Введение к работе
1. 1.1 Актуальность темы. Туберкулез наносит большой экономический ущерб животноводству и поэтому одной из важнейших задач ветеринарной науки и практики является разработка современных способов достоверной диагностики, а на этой основе полное оздоровление животных от туберкулеза (Макаров В.В., 1998; Ярёменко Н.А., 2004). Кроме того, туберкулез представляет большую опасность для людей. По данным ВОЗ среднегодовая смертность, обусловленная туберкулезом, составляет около 3 млн случаев (Федоров Л.П., 1997; Dolin P.J., 1994; Drobniewski F.A., 1998; Pozzi G., 1999). В развивающихся странах смертельные случаи, связанные с туберкулезом, составляют около 25% от общего числа летальных исходов.
В системе борьбы с туберкулезом важна точная и своевременная лабораторная диагностика данного заболевания.
Существующие методы диагностики туберкулеза имеют определенные недостатки. Так, прижизненная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота на основе аллергической внутрикожной туберкулиновой пробы недостаточно эффективна, так как дает ложноположительные результаты. Бактериологический метод хотя и дешевый, но длительный по времени проведения анализа и недостаточно чувствительный, позволяет определять микобактерии туберкулеза в исследуемом материале только при наличии в 1мл диагностического материала не менее 100000 клеток микобактерии. При этом могут высеваться и атипичные микобактерии (Харитонов MB. 1991; Найманов А.Х., 1990; Leite C.Q., 2003; Мс Соггу Т.Р., 2004; Miller I.M., 2002; Pate М., 2004).
Самым чувствительным методом является биологическая проба. Однако данный метод для получения конечного результата требует длительного времени наблюдения за подопытными животными, в среднем до 2-3 месяцев (Сафин М.А. 1990).
Перспективным в этом отношении методом выяапения микобактерии является высокоспецифичный и чувствительный метод полимеразной цепной
реакции (ПНР), позволяющий в короткие сроки не только выявлять сам возбудитель, но и идентифицировать его до вида по генетическим маркерам. К настоящему времени описано несколько систем для амплификации различных участков генома Mycobacterium tuberculosis (Фаизов Т.Х., 1995; Boddinghaus В., 1990; Dailloux М., 1996; Рао С.С., 1990; Van den Wijngaert S., 2004).
1.2 Цель и задачи исследований. Целью работы явилась изучение дифференцирующей способности основных методов генотипирования микобактерий и определение степени применения каждого из них.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
Разработать оптимальный метод выделения ДНК для различных методов генотипирования возбудителей туберкулёза.
Изучить и подобрать наиболее эффективные, специфичные молекулярно-генетические методы, пригодные для дифференциации видов и штаммов возбудителей туберкулёза и атипичных микобактерий.
Создать систему интерпретации результатов молекулярного генотипирования микобактерий.
1.3 Научная новизна. Впервые показано, что произвольный праймер
N113 позволяет дифференцировать виды возбудителей туберкулёза, а
праймер N29 обладает дифференцирующей способностью относительно
штаммов этих микобактерий.
Установлено что при гидролизе эндонуклеазами рестрикции AspLe и Hinil фрагмента IS6110, одновременно с идентификацией микобактерий в пробе, достигается и их межвидовая дифференциация.
Впервые разработана технология дифференциации вакцинного штамма М. bovis BCG от патогенных штаммов М. bovis и М. tuberculosis.
1.4 Практическая ценность работы. Разработанные и испытанные в
практических условиях молекулярно-генетические методы: анализ VNTR
локусов ДНК, ПДРФ на матрице инсерционного элемента IS6110 и анализ
региона RD1 микобактерий могут быть внедрены в практику медицинских и
5 ветеринарных лабораторий.
Для практического применения предложен алгоритм, в котором имеется возможность генотипирования микобактерий как в выращенных культурах, так и непосредственно в патологическом материале, что существенно сокращает сроки идентификации и дифференциации (1-2 дня) по сравнению с бактериологическими методами и исключает субъективизм в постановке диагноза на туберкулёз.
Результаты проведенных исследований вошли в Методические рекомендации «Применение ПЦР с произвольными праймерами для дифференциации различных видов возбудителей туберкулёза», которые были одобрены НМС и утверждены директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на двух научно-практических конференциях в Казани (2007, 2009) и Международной конференции в Москве (2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе методические рекомендации, 4 работы опубликованы * реферируемых ВАК изданиях.
Основные положения, выносимые на зашиту:
- ПЦР с произвольными праймерами как универсальный метод
генотипирования;
- Использование VNTR-анализа для идентификации и дифференциации
штаммов микобактерий;
Использование ПЦР-ПДРФ для идентификации микобактерий и проведения межвидовой дифференциации;
Использование геноспецифичных праймеров для дифференциация Mycobacterium bovis BCG от патогенных микобактерий.
1.8 Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 134
страницах печатного текста и включает разделы: введение, обзор литературы,
материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение
