Введение к работе
1 1.1. Актуальность темы
Listeria monocytogenes является причиной возникновения листериоза у животных и человека. В настоящее время данное заболевание все чаще регистрируется в виде пищевой токсикоинфекции. Это обусловлено повсеместным распространением листерий в природе, полиморфизмом клинических признаков болезни, высоким уровнем летальности при генерализированных формах инфекции, возрастающими объемами оборота кормов и пищевых продуктов (в частности продуктов быстрого питания). Учитывая способность листерий размножаться в готовых к употреблению пищевых продуктах, хранящихся в холодильниках при низких температурах (при +4С), перерабатывающая и пищевая промышленность вынуждена расходовать огромные средства для предотвращения выпуска контаминированной продукции [5, 7].
Работы по изучению биологических свойств листерий показывают, что L. monocytogenes адаптируется к условиям окружающей среды, особенно под воздействием антропогенных факторов (применение антибиотиков в медицине и пищевой промышленности, консервантов, дезинфицирующих средств и т.п.). Адаптация листерий выражается в изменении биологических свойств. В основном эти изменения проявляются невосприимчивостью к антибактериальным препаратам определенных групп, способностью образовывать биопленки, появлением авирулентных и слабовирулентных форм бактерий [4, 11, 12, 13].
В РФ испытания пищевого сырья и пищевых продуктов на контаминацию L. monocytogenes проводят в соответствии с ГОСТ Р 51921–2002 бактериологическими методами, которые включают в себя выделение, идентификацию чистой культуры и постановку биопробы [3]. За рубежом для идентификации бактерий вида L. monocytogenes, помимо классических методов, используют инструментальные методы идентификации (ПЦР-РВ, масс-спектрометрия).
Учитывая вышеизложенное, усовершенствование методов выделения и идентификации изолятов и штаммов L. monocytogenes, выделенных на территории РФ и за рубежом, имеет научное и практическое значение. Наша работа позволит дать в будущем качественную оценку циркуляции возбудителя пищевого листериоза, а усовершенствование методов выделения и идентификации листерий даст возможность выявлять возбудителя в пищевых продуктах и продуктах
животного происхождения в кратчайшие сроки.
1.2. Степень разработанности проблемы
Отечественными и зарубежными учеными опубликовано значительное число работ по изучению биологических свойств изолятов L. monocytogenes классическими методами (выделение чистой культуры и идентификация). В то же время за рубежом происходит совершенствование методов идентификации листерий в пищевых продуктах и в объектах окружающей среды, в частности с использованием ПЦР-РВ и масс-спектрометрического метода.
1.3. Цель и задачи исследований
Основной целью данной работы являлось усовершенствование методов выделения и идентификации бактерий рода Listeria, в частности вида L. monocytogenes, полученных из различных пищевых продуктов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить культурально-морфологические и биохимические свойства
референтных штаммов и изолятов L. monocytogenes и L. innocua при помощи
традиционных бактериологических методов.
-
Охарактеризовать штаммы и изоляты по патогенности и вирулентности на белых мышах.
-
Усовершенствовать схему выделения и идентификации L. monocytogenes из патологического материала и пищевых продуктов.
-
Оптимизировать метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для идентификации L. monocytogenes.
-
Создать базу данных для идентификации бактерий рода Listeria методом MALDI-TOF.
1.4. Научная новизна работы
В результате проведенных исследований получено: 3 изолята L. monocytogenes и 5 изолятов L. innocua.
Изучены биологические свойства 14 референтных штаммов и 27 штаммов и изолятов L. monocytogenes.
Усовершенствована схема выделения L. monocytogenes из патологического материала и пищевых продуктов.
Оптимизирована полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для идентификации L. monocytogenes.
Создана база данных по идентификации L. monocytogenes масс-спектрометрическим методом (MALDI Autoflex).
1.5. Теоретическая и практическая значимость работы
В результате проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по выявлению генома L. monocytogenes в пищевых продуктах методом ПЦР-РВ», одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» (протокол № 6, 28.06.13), и «Методические рекомендации по идентификации L. monocytogenes с применением масс-спектрометра Autoflex MALDI biotyper», одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» (протокол № 6, 28.06.13).
В коллекцию бактериальных культур ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», референтной лаборатории болезней КРС, после изучения биологических свойств заложены следующие изоляты: L. monocytogenes «L-1», «L-2» и L. innocua «I-1», «1228 (P)» «1229 (F)», «1231 (M)», «1232».
1.6. Основные положения, выносимые на защиту:
результаты изучения биологических свойств 27 штаммов и изолятов L. monocytogenes, 14 референтных штаммов L. monocytogenes и 5 изолятов L. innocua;
определение патогенности и вирулентности изолятов и референтных штаммов L. monocytogenes на белых мышах;
оптимизация ПЦР-РВ для идентификации бактерий рода Listeria;
- база данных для идентификации L. monocytogenes масс-
спектрометрическим методом.
1.7. Соответствие диссертации паспорту научной специальности
В диссертационной работе приведены результаты исследований по идентификации бактерии вида L. monocytogenes. Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности 06.02.02 – 1, 4, 5, 6, 7.
1.8. Степень достоверности и апробация результатов исследования
Результаты проведенных исследований получены с использованием большого объема экспериментального материала, данные опытов обработаны статистическими методами, а их достоверность подтверждена комиссионными испытаниями. Акты комиссионных испытаний утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 28.06.13. Основные материалы доложены и опубликованы в материалах научных конференций: «Достижения молодых ученых - в
ветеринарную практику», посвященной 30-летию создания СМУ ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2010 г.), «Трансмиссивные заболевания животных: актуальные аспекты биобезопасности и контроля» (г. Алушта, Украина, 2012 г.), «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2012 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2009-2012 гг.
1.9. Публикации результатов научных исследований
По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ в журналах и материалах научных конференций, 3 из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
1.10. Структура и объем работы
