Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время наблюдается
тенденция перехода многих инфекционных заболеваний человека и животных в
хроническую и латентную формы, которые связаны с персистенцией
микроорганизмов, то есть со способностью патогенов к длительному
переживанию в контакте с иммунной системой макроорганизма (Бухарин О.В.,
1999). Кроме того, высокая генетическая изменчивость и скорость размножения
микроорганизмов, широкое и зачастую бесконтрольное применение
антимикробных препаратов обуславливают возникновение
антибиотикорезистентных штаммов (Дьяченко СВ., 2010), способных изменять свои патогенные и персистентные свойства. Это приводит к снижению терапевтической эффективности лекарственных средств и создает серьезные проблемы в борьбе с возбудителями инфекционных заболеваний (Яковлев В.П., Яковлев СВ., 2008).
Одним из приоритетных путей решения проблемы
антибиотикорезистентности в настоящее время считается поиск эффективных препаратов на основе природных антимикробных агентов, в том числе имеющих в своем составе естественные защитные компоненты организма-хозяина, сформированные в результате длительного процесса коэволюции микро- и макроорганизмов, к которым со стороны патогенов не наблюдается развития устойчивости (Коробов В.П. и др., 2010; Лазарев В.Н., Говорун В.М., 2010). В связи с этим несомненный научный и практический интерес представляет изучение биологических эффектов природных антимикробных агентов животного происхождения, обеспечивающих реализацию защитных и приспособительных реакций при инфицировании (Ayabe Т. et al., 2000; Moerman L. et al, 2002; Roch P. et al, 2004; Steinstraesser L. et al, 2005; Home W.S. et al, 2005), стрессорном воздействии (Korneva E.A. et al, 1997), паразитарной инвазии (McGwire B.S. et al, 2003; Park Y. et al, 2004), опухолевом росте (Сипайлова О.Ю., Корнеев Г.И., 2009).
В роли продуцентов антимикробных пептидов (АМП) в организме человека и ряда животных выступают тромбоциты и кровяные пластинки (Shultz L.D., Wilder M.S., 1971; Сулейманов К.Г. и др. 1979), которые являются носителями тромбодефенсинов (ТД). Обладая широким спектром биологических свойств, ТД являются одним из важных факторов поддержания иммунного гомеостаза макроорганизма (Сулейманов К.Г. и др., 1983). В связи с многофункциональностью данные вещества способны служить не только основой для разработки антимикробных препаратов, но и выступать в качестве соединений, обладающих необходимой модифицирующей активностью в отношении патогенного и персистентного потенциала микроорганизмов. Кроме тромбодефенсинов человека «матрицей» для антимикробного препарата могут служить антимикробные пептиды тромбоцитов и кровяных пластинок животных, поэтому понимание механизмов биологической активности тромбодефенсинов продуктивных животных и комплексное изучение их
действия на патогенный и персистентный потенциал микроорганизмов представляется весьма актуальным.
Целью настоящего исследования явилось изучение механизмов биологической активности тромбодефенсинов продуктивных животных.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
1. Изучить особенности морфофункциональной реакции
микроорганизмов на воздействие тромбодефенсинов, выделенных из
тромбоцитов кур и кровяных пластинок крови лошади и крупного рогатого
скота.
-
Оценить влияние тромбодефенсинов на вирулентные свойства условно-патогенных микроорганизмов (гемолитическую и протеолитическую активности).
-
Исследовать антиперсистентные свойства тромбодефенсинов на примере способности условно-патогенных микроорганизмов к инактивации карнозина и иммуноглобулина А.
Научная новизна. В результате проведенных экспериментов получены новые данные, характеризующие функциональные свойства природных антимикробных пептидов, выделенных из тромбоцитов и кровяных пластинок сельскохозяйственных животных. Приоритетный характер носят результаты исследования воздействия тромбодефенсинов кур, крупного рогатого скота и лошадей на внешние структуры, вирулентные и персистентные свойства условно-патогенных микроорганизмов.
Впервые с использованием атомно-силовой микроскопии оценена морфо-функциональная реакция бактериальных клеток с различным типом строения клеточной стенки на воздействие антимикробных пептидов из тромбоцитов и кровяных пластинок продуктивных животных. Зафиксирована гетерогенность морфологических и механических свойств клеток в популяциях Escherichia coli и Staphylococcus aureus при воздействии тромбодефенсинов. Отмечены пороподобные повреждения поверхности бактериальных клеток, что позволяет отнести ТД сельскохозяйственных животных к классу пороформирующих катионных антимикробных пептидов.
