Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Серологическая диагностика бруцеллеза животных 12
1.1.1. Реакция агглютинации пробирочная (РА) 13
1.1.2. Роз бенгал проба (РБП) 16
1.1.3. Реакция связывания комплемента (РСК) 18
1.1 .4. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) 21
1.1.4.1. Способы изготовления S-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов 24
1.1.4.2. Способы изготовления R-бруцеллезных антигенов 29
1.1.5. Реакция иммунодиффузии (РИД) 31
1.2. Диагностические тесты с молоком 33
1.3. Дифференциальная диагностика больных бруцеллезом животных от иммунизированных противобруцеллезными вакцинами 38
1.4. Заключение к обзору литературы 43
Глава 2. Собственные исследования
2.1. Материалы и методы 45
2.2. Изыскание рационального способа изготовления S-бруцеллезного эритроцитарного антигена 47
2.2.1. Определение оптимального способа стабилизации эритроцитов барана 48
2.2.2. Определение оптимальной концентрации бактериальных клеток при изготовлении S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума 50
2.2.3. Изучение влияния температурного режима на процесс сенсибилизации эритроцитов 52
2.2.4. Подбор оптимального количества сенситина для нагрузки эритроцитов барана 53
2.2.5. Отработка методики изготовления диагностикума 54
2.2.6. Изучение влияния процесса танизации эритроцитов на активность S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума 57
2.2.7. Изыскание оптимальных условий лиофилизации S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума 60
2.2.8. Изучение срока годности сконструированных S-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов 63
2.3. Изучение влияния биологических свойств штаммов бруцелл на активность S-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов в опыте на кроликах 64
2.4. Изучение диагностической ценности РНГА в опытах на морских свинках, сенсибилизированных разными штаммами бруцелл 72
2.5. Испытание S-бруцеллезного эритроцитарного антигена в производственных условиях 86
2.5.1. Результаты испытания S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума на животных, непривитых противобруцеллезными вакцинами 87
2.5.1.1. Результаты испытания специфичности S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума на крупном рогатом скоте 87
2.5.1.2. Результаты испытания специфичности S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума на мелком рогатом скоте 89
2.5.1.3. Результаты изучения специфичности S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума на свиньях 91
2.5.1.4. Испытание S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума в неблагополучных по бруцеллезу гуртах крупного рогатого скота 91
2.5.1.5. Результаты испытания S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума в неблагополучных по бруцеллезу отарах овец 95
2.5.2. Результаты испытания диагностической эффективности S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума при обследовании животных, реиммунизированных вакциной из штамма 82, в благополучных по бруцеллезу хозяйствах 97
3. Результаты испытания РЫТА в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах на животных, привитых вакцинами из штаммов 82, 75/79 АВ 100
4. Изучение диагностической ценности РНГА с молоком 105
4.1. Результаты испытания РНГА с молоком на животных, привитых вакциной из штамма 82, в благополучных по бруцеллезу хозяйствах 105
4.2. Результаты испытания РНГА с молоком при обследовании животных, привитых вакциной из штамма 82, в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах 105
- Дифференциальная диагностика больных бруцеллезом животных от иммунизированных противобруцеллезными вакцинами
- Изыскание рационального способа изготовления S-бруцеллезного эритроцитарного антигена
- Изучение срока годности сконструированных S-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов
- Изучение диагностической ценности РНГА с молоком
Введение к работе
Актуальность темы. Бруцеллез относят к числу опасных зооантропонозов. За последние годы в ряде регионов РФ осложнилась эпизоотическая ситуация по этой болезни (Ю.В. Пашкина, 2007; С.К. Димов с соавт., 2009; М.М. Желудков, 2009).
При бруцеллезе животных широкое практическое применение в нашей стране получили, прежде всего, реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента (РСК, РДСК), роз бенгал проба (РБП), реакция иммунодиффузии (РИД), кольцевая реакция с молоком (КР).
