой болезни [11].
С этой целью разработаны и применяются на практике живые и инактивированные вакцины. Живые вакцины готовят из авирулентных и слабовирулентных штаммов М. gallisepticum (R, F, 6/85, TS-11) [173, 209, 217]. Куры хорошо переносят широко применяемую за рубежом живую вакцину из штамма F [145, 154, 155], но она является вирулентной для индеек, ее не следует использовать одновременно с вакцинами против других респираторных болезней птицы (ныокаслской болезни , инфекционного бронхита и т.д.) из-за риска развития респираторного заболевания и аэросаккулита. Штамм F распространяется от привитого птицепоголовья к контактирующим с ним не иммунизированным птицам, авирулентные вакцинные штаммы ts-11 и 6/85 -распространяются в очень незначительной степени [141, 142, 161, 162, 197, 202].
Первичную иммунизацию живыми вакцинами обычно проводят цыплятам в возрасте 12-16 недель. При угрозе заноса инфекции в благополучные стада цыплят можно прививать, начиная с 2-4-недельного возраста. Эти препараты вводят птице назально, окулярно или распыляют в виде аэрозоля. Метод введения зависит от свойств вакцинного штамма. Тем не менее, имеются данные, что применение вакцины 6/85 приводило к синдрому опухания синусов и 2-кратному повышению уровня смертности среди 83-недельных кур-несушек. Методом ПЦР констатировали появление 6/85-подобных штаммов с повышенной вирулентностью. По другим данным живая вакцина из штамма 6/85 не останавливает распространение M.gallisepticum [184].
Однако, следует отметить, что во избежание возникновения поствакцинальной инфекции применение таких вакцин в Российской Федерации не получило широкого распространения. В нашей стране пока отсутствуют вакцинные штаммы М. gallisepticum, для производства живых вакцин, за исключением штамма «F».
Практически одновременно с живыми вакцинами были предложены инактивированные вакцины, содержащие в качестве адъювантов масляные эмульсии. Такие вакцины получили название бактеринов [162, 169, 172, 130, 222].
В первый раз инактивированные вакцины вводят в 6-8-нед. возрасте, ревакцинируют после 90 сут, но не позже, чем за 4 недели до яйцекладки, подкожно или внутримышечно в объеме 0,3...0,5 см3. Продолжительность иммунитета - не менее 1 года.
В Российской Федерации зарегистрированы инактивированные эмульсионные вакцины зарубежных фирм: Gallimune MG, штамм «Бб (Merial), Avi Pro 104 MG, штамм «Бб» (Lohmann Animal Helz Internationale) и MG Вас, штамм «R-980», (Phaiser Animal Helz).
Определение антигенных и физических свойств вакцины инактивированной эмульсионной против РМ при хранении
В качестве основной характеристики инактивированных эмульсионных вакцин немаловажную роль играют их физические свойства, такие, как внешний вид, стабильность эмульсии и кинематическая вязкость.
В процессе хранения эмульсионных вакцин ускоряется флокуляция и коалесценция частиц, что приводит к необратимым изменениям в эмульсии и её разрушению, с разделением водной фазы на дне флакона.
Таким образом, оценка физических свойств эмульсионных вакцин является одним из звеньев контроля их качества в процессе производства и хранения.
Физические свойства вакцины инактивированной эмульсионной против РМ на основе адыованта «ISA-70» оценивали непосредственно после изготовления и после длительного хранения (через 3, 6, 9 и 12 мес.) при температуре +2 -+8С, которые включали определение внешнего вида, стабильности и кинематической вязкости.
Результаты исследования стабильности и кинематической вязкости вакцины, непосредственно после изготовления и после длительного хранения через 12 месяцев, приведены в табл. 7. Данные таблицы показывают, что параметры физических свойств свежеприготовленной вакцины и после её хранения в течение 12 мес при температуре +2...+8С не изменялись, что свидетельствует о высокой стабильности эмульсии в вакцине.
Таким образом, результаты исследования физических свойств вакцины инактивированной эмульсионной, приготовленной на адъюванте «ISA-70», показали высокую стабильность и гомогенность эмульсии.