При изучении влияния тромбодефенсинов на способность бактерий разрушать эритроциты, установлено преимущественно ингибирующее действие данных антимикробных веществ на гемолитическую активность микроорганизмов. Наиболее эффективно снижают вирулентный признак у S. aureus и Pseudomonas aeruginosa ТД кур, а у Enterococcus faecalis - ТД крупного рогатого скота.
Показано, что антимикробные пептиды, выделенные из тромбоцитов и кровяных пластинок продуктивных животных, оказывают разнонаправленное действие на протеолитическую активность микроорганизмов: выраженность вирулентного признака микроскопических грибов Candida albicans уменьшается под действием ТД. Условно-патогенные бактерии реагируют на присутствие антимикробного средства в большинстве случаев повышением протеолитической активности.
Выявлено ингибирующее действие тромбодефенсинов на способность к инактивации карнозина бактериями рода Staphylococcus. Максимальное подавление признака отмечено после соинкубирования микроорганизмов с ТД кур. Наиболее выраженное антиперсистентное действие в отношении грамотрицательных микроорганизмов (Е. coli и Klebsiella oxytoca) оказали антимикробные пептиды лошади. Повышение уровня АКрА у Е. coli отмечено при использовании ТД крупного рогатого скота и при соинкубировании К. oxytoca с пептидами из кровяных пластинок лошади.
Установлено, что антимикробные пептиды из тромбоцитов и кровяных пластинок продуктивных животных способны модифицировать IgA-протеазную активность микроорганизмов. Снижение уровня персистентного признака отмечено у К. oxytoca и S. aureus после действия тромбодефенсинов всех исследованных видов сельскохозяйственных животных. Антимикробные пептиды оказывают разнонаправленное влияние на изученный показатель у Е. coli и С. albicans.
Практическая значимость. Полученные в результате работы данные о способности тромбодефенсинов изменять вирулентный и персистентный потенциал условно-патогенных микроорганизмов открывают перспективу для разработки путей коррекции инфекционно-воспалительных заболеваний животных с помощью антимикробных пептидов. Понимание механизмов биологической активности противомикробных агентов из тромбоцитов создает предпосылки для их использования в терапии различных инфекций.
Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ» и вошли в содержание курса лекций дисциплин «Иммунология», «Антибиотики» и «Ветеринарная микробиология и микология» для студентов специальностей «Микробиология» и «Ветеринария».
Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами. Диссертационная работа выполнялась в рамках темы открытого плана НИР ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»: «Функциональные свойства антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных» (№ государственной регистрации 0120.1252048).
Апробация работы. Результаты научных исследований доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию со дня рождения профессора Ю.В. Храмова «Энтузиазм и творчество молодых учёных, студентов в развитии ветеринарной медицины» (Оренбург, 2011); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование в условиях становления инновационной экономики» (Оренбург, 2011); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 21 века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011); Первой молодежной научной школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011); II региональном
молодежном инновационном конвенте Оренбургской области (Оренбург, 2012); IV международной научно-практической конференции «Проблемы устойчивости биоресурсов: теория и практика» (Оренбург, 2013); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы животноводства и ветеринарии: состояние и пути решения» (Краснодар, 2013).
Итоги проведенных исследований доложены на расширенном заседании кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ» (протокол № 3 от 27 сентября 2013 года).
Публикации. Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в 5 печатных работах, из них три - в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Материалы диссертации представлены на областной выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2011» (Оренбург, 2011) и отмечены сертификатом победителя. Работа удостоена медали и диплома Всероссийского конкурса научно-исследовательских работ студентов и аспирантов в области биологических наук на Всероссийском фестивале науки (Ульяновск, 2011).
Фрагменты работы были представлены на областном конкурсе научно-исследовательских работ и отмечены премией губернатора Оренбургской области (2011).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Биологическая активность препаратов тромбоцитарного экстракта, полученных из тромбоцитов и кровяных пластинок разных видов продуктивных животных различается количественно, тогда как качественные изменения бактериальных клеток, по сути, сходны.
-
Изменение вирулентных и персистентных свойств микроорганизмов под действием тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных разнонаправлено и определяется видовой принадлежностью как антимикробных пептидов, так и микроорганизмов.
-
В отношении гемолитической, протеолитической активности, а также способности к инактивации карнозина и иммуноглобулина А микроорганизмами наиболее эффективными ингибиторами выступают тромбодефенсины кур и лошади.
Объем и структура диссертационной работы.
