Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные аспекты профилактики системных инфекционных осложнений при стоматологическом лечении больных с заболеваниями сердечно-сосудистойсистемы .
Аналитический обзор литературы 11
1.1. Роль микроорганизмов полости рта в развитии патологии сердечнососудистой системы 11
1.2. Антибиотикопрофилактика системных инфекционных осложнений при стоматологическом лечении у больных с заболеваниями сердечнососудистой системы 24
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования.
2.1. Методы клинических исследований 32
2.2. Методы лабораторных исследований
2.2.1. Взятие исследуемого материала 35
2.2.2. Определение ДНК Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis с помощью набора реактивов "Мультидент -5 "
2.2.2.1. Выделение ДНК из содержимого пародонтального кармана 36
2.2.2.2. Выделение ДНК из содержимого атеросклеротической бляшки..36
2.2.2.3. Амплификация ДНК 37
2.2.2.4. Полимеразная цепная реакция с праймерами пародонтопатогенных анаэробных бактерий 38
2.2.2.5. Детекция продуктов амплификации 43
2.3. Оределение чувствительности анаэробных бактериальных культур к антибиотикам
2.3.1. Определение чувствительности анаэробных бактериальных культур диско-диффузионным способом 44
2.4. Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК)
исследуемых антибактериальных препаратов 47
2.5. Методы статистической обработки результатов исследования 49
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований.
3.1. Идентификация пародонтопатогенных бактерий у больных ХГП в пародонтальных карманах и атеросклеротических бляшках сосудов...50
3.2. Выявление пародонтопатогенных бактерий у больных с ХГП легкой и средней степеней тяжести в пародонтальных карманах и атеросклеротических бляшках 53
3.3. Анализ чувствительности микробных ассоциаций к антибиотикам, выделенных у больных хроническим генерализованным пародонтитом 67
3.4. Определение чувствительности и МПК антибактериальных препаратов у клинических штаммов пародонтопатогенной группы 70
3.5. Клиническая эффективность профилактики системных инфекционных осложнений при стоматологическом лечении больных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы 76
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов и заключение 91
Выводы 100
Практические рекомендации. 101
Список литературы
- Антибиотикопрофилактика системных инфекционных осложнений при стоматологическом лечении у больных с заболеваниями сердечнососудистой системы
- Определение ДНК Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis с помощью набора реактивов "Мультидент -5 "
- Определение чувствительности анаэробных бактериальных культур диско-диффузионным способом
- Выявление пародонтопатогенных бактерий у больных с ХГП легкой и средней степеней тяжести в пародонтальных карманах и атеросклеротических бляшках
Введение к работе
з Введение.
Вопрос о проведении антибактериальной профилактики при оказании стоматологической помощи пациентам, имеющим заболевания сосудов и клапанов сердца, в настоящее время является актуальным (Царёв В.Н., Р.В.Ушаков, 2006; Грудянов А.И., Овчинникова О.О., 2007). Это связано с тем, что причиной транзиторной бактериемии, вызванной различными микроорганизмами, могут быть стоматологические манипуляции: проведение профессиональной гигиены (88%), удаления зуба (60%), тонзиллэктомия (35%), особенно в тех случаях, когда зону проведения операции орошают струей воды, или, когда больные сразу после этого начинают принимать пищу (Durack et al., 1995; Seymur et al., 2003). Риск бактериемии различными видами микробов значительно усиливается при наличии каких-либо инфекционных поражений полости рта (Шелков-ский В.Н., 1999; Wilson et al., 2008).
Одной из причин адгезии микробов в сосудах и сердце является повреждение слоя эндотелиальных клеток, покрывающих клапан или эндоваскулярные поверхности. Локальное повреждение эндотелиальной ткани влечет за собой отложение в этом месте тромбоцитов и фибрина - обычную реакцию, с которой начинается процесс заживления. Последующее образование на клапане, которое называется небактериальным тромботическим эндокардиальным повреждением, является благоприятным очагом для колонизации микробов, ведущей к развитию инфекционного эндокардита (Тюрин В.П., 2002).
В настоящее время доказана роль целого ряда бактерий полости рта -Streptococcus viridans, S. sanguis, S. oralis, S. mutans, Aggregatibacter actinomyce-temcomitans, Eikenella corrodens - в возникновении и развитии инфекционного эндокардита (Berbari E.F. et al., 1997, Burnette-Curlev et al., 1995, Fenno et al., 1989, Viscount etal., 1997).