Оценку антигенной активности вакцины инактивированной эмульсионной на адъюванте MA «ISA-70» сразу после изготовления и после длительного хранения (через 6 и 12 мес) при температуре +2...+8С, проводили в экспериментальных условиях на цыплятах кросса «Хайсекс-коричневый» 35-суточного возраста. Цыплят иммунизировали подкожно в область нижней трети шеи в дозе 0,5 см3/гол. Ревакцинацию цыплят осуществляли каждым образцом вакцины на 110-й день (за 4 недели до предполагаемого начала яйцекладки) тем же способом и аналогичной дозой.
Для определения уровня антител методом ИФА от цыплят получали сыворотку крови за сутки до и через 30, 60 сут после 1-й иммунизации, а также через 30 и 60 сут после ревакцинации. Полученные результаты представлены в табл. 8.
Эти данные свидетельствуют о том, что после первой иммунизации уровень титра антител через 30 и 60 сут был высоким для трех образцов вакцин и существенно не различался (Р 0,05). После ревакцинации через 1 и 3 мес он достоверно повысился как при использовании свежеприготовленной вакцины инактивированной эмульсионной - 1:10800 и 1:12104, так и при использовании аналогичных вакцин, хранившихся в течение 6 мес. при температуре +2...+8С - 1:11678 и 1:12345 и 12 мес. - 1:10051 и 1:11307 (Р 0,01), соответственно.
Таким образом, хранение вакцины инактивированной эмульсионной против РМ на протяжении 12 мес при температуре +2...+8С, а затем ее применение цыплятам двукратно с интервалом в 60 сут, не снижает антигенной активности по сравнению с аналогичным применением свежеприготовленной вакцины.
Определение антигенных и физических свойств вакцины инактивированной эмульсионной против ИБК, НБ,ССЯ-76 при хранении
Продолжительность хранения вакцин инактивированных эмульсионных является важной коммерческой характеристикой. В связи с этим нами были изучены физические свойства вакцины инактивированной эмульсионной «ИБК+НБ+ССЯ-76» на основе адъюванта «ISA-70» на протяжении продолжительного срока хранения (18 мес) при температуре 2-8С. Образец вакцины был протестирован по показателям внешнего вида, вязкости и стабильности эмульсии после изготовления и длительного хранения через 3, 6, 9, 12, 15 и 18 мес, как описано в разделе 2.1. Результаты этих исследований представлены в табл. 10.
Данные, представленные в табл. 10, показывают, что цвет и кинематическая вязкость свежеприготовленной вакцины до и после хранения при температуре 2-8 С оставались без изменений. Стабильность эмульсии в течение 15 мес хранения оставалась на одном уровне (после центрифугирования вакцины, высота сформировавшегося в верней части столбика прозрачной фракции составляла 3 мм), а на момент исследования, через 18 мес после хранения, она незначительно изменилась (после центрифугирования вакцины, высота сформировавшегося в верней части столбика прозрачной фракции составила 4 мм), но при этом была в пределах допустимой нормы до 10 мм.
Для оценки антигенной активности вакцины в разные временные промежутки использовали цыплят кросса «Хайсекс-коричневый» 80-90-суточного возраста, по 10 голов. Птица была получена из хозяйства, благополучного по инфекционным заболеваниям, в котором проводится иммунизация живыми вакцинами: «АВИВАК-ИБК» штамм «Н-120» и «АВИВАК-НБ» штамм «Ла-Сота» 2- и 3-х кратно, соответственно. Подопытные группы птиц прививали однократно, подкожно в область нижней трети шеи в объеме 0,5 см . У цыплят всех групп за 1 сут до и через 28 дн после вакцинации из подкрыльцовой вены брали кровь и получали сыворотку. Титр антител к вирусу ИБК определяли в ИФА с применением тест-системы производства НЛП «АВИВАК», а к вирусам НБ и ССЯ-76 в РТГА по общепринятой методике.
Динамика титров антител к вирусам ИБК, НБ и ССЯ- 76 представлена в табл.11.
Анализ результатов представленных в таблице 11, показал что титр антител к вирусу ИБК после иммунизации свежеприготовленным образцом вакцины возрос до значения 1:10735 (Р 0,01), а после иммунизации образцами хранившимися 6, 12 и 18 мес, он составил 1:9787, 1:9536 и 1:8936, соответственно. Существенной разницы между показателями титров антител после применения четырех образцов вакцин не установлено (Р 0,05).
Титр антител к вирусу НБ после вакцинации свежеприготовленной вакциной увеличился до 11,3 log2 (Р 0,01), а при применении вакцин после хранения 6, 12 и 18 мес до 11,3, 10,8 и 10,5, соответственно. Аналогичные результаты были получены по компоненту ССЯ-76.