Несмотря на специфичность и чувствительность, эти тесты, по мнению многих исследователей, не выявляют всех инфицированных животных при оздоровлении неблагополучных по бруцеллезу хозяйств (К.В. Шумилов, 1981; И.А. Косилов, 1999; О.Д. Скляров, 2005; М.П. Альбертян, М.И. Искандаров, А.И. Федоров, 2006; Н.М. Колычев, М.А. Бажин, B.C. Власенко, 2007 и др.).
В современных условиях происходит дальнейшее разукрупнение животноводческих хозяйств. Развиваются мелкие крестьянские и фермерские хозяйства. В этой связи целесообразно изыскание простых высокочувствительных экспресс-методов, позволяющих проводить не только диагностику бруцеллеза у интактных животных, но и дифференцировать больных от привитых слабоагглютииогенными проти вобруцеллезными вакцинами.
РНГА (реакция непрямой гем агглютинации) при бруцеллезе была внедрена в СССР в медицинскую практику. При этом использовали лиофилизированный эритроцитарный диагностикум, выпускаемый Одесским предприятием по производству бактериальных препаратов, методика изготовления которого была разработана в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. В ветеринарии этот препарат благодаря разработкам Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных
(ВНИИБТЖ), ФГУ Всероссийского государственного Центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ), Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (ИЭВСДВ) был принят в СССР к внедрению при бруцеллезе крупного рогатого скота в 1990 году. После распада СССР возникла необходимость разработки в РФ отечественного диагностикума, который возможно бы было применять не только на непривитых животных, но и на иммунизированных слабоагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами. Разработку технологии изготовления S-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов осуществляли С.Г. Хаиров, О.Ю. Юсупов (1979); И.П. Иванов, В.Б. Бельченко (1980); А.П. Красиков (2002) и др., но к началу наших исследований зарегистрированного в РФ S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для ветеринарных целей не было.
О необходимости использования при дифференциальной диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82, в целях оценки эпизоотической ситуации и контроля качества оздоровления неблагополучных хозяйств не только S-, но и R-диагностикумов, сообщали: К.М. Салмаков, 1975, 2007; И.П. Никифоров, 1995; А.С. Донченко с соавт., 2003; В.В. Сочнев, 2004; Л.В. Деггяренко, 2005; A.M. Фомин с соавт., 2009 и др. В частности, с этой целью применяли R-бруцеллезный антиген в РСК.
Сведения о возможности использования РНГА с R-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом для оценки иммунного статуса животных, вакцинированных инагглютиногенными и слабоагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами, крайне ограничены.
Исходя из вышеизложенного, считаем, что исследования, посвященные разработке S- и R-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов для РНГА, являются актуальными.
Цель исследований. Цель исследования — разработка S- и R-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов для РНГА, изучение их эффективности при бруцеллезе животных.
Задачи исследования:
разработать рациональную технологию изготовления S-бруцеллезного диагностикума для РНГА и изучить его эффективность в экспериментальных, производственных условиях на разных видах животных;
разработать рациональную технологию изготовления R-бруцеллезного диагностикума для РНГА и изучить его эффективность на лабораторных животных и крупном рогатом скоте.
Научная новизна. Разработаны новые биотехнологии изготовления специфичных активных и чувствительных S- и R-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов для РНГА.
В экспериментальных и производственных условиях доказана высокая диагностическая значимость новых S- и R- бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов на разных стадиях развития инфекционного и вакцинного процессов.
Доказана более высокая чувствительность сконструированного S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума в сравнении с официальными методами диагностики при исследовании сыворотки крови крупного и мелкого рогатого скота в очагах естественного течения бруцеллезной инфекции.
Разработаны критерии эпизоотической оценки животных с разным иммунным статусом, реагирующих в РНГА с новым S-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом, в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах.
Показана возможность использования РНГА с изготовленным S-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом при исследовании на бруцеллез сыворотки крови и молока у крупного рогатого скота,
реиммунизированного слабоагглютиногенными вакцинами из штаммов B.abortus 82, 75/79-АВ, в ранние и отдаленные сроки после прививки (с 30-го дня — молоко, с 60-го - сыворотка крови).