Однако до сих пор не уточнён круг основных возбудителей пародонтита -видов, относящихся к пародонтопатогенной группе и их роль в развитии инфекционного эндокардита. Единичные сообщения появились в литературе
только в последние годы (Zaremba et al., 2007). В связи с изменением чувствительности микроорганизмов полости рта к антибиотикам, требуется мониторинг резистентных штаммов и подбор препаратов, наиболее пригодных для ан-тибиотикопрофилактики осложнений стоматологического лечения.
Цель работы
Повышение эффективности профилактических мероприятий системных инфекционных осложнений при проведении стоматологического лечения больных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы.
Задачи исследования
1. Используя методы анаэробного культивирования и молекулярно-
биологического исследования, выявить в материале пародонтальных карманов
и атеросклеротических бляшек сосудов и клапанов сердца у пациентов хрони
ческим генерализованным пародонтитом лёгкой и средней степени представи
телей пародонтопатогенных видов бактерий.
Определить сравнительную частоту и статистическую вероятность обнаружения маркерной ДНК пародонтопатогенных видов бактерий в атеросклеротических бляшках и в пародонтальном кармане у пациентов хроническим генерализованным пародонтитом, прошедших полноценную профессиональную гигиеническую обработку полости рта на этапе подготовки к хирургическому лечению по поводу осложнений атеросклероза сосудов.
Установить закономерности выделения пародонтопатогенных видов в содержимом пародонтальных карманов и атеросклеротических бляшках.
Уточнить группу антибиотиков и антибактериальных химиопрепаратов, которые характеризуются наибольшим уровнем воздействия на штаммы пародонтопатогенных видов из числа наиболее часто используемых в стоматологической практике.
Обосновать схемы применения антибиотиков и антибактериальных химиопрепаратов для профилактики инфекционных осложнений, у больных в период подготовки к операциям на сердце и сосудах, при проведения стоматологического лечения больных хроническим генерализованным пародонтитом
лёгкой и средней степени тяжести. Научная новизна
Впервые в отечественной практике при диагностике заболеваний сердца и сосудов у стоматологических пациентов использован отечественный набор реактивов для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции с праймерами пародонтопатогенных видов бактерий: A. actinomycetemcomitans, Р. gingivalis, P. intermedia, T.forsythia, Т. denticola.
Впервые в России изучена структура микробных ассоциаций, колонизирующих сосуды с атеросклеротическими бляшками, участки пораженных клапанов сердца и эндокарда и определено присутствие пародонтопатогенных видов в этих образованиях при наличии пародонтита легкой и средней степени тяжести.
Впервые определена чувствительность к антибиотикам и антибактериальным химиопрепаратам различных фармакологических групп бактерий полости рта, способных вызывать дессиминированные инфекционные осложнения при стоматологическом лечении.
Полученные данные клинических, микробиологических и молекулярно-биологических исследований позволили разработать новые диагностические алгоритмы и схемы антибиотикопрофилактики при лечении заболеваний паро-донта у больных с сердечно-сосудистой патологией.
Практическое значение работы
Предложено использовать отечественную тест-систему мультиплексной ПЦР (ООО «НПФ 'Тенлаб"», Россия) для обследования пациентов, имеющих высокий риск развития системных инфекционных осложнений при стоматологическом вмешательстве.
Для практического здравоохранения разработаны схемы антибиотикопрофилактики системных инфекционных осложнений при стоматологических вмешательствах у пациентов в группах риска, в частности перед проведением операций на сосудах и сердце.
6 Основные положения, выносимые на защиту:
У пациентов с заболеваниями сердца и сосудов в материале пародон-тальных карманов и атеросклеротических бляшек с помощью ПЦР и при бактериологическом исследовании с использованием анаэробной техники выявляются представители бактерий идентичных видов, относящихся к пародонтопато-генной группе.
Частота выявления маркерной ДНК бактерий пародонтопатогенных видов с помощью молекулярно-биологичесого метода исследования и их ассоциаций отличается при хроническом генерализованном пародонтите лёгкой и средней степени тяжести.
Наличие хронического генерализованного пародонтита у пациентов, готовящихся к операциям по поводу патологии клапанов сердца или сосудов, является фактором риска развития инфекционного эндокардита и требует специальных схем диагностики и антибактериальной профилактики.