На основании проведенных исследований сделано заключение, что вакцина «АВИВАК-ИБК+НБ+ССЯ-76» инактивированная при длительном хранении (до 18 мес) не снижает своей антигенной активности по входящим в нее компонентам.
Оценка иммунологической активности инактивированных вакцин против «РМ» и «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76»
Для приготовления вакцины использовали инактивированный концентрат культуры М. gallisepticum с агглютинирующей активностью 1:64 и инактивированные эмбриональные антигены вирусов: ИБК с инфекционной активностью до инактивации - 7,3 lg ЗИД5о/імл; НБ с инфекционной активностью до инактивации - 10,0 lg ЭИД50/1 мл, с гемагглютинирующей активностью после инактивации - 9 log2; ССЯ-76 с гемагглютинирующей активностью после инактивации - 14 log2.
Изготовленная серия вакцины была стерильна и представляла гомогенную водно-масляную эмульсию белого цвета, без наличия механической примеси, плесени, с показателями вязкости - 46 мм2/с и стабильности эмульсии при центрифугировании (высота верхней прозрачной фракции составила 3 мм).
Для испытания вакцины на иммуногенность использовали молодняк кур 30-сут. возраста в количестве 30 голов. Птица получена с птицефабрики «Роскар». На птицефабрике птица была иммунизирована против: болезни Марека в суточном возрасте; ИББ в возрасте 12 и 28 суток; НБ в возрасте 14 суток; ИБК в возрасте 21 суток.
Полученную птицу разделили на две группы. Первая группа в количестве 20 гол была привита моновакциной «РМ» в дозе 0,5 см3/гол в область нижней трети шеи, а спустя два месяца - вакциной «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» аналогичной дозой и методом. Вторая группа в количестве 10 гол была интактным контролем.
Для серологических исследований от птиц брали кровь в следующие сроки: за сутки до; через 1 и 2 месяца после первой иммунизации; за сутки до и каждый месяц после вакцинации в течение года. Титр антител к вирусам НБ и ССЯ-76 определяли в РТГА по общепринятой методике, а к вирусам ИБК, РЕО и М. gallisepticum в ИФА, на тест- системах производства НПП «АВИВАК».
Результаты определения антигенной активности вакцины «АВИВАК-РМ+ ИБК+НБ+ССЯ-76» представлены в табл. 15.
Как видно из данных таблицы 15, титр антител к М. gallisepticum до вакцинации составил 1:281, а через 1 и 2 месяца после первой вакцинации -1:2342 и 1:4597, соответственно. Таким образом, произошло увеличение уровня антител в 8,3 и 16,4 раза, соответственно (Р 0,01). После второй иммунизации вакциной «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» уровень антител к М. gallisepticum через 1 и 2 мес достиг значения 1:12076 и 1:12385, соответственно, а с 3 мес начал плавно снижаться 1:10385 и к 12 мес составил 1:2949.
Титр антител вируса ИБК перед второй иммунизации составил 1:960, но уже через 1-3 мес после применения ассоциированной вакцины он увеличился до 1:11009 — 1:10394 и на этом уровне он оставался практически до 6 мес (9360). К окончанию опыта титр антител постепенно снизился до значения 1:5694.
До вакцинации титр антител к вирусу НБ находился на уровне 3,1 log2. После второй вакцинации через 1 и 2 мес он увеличился до значений 11,4 и 9,3, соответственно, и к завершению опыта стал постепенно снижаться до 7,3 log?.
Уровень антител к вирусу ССЯ-76 после вакцинации максимально увеличился через 2 мес до значения 9,8 log2, затем он медленно снижался и через 12 мес составил 7,3 log2.
Статистическая обработка результатов антигенной активности инактивированной вакцины «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» выявила достоверную разницу показателей титра антител (Р 0,05-0,001) по сравнению с аналогичным показателем до вакцинации.
В контрольной группе цыплят титр антител ко всем исследуемым компонентам вакцины до опыта был в диагностически отрицательных или низкоположительных значениях и не повышался в течение всего опыта.
Проведенное испытание инактивированной вакцины против РМ, ИБК, НБ и ССЯ-76 показало, что она является безвредной и антигенно активной, создавая у привитых птиц напряженный иммунитет по всем компонентам продолжительностью до 12 мес. (срок наблюдения).