Впервые показана целесообразность проведения контроля иммунного ответа у животных, привитых слабоагглютиногенными вакцинами из штаммов 82, 75/79-АВ, с использованием разработанного R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума в РИГА, а также применения указанного теста при дифференциально-диагностических исследованиях крупного рогатого скота на бруцеллез в комплексе с другими средствами и методами.
Практическая и теоретическая значимость работы. Внедрение в
ветеринарную практику РНГА с S-бруцеллезным эритроцитарным
диагностикумом позволит более эффективно контролировать
эпизоотическую обстановку по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота, своевременно выявлять источники возбудителя инфекции и способствовать ускорению ликвидации болезни.
Разработанный R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум в РНГА позволит контролировать иммунный ответ у крупного рогатого скота, привитого слабоагглютиногенными вакцинами из штаммов 82, 75/79-АВ, и дифференцировать больных бруцеллезом животных от здоровых, реагирующих на вакцину.
Результаты научных исследований могут быть использованы при изучении патогенеза и иммуногенеза бруцеллеза животных, инфицированных как типичными, так и диссоциированными формами бруцелл.
Апробация полученных результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: второй международной конференции «Актуальные вопросы диагностики болезней животных» (Алматы, 2005), международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005), 5-й межрегиональной научно-
практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины продуктивных и непродуктивных животных» (Омск, 2006), 7-й межрегиональной научно-практической конференции «Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в условиях Сибири и Урала» (Омск, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций» (Омск, 2009).
Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе одна статья - в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования и науки РФ («Ветеринария и кормление»).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.
Диссертация иллюстрирована 26 таблицами, 9 рисунками. Список литературы включает 206 источников, из них 54 - зарубежных.
Внедрение результатов исследований. Результаты исследований
использованы для разработки: Инструкции по применению набора для
серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в
реакции непрямой гемагглютинации (РЫТА), утвержденной
Россельхознадзором 25.09.2006 г.; методических рекомендаций «Контроль поствакцинального иммунного ответа у крупного рогатого скота, иммунизированного противобруцеллезными слабоагглютиногенными вакцинами из штаммов 82, 75/79-АВ», утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии; методических рекомендации по дифференциальной диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота, иммунизированного
противобруцеллезными вакцинами и по контролю иммунного ответа крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82, утвержденных секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области (при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области), прот. №7 от 24.11.2006 г. и прот. №4 от 10.10.2009 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
результаты разработки рациональной технологии изготовления S-бруцеллезного диагностикума для РНГА и изучения его эффективности в экспериментальных, производственных условиях на разных видах животных;
результаты разработки рациональной технологии изготовления R-бруцеллезного диагностикума для РНГА и изучения его эффективности на лабораторных животных, крупном рогатом скоте.
Дифференциальная диагностика больных бруцеллезом животных от иммунизированных противобруцеллезными вакцинами
Оздоровление животноводства от бруцеллеза затрудняется из-за отсутствия точной системы распознавания спонтанного бруцеллеза от поствакцинальных реакций. Имеются различия в пропорциях и длительности персистенции каждого типа антител в зависимости от характера инфекции, физиологического состояния, возраста, времени вакцинации, сроков исследования, вирулентности возбудителя, индивидуального ответа организма восприимчивого животного, которые и создают проблему дифференциальной диагностики (А.В. Суспицин с соавт., 2003; A. Cantu et al., 2007.
В нашей стране с 1974 года и по настоящее время в комплексе противобруцеллезных мероприятий у крупного рогатого скота используются вакцины из штаммов В.abortus 82 и 19.
В ответ на введение агглютиногенной вакцины из штамма 19 взрослым животным, вырабатывающиеся агглютинины и комплементсвязывающие антитела сохраняются в их организме до 5-8 лет, что затрудняет дифференциацию иммунизированных животных от больных бруцеллезом (A.R. MacMillan, R.A. Bell, 1985).