Схемы применения антибактериальных препаратов, основанные на результатах изучения чувствительности штаммов пародонтопатогенных видов к антибактериальным препаратам, используемым в стоматологии.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО МГМСУ и в лечебном процессе стоматологической клиники ООО «Практика-С».
Личное участие автора
Автор проводила обследование и лечение пациентов, присутствовала на операциях и проводила забор материала для лабораторных исследований, производила 3/4 лабораторных исследований, систематизацию и статистическую обработку полученных данных, лично готовила научные работы по теме диссертации.
Публикации
По материалам исследования опубликовано б печатных работ, в том числе: 3 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Апробация диссертации
Основные положения работы были представлены на XI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 20-летию стоматологического факультета Саратовского государственного медицинского университета; на Всероссийской конференции с международным участием «Современные аспекты профилактики стоматологических заболеваний»; на совместном заседании кафедр: стоматологии РМАПО, ортопедической и общей стоматологии РМАПО, микробиологии, иммунологии и вирусологии МГМСУ (протокол № 6 от 22 июня 2009 г.); совместном заседании кафедры госпитальной терапевтической стоматологии, пародонтологии и гериатрической стоматологии; кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО МГМСУ; лаборатории молекулярно-биологических исследований НИМ-СИ ГОУ ВПО МГМСУ; кафедры стоматологии ГОУ ДПО РМАПО (протокол № 10 от 25 июня 2009 года).
Объём и структура диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, главы, описывающей результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка использованной литературы. Работа включает 15 таблиц, 12 рисунков и 13 фотографий. Литература представлена 30 отечественными авторами и 71 зарубежным автором. Диссертация изложена на 112 страницах компьютерного текста Times New Roman.
Антибиотикопрофилактика системных инфекционных осложнений при стоматологическом лечении у больных с заболеваниями сердечнососудистой системы
В настоящее время установлено, что возбудителями ИЭ являются бактерии, грибы, риккетсии, хламидии, микоплазма, вирусы, однако основными возбудителями заболевания продолжают оставаться стрептококк и стафилококк. Некоторые бактерии полости рта (например стрептококк, A.actinomycetemcommitaus, ЕікепеПа corrodens и др.) известны как возбудители принимающие участие в развитии инфекционного эндокардита. Бактериемия, связанная с пародонтитом является фактором риска стенокардии и инфаркта миокарда и пр.
Группа зеленящего стрептококка (Streptococcus viridans) - резидентные микроорганизмы полости рта и глотки: Str. sanguis, Str. oralis (mitis), Str. salivarius, Str. mutans и др. Удельный вес стрептококка среди этиологических факторов ИЭ клапанов сердца в последнее десятилетие возрос до 43-61%. Это происходит за счет не только зеленящего стрептококка, но и стрептококков других групп, в частности бета-гемолитического стрептококка групп А, В, С, D и G. Частота выявления зеленящего стрептококка в клапанах сердца составляети 25,1%. Другие авторы сообщают о выделении зеленящего стрептококка у 33-61,9% больных ИЭ. Столь высокая частота стрептококка среди этиологических факторов позволяет говорить о том, что он приспособился к новым условиям существования, в том числе и к воздействию антибиотиков и вновь выходит на первую позицию, как в 30-60-е годы (С.Н. Козлов, Р.С. Козлов ,2009).
В эксперименте показано, что некоторые разновидности S.sanguis активизируют агрегацию тромбоцитов, w эти тромбоциты, в совокупности с S.sanguis, и являются, вероятно, причиной скопления тромбоцитов и фибрина на эндотелии поврежденных сердечных клапанов (Herzberg et al., 1983, Herzberg et al., 1985;Herzberg et al, 1992, Herzberg et al, 1996).
Многочисленные доказательства влияния стрептококков на развитие эендокардита приведены в исследованиях многих авторов (Fenno et al., 1989; Burnette-Curlev et al., 1995; Viscount et al., 1997).
