Введение к работе
Актуальность проблемы
Известно, что плацентарный гормон хорионический гонадотропин (ХГ) обладает выраженными иммуномодулирующими эффектами [Magnie M. et al., 1990; Shufer A. et al., 1992; Ширшев С.В., 1998; Куклина Е.М., Ширшев С.В., 2003, 2005, 2006], однако механизмы его действия изучены недостаточно. В то же время, интерес к этому гормону возрастает в плане изучения его регуляторного и терапевтического потенциала [Сole L., 2010, 2012].
Наиболее древним в филогенетическом аспекте звеном иммунной системы является врожденный иммунитет, в реализации функций которого принимают участие клетки моноцитарно-макрофагального ряда. Иммуномодулирующие эффекты ХГ реализуются в присутствии моноцитов, а также потомков моноцитов - макрофагов и дендритных клеток. Эти клетки кумулируются в децидуальной оболочке благодаря стероидному фону [Hunt J.S., 1989], принимают участие в имплантации и плацентации, участвуют в ремоделировании тканей эндометрия [Nathan C.F., 1987], а в дальнейшем определяют вид иммунного реагирования, сдвигая ответ Т-лимфоцитов в сторону Th2. Кроме того, моноциты/макрофаги осуществляют клиренсную функцию, фагоцитируя патогены, клеточный детрит и апоптотические тельца, находясь под постоянным контролем ХГ. В то же время известно, что менструальный цикл формирует условия оптимальной фертилизации гамет, оплодотворения и успешной имплантации. Так, в различные фазы менструального цикла не только меняется локальное клеточное микроокружение подслизистого слоя урогенитального тракта, но и модулируются иммунные реакции на системном уровне [Кеворков Н.Н. с соавт., 1993]. Таким образом, можно предполагать различную степень выраженности и направленности модулирующих эффектов ХГ в гестационный период в целом.
Согласно концепции Acevedo H.F [2002], ХГ не имеет своего «истинного» рецептора, реализуя эффекты через гормональный ЛГ-рецептор за счет высокой степени гомологии с ЛГ (лютеинизирующий гормон). Вследствие этого возникло предположение о взаимодействии ХГ с клетками иммунной системы через «неклассические рецепторы» - в частности, Тoll-подобные протеины (TLR) [Ширшев С.В., 2002]. Одной из экспрессируемых изоформ TLR являются TLR4, широко представленные на моноцитах и участвующие в связывании липополисахаридов (ЛПС). Известно, что введение b-субъединицы ХГ (или синтетических олигопептидов, родственных по структуре) в критических состояниях, индуцированных присутствием большого количества ЛПС, способно останавливать воспалительные реакции [van den Berg et al., 2009, 2011]. Вероятнее всего, это происходит в силу способности гормона выступать как конформационный антагонист ЛПС. Таким образом, расшифровка молекулярного механизма действия ХГ, связанного с паттерн-распознающими рецепторами на уровне клеток иммунной системы, является фундаментальной задачей, связанной с изучением филогенетически древнего механизма реализации гормон-модулирующей активности.
С позиции иммунологии репродукции, беременность представляет собой физиологически обусловленное состояние толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду. Одним из наиболее значимых механизмов формирования иммунологической толерантности является смещение акцента системных иммунных реакций в сторону гуморальных (феномен Th2-девиации) за счет преимущественной секреции противовоспалительных цитокинов [Wegmann T. et al., 1993]. Кроме того, огромное значение в этот период имеет поддержание баланса между Т-регуляторными лимфоцитами (Treg) и субпопуляциями ИЛ-17-продуцирующих лимфоцитов (Th17) [. et al., 2010]. Для объяснения механизмов, обеспечивающих нормальное развитие беременности, предложена концепция – «Th1/Th2/Th17/Treg» [Saito S. et al., 2010], суть которой заключается в том, что в период физиологически протекающей беременности в иммунной системе матери происходят изменения, сопровождающиеся доминированием Th2 и Treg над Th1- и Th17-лимфоцитами. Изменение соотношения этих клеточных подтипов, как правило, приводит к преждевременным родам или спонтанному аборту [Saito S. et al., 2010]. Известно, что во время беременности важную роль играют натуральные киллеры (NK-клетки) и Т-клетки с функциями натуральных киллеров (NKT-клетки), которые лизируют не только клетки-мишени, инфицированные внутриклеточными патогенами и неоплазмы, но также и клетки трофобласта [Baley J.E., Schacter B.Z., 1985; Cooper M.A. et al., 2001]. Посредством апоптоза плацента удаляет потенциально опасные клетки иммунной системы и тем самым формирует толерантность к фетальному трансплантату [Kayisli U.A. et al., 2003]. Помимо этого, формирование периферической толерантности осуществляется благодаря экспрессии антигенпрезентирующими клетками фермента индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), что нарушает антифетальные клеточноопосредованные иммунные реакции матери [Mellor A.L., Munn D.H., 2001]. Изучение роли ХГ в процессах регуляции данного феномена является актуальным направлением репродуктивной иммунологии.