Живая сухая вакцина против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма В.abortus 82 обладает низким серологическим ответом с быстрым снижением уровня гуморальных антител (К.М. Салмаков, 1975, 1987). Однако у отдельных животных в отдаленные сроки после иммунизации многие исследователи отмечают серопозитивность со стандартным диагностикумом в РА и РСК (Н.Х. Хасанов с соавт. 1980; Г.Г. Черемисин, 1993; В.А. Апалькин с соавт., 2005 и др.).
Животных с серопозитивными реакциями, привитых вакциной из штамма 82, в течение определенного времени трудно отличить от инфицированных в естественных условиях.
Учеными Алтайской НИВС и ВГНКИ была сконструирована противобруцеллезная вакцина из неабортогенного, слабоагглютиногенного, стойкого к реверсии штамма B.abortus 75/79-АВ, выделенного И.П. Никифоровым (1995).
По результатам широкого производственного испытания противобруцеллезной вакцины из штамма B.abortus 75/79-АВ на территории Алтайского края В.В. Разумовской (2004) установлено, что, обладая слабой агглютиногенностью, отсутствием абортогенных свойств, она является оптимальной для использования в ветеринарной практике, обеспечивает возможность оздоровления стад от бруцеллеза в короткие сроки. Использование данной вакцины позволило сократить сроки оздоровления неблагополучных пунктов по бруцеллезу крупного рогатого скота в 3-4 раза в сравнении с применением для этих же целей вакцины из штамма B.abortus 82.
С.К. Димов с соавт. (2009) также свидетельствуют о том, что применение вакцины из штамма B.abortus 75/79-АВ при оздоровлении ферм от бруцеллеза положительным образом отражается в виде более быстрого угасания поствакцинальных реакций, однако проблема дифференциации поствакцинальных антител при этом остаётся актуальной.
Разработанный в ИЭВСДВ О-ПС антиген для РИД (В.М. Чекишев, 1993, 1998) был принят в ветеринарную практику в качестве основного теста диагностики бруцеллеза у непривитых животных, а также иммунизированных вакцинами из штаммов 82 и 19.
В целях дифференциации больных бруцеллезом животных от иммунизированных противобруцеллезными вакцинами из штаммов B.abortus 82 и 19 РИД с О-ПС антигеном испытывали С.К. Димов с соавт., 1997; Г.М. Стеблева с соавт. 1997; П.К. Аракелян с соавт., 2004; К.С. Димов, 2008 и др.
В.М. Чекишев с соавт. (1993) при испытании РИД с О-ПС антигеном установил, что при многократных реиммунизациях вакцинами из штаммов B.abortus 82 и 19 РИД была положительной в единичных случаях при исследовании сыворотки крови через месяц после введения вакцин животным и отрицательной через два - три месяца после иммунизации.
Т.Г. Попова с соавт. (2005) сообщают, что для дифференциации поствакцинальных реакций можно использовать РИД с О-ПС антигеном уже через 21 сутки после вакцинации. Так, в свежем очаге бруцеллеза крупного рогатого скота при оздоровлении хозяйства авторы применяли разработанную ими химическую вакцину ВНИИБТЖ, при этом, чтобы выявить максимальное количество больных животных, проводили РА и РСК начиная с 21 суток после вакцинации, а дифференциальным тестом была только РИД с О-ПС антигеном.
СМ. Достай с соавт. (2003) рекомендуют в неблагополучных и угрожаемых отарах исследовать на бруцеллез в РИД поголовье овец, многократно привитых вакциной из штамма 19, через 3 месяца после вакцинации.
РИД с О-ПС антигеном у вакцинированных и экспериментально зараженных бруцеллезом животных изучал Ш.Р. Файзрахманов с соавт. (1993). Исследователи установили, что в благополучных по бруцеллезу хозяйствах через 1,5-3 месяца после иммунизации крупного рогатого скота вакциной из штамма 82 положительно реагирующих на бруцеллез в РИД не регистрируется, однако в РА и РСК серопозитивные реакции у животных сохраняются.