Энтерококки {Enterосо ecus) - резидентная микрофлора желудочно-кишечного тракта и передней уретры - оказались причиной подострого ИЭ только у 2,8-18% больных, а энтерококк и стрептококк группы D - у 24,7% больных пожилого возраста. Вновь, как и в первой половине XX века, среди возбудителей ИЭ стал фигурировать пневмококк {Streptococcus pneumoniae) — в 2,3-3% случаев. Группа стафилококка {Staphylococcus) представлена коагулазопозитивными и коагулазонегативными штаммами. Стафилококки были причиной ИЭ у 10-39,4% больных (Николаевский Е.Н., 2003). Дифтероиды {Corynebacterium) - грамположительные бактерии, вызывают ИЭ у пациентов с пониженным иммунитетом, с протезами клапанов сердца и у наркоманов. Наблюдения последних лет свидетельствуют о дальнейшем возрастании удельного веса грамотрицательной микрофлоры в этиологии ИЭ: синегнойной палочки, энтеробактерий, сальмонелл и др. Они являются причиной заболевания в 10,8-21% случаев, в том числе группа НАСЕК (по первым буквам входящих в нее микроорганизмов Haemophilus aprophilus, Haemophilus paraprophilus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikinella corrodens, Kingella kingae) — в 3-7% случаев. Эти микроорганизмы можно считать частью флоры верхних дыхательных путей и полости рта. ИЭ, вызванный грамотрицательной флорой, обычно развивается у больных после кардиохирургических операций (Тазина С.Я., Гуревич М.А., 2000;Von Scoy R.E. ,1998). Анаэробный эндокардит характеризуется высокой активностью инфекционного процесса, резистентностью к антибактериальной терапии, повышенной госпитальной летальностью (до 46-65%). К особенностям течения анаэробного эндокардита относят частое (41,2-64,5%) образование тромбофлебитов, тромбоэмболии в сосуды лёгких, сердца и головного мозга (ТазинаСЯ., 1999)
Гонококк (Neisseria gonorrhoeae) был распространенной причиной эндокардита в доантибиотическую эру. Частота его составляла 11-26% среди всех случаев ИЭ.
Бруцеллы (Brucella) — грамотрицательные коккобактерии ; риккетсия, микоплазма, хламидии,рохалимеа - также могут вызывать ИЭ.
В 1933 г. был описан первый случай грибкового ИЭ клапанов сердца. Многочисленные грибковые микроорганизмы способны вызывать эндокардит, но наиболее распространенными являются грибы родов Candida и Aspergillus, которые обладают выраженной тропностью к эндокарду (Буткевич О.М., Виноградова Т.Л., 1997; Mayer D.V., Edwards J.E., 1997).
В развитии инфекционного эндокардита ключевым моментом является адгезия перечисленных выше микроорганизмов в поврежденным клапанам сердца.
Множество факторов вероятно играют схожие роли в содействии заражению. Глюканы, синтезируемые стрептококком из диетической сахарозы организма, вызывают прилипание на поверхности зуба и вовлечены в образование кариеса (Murno et al., 1993). Множество исследований также подтверждают участие этих полимеров в инфекционном эндокардите. Разновидности стрептококков, которые производят глюканы, прилегают к тромбам фибрина-тромбоцита лучше, чем разновидности не производящие глюканы (Crowford et al., 1986), а производящие - S.sanguis более активны в провоцировании экспериментального эндокардита, чем неизогенные разновидности (Meddens et al., 1984).
Практикующими врачами отмечены многочисленные случаи, которые і доказывают связь между неудовлетворительным состоянием полости рта пациента (инфекция, потерянные зубы и т.д.) и проблемами сердца. В 14-летнем изучении, которое вовлекло 20000 обследуемых, было определено, что болезни пародонта были статистически значимым фактором риска для болезней сердца (DeStefano et al., 1993).
Обследуемые люди с пародонтитом тяжелой степени имели большую степень риска для развития инфаркта миокарда, атеросклероза. Больные с болезнями пародонта имеют в 2 раза больше шансов к фатальному исходу сердечно-сосудистых заболеваний и инфаркта миокарда.
Воспалительные клетки и воспалительные медиаторы (фактор некроза опухоли альфа (ФНО-а), интерлейкин! бета (1L-P) и простогландин Е2 (PGE2) играют ключевую роль у человека имеющего сердечно-сосудистые заболевания и атеросклероз. (Valtonen, 1991; Pearce et al., 1992; Fank et al., 1993; Marcus et al., 1993).
Бактериальный липополисахарид вводит экспрессию ИЛ-13, который препятствует фибринолизису, но способствует коагуляции и тромбообразованию (Clinton et al., 1991). Valtonen, (1991) показал, что патологические изменения аорты связаны с большим количеством моноцитов, секретирующих ФНО и ИЛ-1(3. Эти цитокины повышают накопление холестерина в моноцитах и увеличивают пролиферацию гладкой мышцы, в результате утолщаются стенки сосудов (Marcus et al., 1993). Таким образом, липополисахарид + моноцит + путь активации воспалительного медиатора являются важным механизмом в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний и атеросклероза (Beck et al., 1996).