Известно, что одновременно с ХГ, трофобласт продуцирует целый спектр цитокинов, среди которых интерлейкин-2 (ИЛ-2) наиболее важен, поскольку необходим для формирования иммунного ответа. ИЛ-2 является основным аутокринным регулятором созревания Treg [Hoyer K.K. et al., 2008] и активатором NK-клеток [King A., Loke Y.W., 2006]. В то же время, спонтанные повторяющиеся аборты сопровождаются снижением уровня Treg [Saito S. et al., 2010], повышением концентрации ИЛ-2 и NK-клеток, но при этом показана сниженная ИЛ-2-индуцируемая экспрессия STAT5 (транскрипционный фактор) в Тreg [Fainboim L., Arruvito L., 2011]. В широком смысле, взаимоотношения ИЛ-2 и CD25/STAT5 внутри системы определяют функциональность Treg и NK-клеток, поэтому представлялось важным оценить эффекты ХГ на фоне ИЛ-2-активации клеток.
Целью работы являлось исследование молекулярных и клеточных механизмов иммуномодулирующей активности ХГ на уровне эффекторных и регуляторных клеток врожденного и адаптивного иммунитета.
Задачи:
-
Изучение влияния ХГ на фагоцитарную, окислительную и секреторную активность моноцитов женщин в зависимости от фаз менструального цикла;
-
Исследование молекулярных механизмов, связанных с вовлечением молекул TLR4 в реализацию эффектов ХГ в отношении функциональной активности моноцитов периферической крови женщин;
-
Анализ модулирующих эффектов ХГ на фоне активации моноцитов периферической крови женщин ИЛ-2;
-
Изучение модулирующего действия ХГ на уровне NK- и NKT-клеток периферической крови женщин;
-
Комплексная оценка роли ХГ в формировании иммунологической толерантности на уровне эффекторов периферической крови женщин (соотношение Th1/Th2 и Treg/Th17, активность IDO);
-
Исследование модулирующих эффектов ХГ в отношении ключевых факторов иммунологической толерантности на фоне активации клеток периферической крови ИЛ-2.
Научная новизна работы. Новыми являются данные о регуляции ХГ широкого спектра показателей функциональной и секреторной активности моноцитов периферической крови женщин. Разносторонне изучены эффекты гормона в отношении регуляции процессов фагоцитоза разных корпускулярных объектов. Выявлена зависимость моноцит-модулирующего действия ХГ от фаз менструального цикла и степени активации клеток. Впервые показано, что ХГ участвует в регуляции синтеза моноцитами белкового компонента липопротеидов АПО-А1, ИФН-a и эластазы, повышая их продукцию. Впервые исследована роль «медленных» Са2+-каналов L-типа в реализации эффектов ХГ на функциональную активность моноцитов. Установлено, что ХГ способствует фенотипическому созреванию NK- и NKT-клеток, ассоциированному с усилением их цитотоксической и цитокин-продуцирующей активности. Используемые экспериментальные подходы позволили продемонстрировать новый механизм действия ХГ на уровне моноцитов, связанный с вовлечением молекул TLR4, принадлежащих к паттерн-распознающим рецепторам. Существование «альтернативной» рецепции для ХГ существенно расширяет представления о фундаментальных основах взаимодействия гормон-рецептор. Экспериментально показано, что ХГ формирует толерогенные свойства мононуклеаров человека, регулируя баланс Treg/Th17 в сторону Treg, непосредственно увеличивая количество CD4+Foxp3+ и CD4+Foxp3+CTLA-4+-клеток и снижая количество CD4+ROR-gt+-, CD4+ROR-gt+IL-17А+- и CD4+IL-17А+CCR6+-лимфоцитов. Помимо этого, ХГ смещает баланс ИЛ-4/ИФН-g, способствуя переключению иммунного ответа по Th2-типу. Впервые исследована ХГ-зависимая экспрессия IDO в моноцитах периферической крови женщин. Показана роль активации клеток ИЛ-2 в реализации эффектов ХГ на уровне моноцитов и лимфоцитов.
Предложен и запатентован новый метод оценки фагоцитарной активности клеток по поглощению бактерий генно-инженерного штамма E.coli lux+.
Теоретическая и практическая значимость. В теоретическом аспекте работа вносит вклад в расширение представления о взаимодействии иммунной и эндокринной систем, раскрывая новые аспекты механизмов иммуномодулирующей активности ХГ. Предложена гипотетическая схема действия гормона на моноциты человека с вовлечением «альтернативного» пути, связанного с TLR4. Управляемая модуляция TLR4-зависимого пути, в том числе при помощи ХГ и родственных гонадотропину олигопептидов имеет терапевтический потенциал. Установлена ключевая роль ХГ в формировании иммунологической толерантности в период беременности. Показаны иммуномодулирующие эффекты ХГ на фоне ИЛ-2-активации клеток. Эти данные открывают новые перспективы в исследовании нейроэндокринного контроля иммунной системы, а также послужат основой для последующих фундаментальных исследований. Результаты исследований необходимо учитывать при анализе патологических состояний, сопровождаемых эктопическим синтезом гормона при онкологических заболеваниях, а также в гормональной терапии, применяемой в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).