Д. М. Хусаинов, М.Б. Досекенова, Ш.Ж. Садыкова (2005) разработали способ получения О-ПС антигена для РИД из штамма В.abortus 19. Исследователи указывают, что разработанный ими способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных обеспечивает больший выход высокоактивного и высокоспецифичного диагностикума с меньшими затратами.
Изыскание рационального способа изготовления S-бруцеллезного эритроцитарного антигена
Первоначально нами был апробирован способ получения S бруцеллезного эритроцитарного диагностикума по методике Прикаспийского ЗНИВИ (С.Г. Хаиров, 2001), который заключался в экстрагировании бакмассы штамма В.abortus 19, с последующей обработкой суспензии бруцелл 2,0 % вторичным алкилсуфатом натрия. Однако в качестве детергента авторы применяли моющую жидкость «Прогресс», в состав которой входили ряд поверхностно-активных веществ, в том числе и вторичный алкилсульфат натрия.
Так как жидкость «Прогресс» выпускается различными производителями и отличается по своим свойствам, при испытании этого метода нами установлены недостатки, заключающиеся в том, что не всегда удается получить специфичный диагностикум с высокой стабильной активностью. Кроме того, для изготовления антигена с высокой активностью расходуется большое количество бактериальной массы для экстракции сенситина, что связано со значительными экономическими затратами при производстве препарата
По данной методике нами было изготовлено шесть опытных серий S-эритроцитарных диагностикумов, из них три серии обладали недостаточной активностью (1:400-1:800) при постановке РИГА с S-биофабричной бруцеллезной сывороткой и стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус, тогда как заданной активностью считали титр 1:1600.
В этой связи нами было продолжено изыскание рационального способа изготовления S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума.
Воспроизводимость результатов реакции непрямой гемагглютинации ограничивается кратковременной пригодностью нативных эритроцитов и зависимостью многих свойств эритроцитов от вида животного. Эти недостатки эритроцитов как носителя в реакции непрямой гемагглютинации могут быть преодолены их стабилизацией, для которой предложено много методов.
Для приготовления эритроцитарного диагностикума были выбраны эритроциты барана, как наиболее доступный сырьевой материал.
Стабилизацию эритроцитов проводили с помощью формалина по методу R. Weinbach (1958), в нашей модификации. В процессе работы по испытанию данного метода, мы внесли изменение, которое заключалось в том, что сократили длительность этапов сенсибилизации эритроцитов и их шуттелирования.
Формалинизацию эритроцитов барана осуществляли следующим образом: дефибринированную кровь барана фильтровали через четыре слоя марли и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором путем центрифугирования при том же режиме до получения прозрачной надосадочнои жидкости. Из осадка готовили 10,0 % взвесь эритроцитов на физиологическом растворе. К полученной взвеси добавляли равный объем 3,0 % раствора формальдегида. Количество формалина, необходимого для обработки эритроцитов, рассчитывали по формуле: Х=3 х d/ S, где Х- количество формалина (мл), 3-концентрация формальдегида в растворе (3,0 %), d-количество обрабатываемой 10,0 % взвеси эритроцитов (мл), S-концентрация формальдегида в имеющемся цельном формалине (%). Полученную взвесь эритроцитов оставляли в термостате при температуре 37 С на 20 часов.
После окончания формалинизации эритроциты фильтровали через четыре слоя марли и отмывали от избытка формалина физиологическим раствором три раза путем центрифугирования при 1500-2000 об/мин в течение 15-20 минут. Отмытые эритроциты ресуспендировали до 10,0% концентрации в физиологическом растворе, после чего добавляли в качестве консерванта 0,25 % формалина.