Определение ДНК Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis с помощью набора реактивов "Мультидент -5 "
ДНК выделяли методом ускоренной пробоподготовки с помощью реактивов производства ООО «НПФ "Генлаб"» в соответствии с инструкциями фирмы производителя (Комплект реагентов для пробоподготовки) (рис. 2.2.). Для этого пробирки с исследуемым материалом центрифугировали 10 мин при 10000 об/мин. Супернатант удаляли и добавляли в каждую пробу по 100 мкл "Реалекса" при тщательном перемешивании. После инкубации в течение 10 мин при 56 С перемешивали пробирки на вортексе в течение 5 с. Инкубировали пробирки еще 10 мин при 99 С и, перемешав на вортексе в течение 5 с, снова центрифугировали их 30 с. при 10000 об/мин. Супернатанты переносили в новые пробирки.
ДНК из атеросклеротической бляшки выделяли методом "универсальной пробоподготовки", используя наборы реагентов GenePak DNA PCR test (ООО "Лаборатория Изоген", Москва), рекомендуемых для выделения ДНК из гомогенатов тканей, богатых ДНК, в соответствии с инструкциями фирмы производителя.
Для этого биоптат предварительно измельчали с помощью тефлонового микрогомогенизатора. В 1,5 мл полипропиленовую пробирку вносили гомогенизированный ткань атеросклеротической бляшки, добавляли 300 мкл Лизирующего реагента и перемешивали, переворачивая пробирку. Термостатировали пробирку при 65 С 30 мин. При наличии несолюбилизированного осадка пробирку центрифугировали 5 - 10 с при 5000 об./мин. Супернатант переносили в чистую пробирку, а осадок отбрасывали. Добавляли к супернатанту 20 мкл суспензии сорбента NucleoS, который перед использованием интенсивно встряхивали на вортексе до полного гомогенного состояния. Перемешивали содержимое пробирки 5 мин, центрифугировали 10 с при 5000 об./мин и удаляли супернатант с помощью водоструйного насоса. После осаждения сорбента и удаления супернатанта осадок промывали 200 мл Лизирующего реагента. Добавляли в пробирку 1,0 мл Солевого раствора и интенсивно перемешивали. Центрифугировали 10 с при 5000 об./мин, супернатант удаляли с помощью водоструйного насоса. К осадку добавляли 1,0 мл Солевого раствора, тщательно перемешивали на вортексе. Центрифугировали 10 с при 10000 об./мин, супернатант удаляли с помощью водоструйного насоса. Повторяли отмывку еще один раз. Осадок подсушивали при 65С 3-5 мин. Добавляли в пробирку 100 мкл исходного ЭкстраГена. Суспендировали содержимое пробирки на вортексе 5-10 с до гомогенного состояния, после чего термостатировали 5 мин при 65С. Еще раз суспендировали содержимое пробирки, затем центрифугировали 1 мин при 10000 об./мин. Переносили чистый супернатант с ДНК (без гранул ЭкстраГенагм и NucleoS) в пробирку для хранения или сразу использовали для постановки ПЦР.
Перед проведением ПЦР исходную ДНК- полимеразу разводили буфером для разведения ДНК - полимеразы до конечной активности 1 ед./мкл, аккуратно перемешивали пипетированием. Вносили в полипропиленовые пробирки, вместимостью 500-мкл по 19 мкл реакционной смеси и 1 мкл разведенной ДНК - полимеразы. Для предотвращения испарения реакционной пробы осторожно наслаивали по 25 мкл вазелинового масла. В пробирку, промаркированную ОК (отрицательный контроль), вносили 5 мкл ОК под масло. В пробирку, промаркированную ПК (положительный контроль), вносили 5 мкл ПК под масло. В пробирки, промаркированные порядковыми номерами, вносили под масло по 5 мкл ДНК, выделенной из исследуемого материала. Пробирки помещали в предварительно прогретый до +95С программируемый термостат (амплификатор «Терцик МС - 2», производитель "ДНК - технология", г. Москва) и проводили амплификацию в режиме регулирования температуры "Матрица" по следующей программе: денатурация при +95С в течение 120 с, 1 цикл; денатурация при +95С в течение 30 с, отжиг при +60С в течение 30 с, синтез при +72С в течение 40 с, 33 цикла; синтез на конечной стадии при +72С в течение 240 с, 1 цикл.