Положения, выносимые на защиту:
-
В разные фазы менструального цикла особенности рецепции гормона, связанные с уровнем половых стероидов, формируют различную чувствительность моноцитов к хорионическому гонадотропину и определяют направленность его действия. В фолликулярную фазу цикла гормон преимущественно угнетает фагоцитоз и продукцию активных форм кислорода, одновременно стимулируя секреторную активность клеток. В лютеиновую фазу цикла гормон стимулирует фагоцитоз, одновременно угнетая продукцию активных форм кислорода, практически не влияя на секреторную активность клеток.
-
На уровне моноцитов продемонстрирован новый молекулярный механизм реализации эффектов хорионического гонадотропина, вовлекающий Toll-подобные рецепторы 4 типа. Показано, что гормональная регуляция фагоцитоза и продукция моноцитами интерферона-a осуществляется через взаимодействие с Toll-подобными рецепторами 4 типа.
-
Хорионический гонадотропин способствует фенотипическому созреванию NK- и NKT-клеток, ассоциированному с усилением их цитотоксической и цитокинпродуцирующей активности, повышая экспрессию этими клетками CD16/CD56. Хорионический гонадотропин ослабляет интерлейкин-2-стимулирующие эффекты на уровне NK-клеток, снижая, таким образом, генерацию лимфокин-активированных клеток.
-
Хорионический гонадотропин является одним из факторов, способствующих поддержанию периферической иммунологической толерантности при беременности. Так, гормон регулирует баланс Th1/Th2 и Th17/Treg в сторону увеличения количества Treg и Th2, параллельно угнетая Th17. Одновременно хорионический гонадотропин ко-стимулирует индуцированную активность индолеамин-2,3-диоксигеназы моноцитов.
-
Активация клеток интерлейкином-2 может как усиливать, так и отменять эффект хорионического гонадотропина. Так, количество Treg, NK- NKT-клеток и активность индолеамин-2,3-диоксигеназы моноцитов увеличивается при совместном действии гормона и цитокина. Эффекты хорионического гонадотропина в отношении баланса Th1/Th2 на фоне активации клеток интерлейкином-2 меняют свою направленность, а также частично отменяются депрессивные эффекты на показатели фагоцитоза и уровень миелопероксидазы.
Внедрение результатов. Полученные данные внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Пермского государственного национального исследовательского университета» в программе спецкурсов «Общая эндокринология» и «Иммунология репродукции».
Разработанный метод оценки фагоцитоза используется в работе Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН для научных исследований.
Апробация результатов исследований. Результаты представлены на V, VIII, XIII Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001, 2005, 2009 гг.»; II, VIII, IX конференции иммунологов Урала, 2002 г. (Пермь), 2010 г. (Cыктывкар), 2011 г. (Челябинск); 7-ой и 12-ой Международной научной конференции молодых ученых «Биология – наука 21-го века», 2003 и 2008 гг.; Объединенном иммунологического форуме, 2004 г. (Екатеринбург) и 2008 г. (Санкт-Петербург); Международной научно-практической конференции «Иммунологические аспекты репродукции человека», 2008 г. Новосибирск; VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды. Адаптация. Иммунитет», 2008 г., Пермь - Н. Новгород – Пермь; 2-м Европейском конгрессе по иммунологии, 2009 г., Берлин (Германия); VI Mеждународной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», 2009 г., Москва, ММА им. Сеченова; Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», 2011 г., Пущино; I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», 2011 г., Пермь; V Всероссийской конференции «Иммунология репродукции», 2012 г., Иваново; XII Конгрессе РААКИ, 2013 г., Москва.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав экспериментальной части, заключения и выводов. Работа содержит 45 рисунков и 24 таблицы. Список литературы содержит 353 источника, в том числе 72 отечественных, 281 зарубежных.
Публикации. Материалы диссертации обобщены в 54 печатных работах, из них: 32 публикации (включая 20 статей) в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, 7 статей в сборниках, 1 патент РФ на изобретение.
Работа выполнена в рамках плана НИР «Механизмы гормональной регуляции иммунной системы» № Государственной регистрации – 0120.0 809371. Работа поддержана грантом Фонда содействия отечественной науке «Выдающиеся ученые. Кандидаты и доктора наук» (2008-2009). Часть исследований выполнена в рамках программ президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», «Изучение молекулярных механизмов иммуномодулирующего действия гормонов репродукции» (2009-2011) и «Клеточные и молекулярные механизмы гормонального контроля функциональной активности иммунной системы в период гестации» (2012).
Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории иммунорегуляции ФГБУН Института экологии генетики и микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук (зав. лаб. д.м.н., профессор Ширшев С.В.). Автор благодарит за помощь в проведении исследований к.б.н., с.н.с. Орлову Е.Г., к.б.н., н.с. Некрасову И.В., к.б.н., м.н.с. Тимганову В.П. и зав. лабораторией экологической иммунологии, к.м.н., доцента Бахметьева Б.А.