Изучение срока годности сконструированных S-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов
Опытные серии эритроцитарного диагностикума консервировали 0,25 % раствором формалина. После десятидневной стабилизации при температуре 2 С — 6 С эритроцитарный антиген проверяли на активность в РНГА со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус и негативными сыворотками крупного рогатого скота. Всего нами было сконструировано 14 серий бруцеллезных эритроцитарных антигенов, которые были апробированы в производственных и лабораторных условиях. При проверке сроков годности антигены испытывали на специфичность с негативными сыворотками крупного рогатого скота и активность с агглютинирующей бруцеллезной сывороткой ООО «Биоцентр». Нелиофилизированные эритроцитарные бруцеллезные диагностикумы, изготовленные по разработанной нами методике, сохраняли активность и специфичность в течение двух лет с условием хранения их при температуре от 2 С до 6 С. Срок наблюдения за лиофилизированными эритроцитарными бруцеллезными антигенами составлял 12 месяцев, в течение этого времени антигены сохраняли первоначальные свойства. Опыт был поставлен на базе вивария лаборатории диагностики бруцеллеза ВНИИБТЖ на 12 кроликах. В качестве заражающих штаммов использовали вирулентные культуры бруцелл: B.abortus 54, B.suis 1330, а также вакцинный штамм B.abortus 19. Данные культуры при предварительной проверке имели признаки S— форм бруцелл: агглютинировались S-бруцеллезной сывороткой, не агглютинировались R-бруцеллезной сывороткой и в растворе трипафлавина. При окраске колоний культур бруцелл по Уайт-Вилсону установлено 100,0 % содержание S-форм бруцелл (желтая окраска колоний). Из животных было сформировано четыре группы, по три головы в каждой. Кроликов первой группы заражали культурой вирулентного штамма B.suis 1330; второй - B.abortus 54; в третьей группе животных иммунизировали культурой вакцинного штамма B.abortus 19. Четвертая группа была контрольной, животных не сенсибилизировали бруцеллезным антигеном. Заражение и вакцинацию кроликов проводили подкожно в области шеи в дозе 1 млрд м.к. Иммунологические реакции изучали в РИГА, РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, РБП с биофабричным антигеном в соотношении антигена и сыворотки 1:1, т.е. 0,03 мл антигена и 0,03 мл сыворотки, РИД с О-ПС антигеном по общепринятым методикам.
Исследование сыворотки крови животных проводили перед заражением и через 7, 14, 30, 60 суток после инфицирования и иммунизации. Антигены для РНГА готовили по разработанной нами методике из гомологичных штаммов, которые применяли для заражения и вакцинации животных. В опыте использовали следующие эритроцитарные бруцеллезные диагностикумы: - антиген, изготовленный из штамма B.abortus 19, предельный титр в РНГА с биофабричной стандартной бруцеллезной агглютинирующей сывороткой 1:3200; - антиген, изготовленный из штамма B.abortus 54, предельный титр в РНГА с биофабричной стандартной бруцеллезной агглютинирующей сывороткой 1:3200; - антиген, изготовленный из штамма B.suis 1330, предельный титр в РНГА с биофабричной стандартной бруцеллезной агглютинирующей сывороткой 1:3200. Перед заражением и иммунизацией была предварительно исследована сыворотка крови от 20 здоровых кроликов, при этом установлен диагностический титр РНГА - 1:10. Результаты РА и РБП у животных были отрицательные. Через семь суток у опытных животных появились серологические реакции (табл. 5). Анализ данных таблицы показывает, что со всеми испытуемыми антигенами в РНГА, а также в РА и РБП реагировало 100,0 % животных. В РНГА антиген из штамма В.abortus 54 выявлял высокие титры гемагглютининов, причем наиболее высокий уровень их был в группе животных, зараженных гомологичным штаммом бруцелл, средний титр реагирующих составлял (2,702±0,375) lg. Менее активным был антиген из штамма B.suis 1330 (№3), особенно при исследовании кроликов, сенсибилизированных гетерогенными штаммами В.abortus 54 и В.abortus 19-средние титры соответственно (2,00-2,200±0,141) lg. В РНГА средние титры антител по группам животных были, в основном, выше, чем в РА. Например, в группе кроликов, инфицированных культурой штамма B.suis 1330, с антигеном из штамма B.abortus 19 титры гемагглютининов превышали титр агглютининов в восемь раз. Результаты иммунологического обследования кроликов через 14 суток после сенсибилизации представлены в табл. 6.
Изучение диагностической ценности РНГА с молоком
На следующем этапе работы изучали чувствительность РНГА с изготовленным нами S-бруцеллезным эритроцитарным антигеном при исследовании молока от коров, привитых вакциной из штамма 82, в двух неблагополучных по бруцеллезу гуртах (СПК «Нива» Павлоградский район и СПК «Комсомольское» Одесский район) Омской области. В процессе оздоровления крупного рогатого скота от бруцеллеза для дополнительного выявления больных с локализацией бруцеллезного процесса в молочной железе периодически исследовали молоко в КР, РНГА. При этом больными бруцеллезом считали коров, реагирующих в КР в титре 1:4 и выше, РНГА - в титре 1:100 и выше. Исследование молока коров в неблагополучных по бруцеллезу гуртах проводили через 1, 2, 5, 6 месяцев после ревакцинации (табл. 19). Анализ данных таблицы показывает, что при исследовании 1643 проб молока от коров, привитых вакциной из штамма 82, в неблагополучных по бруцеллезу гуртах с помощью нового эритроцитарного бруцеллезного антигена в РНГА диагностировали 39 положительно реагирующих коров (2,4 %), в КР с молоком — 31 (1,9 %). Необходимо отметить, что показания КР и РНГА с молоком совпадали в 26 случаях (83,9 %), только с помощью РНГА установлено из общего количества исследованных проб молока 13 положительно реагирующих коров (0,8 %), что является важным обстоятельством при оздоровлении животных от бруцеллеза. В отдельных гуртах коров процент реагирующих только в РНГА с молоком колебался от 0,2 до 5,1 %. Сопоставляя результаты изучения уровня гемагглютининов в молоке коров, привитых вакциной из штамма 82 в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу гуртах, установили, что у здоровых животных гемагглютинины регистрируются только в разведении молока 1:50 у низкого процента коров (0,2 %), тогда как у больных бруцеллезом коров их определяли в титре 1:100 и выше у 84,0 % от общего количества реагирующих в РНГА. В связи с низким процентом коров, реагирующих в РНГА с молоком в титре 1:50 в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, считаем целесообразным при оздоровлении неблагополучных по бруцеллезу стад относить таких животных к больным бруцеллезом.
В доказательство достоверности результатов исследования молока в РНГА с новым S-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом провели сравнение ее с показаниями КР с молоком, РА, РСК, РНГА с сывороткой крови при обследовании коров, иммунизированных вакциной из штамма 82, в неблагополучных по бруцеллезу гуртах (табл. 20). Данные таблицы показывают, что из 25 животных с положительным результатом РНГА с молоком (титры 1:50-1:800) у 10 (40,0%) коров зарегистрировали агглютинины в сыворотке крови, причем у значительной части коров (90,0 %) их определяли в титре 200 МЕ-800 ME. РСК в титре от 1:5 до 1:80 установлена у 16 (64,0 %) животных, из них высокие титры (1:20-1:80) имели 11 гол. (64,7 %). Гемагглютинины в сыворотке крови диагностировали у 15 коров (60,0 %), из них в высоких титрах (1:400-1:1600) -у 13 (86,7 %) гол. Результаты РИД были позитивными у 10 животных (40,0 %), причем в сыворотке крови этих коров регистрировали в высоких титрах антитела в РА, РСК, РНГА. Из общего количества коров с положительными результатами РНГА с молоком бруцеллезные антитела в сыворотке крови комплексом РА+РСК+РНГА+РИД диагностировали у 16 (64,0%) животных, что подтверждает достоверность испытуемого теста. Положительные результаты КР с молоком были получены у 15 коров (60,0 %), агглютинины определяли в титре от 1:4 до 1:64.