Поэтому для быстрой и точной идентификации пародонтопатогенных бактерий в исследуемом материале применяли полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием ДНК-зондов с генетическими маркерами перечисленных видов (тест-система «MicroDent», Германия). Преимуществами этой методики являются не только высокая специфичность и быстрота (результат исследования получают в течение нескольких часов), но и отсутствие необходимости наличия живых микробов, т.е. в этом случае не надо решать довольно сложную и трудоемкую задачу по обеспечению анаэробных условий на, этапе транспортировки материала в лабораторию (Царев В.Н.С соавт;, 2002)
Для оценки специфичности и чувствительности системы «Мультидент» (совместная разработка НИМСИ при МГМСУ с фирмой «Гентех», РФ) при выявлении маркерных пародонтопатогенных видов использовали: А) микробиологические - классическое бактериологическое исследование в анаэробных и аэробных условиях; определение чувствительности выделенных культур к антибактериальным препаратам; Б) метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей обратной гибридизацией с помощью теста MicroDentR (Германия) (рис.4) аналогичного тесту «МультиДент» (ООО «НПФ "Генлаб"», Россия).
Амплификацию, электрофорез и регистрацию результатов осуществляли с использованием оборудования отечественного производства для проведения амплификации ДНК - термоциклер «Терцик»(рис. 2.3.), специальной камеры для электрофореза и трансиллюминатора (рис.2.4.) («ДНК-технология», Россия).
Отбор образцов производили с помощью стерильного абсорбера. В течение 1 часа образцы доставляли в лабораторию кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии МГМСУ, в которой проводились лабораторные исследования с помощью ПЦР. Для выделения ДНК использовали метод ускоренной пробоподготовки с помощью набора реагентов для выделения ДНК из клинического материала (ООО «Гентех»),
Для этого исследуемый материал центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут и удаляли надосадочную жидкость. Добавляли к осадкам по 75 мкл раствора «Реамикс» и тщательно перемешивали на. вортексе.-Инкубировали пробирки в термостате при 56 ±1 С, в течение 10 минут, затем еще 10 минут при 99 ±1 С. Центрифугировали пробирки при 10000 об/мин 5-10 секунд при комнатной температуре для осаждения капель со стенок пробирок. Тщательно перемешивали на вортексе. Центрифугировали пробирки при 10000 об/мин в течение 30 секунд при комнатной температуре для осаждения разрушенных клеточных структур. Супернатант отбирали в новые пробирки. Полученные пробы использовали в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации, либо хранили при - 18 С в течение одной недели до исследования.
Для амплификации ДНК пародонтопатогенных бактерий Actinobacillus actinomycetemcommitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus и Treponema denticola применяли метод мультиплексной ПНР, позволяющей использовать одновременно 2-4 и более перекрещивающихся праймеров нескольких возбудителей (Ashimoto A., et al, 1996). В реакционные пробирки для амплификации объемом 0,5 мл (QSP, США) вносили по 35 мкл смеси праймеров/нуклеотидов (Hain Diagnostika GMBH, Германия), 5 мкл 10-кратного ПЦР - буфера с конечной концентрацией MgCb 2,5 mM и 0,5 мкл Taq - полимеразы (ООО "Гентех"). В пробирку с отрицательным контролем вносили 9,5 мкл деионизированной воды. Во все остальные пробирки добавляли по 5 мкл подготовленных клинических проб и 4,5 мкл воды. Тщательно перемешивали пипетированием, затем наслаивали по одной капле (15-20 мкл) вазелинового масла. Пробирки закрывали, центрифугировали 5 сек при 3 тыс. об/мин и помещали в амплификатор ("Терцик"). Проводили ПЦР в следующих температурных режимах в соответствии с заданной компьютерной программой прибора (табл. 2.2.2.4.1.).
Определение чувствительности анаэробных бактериальных культур диско-диффузионным способом
Клиническая эффективность профилактики системных инфекционных осложнений при стоматологическом лечении больных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы. Из 50 обследованных пациентов имеющих хронический генерализованный пародонтит легкой степени тяжести, у 34 мы проводили лечение пародонтита до проведения операций на сосудах и проводили клиническое обследование перед сосудистой операцией и после нее. Следует отметить, что практически все пациенты этой группы (32 из 34 -94% из 100%) предъявляли жалобы на кровоточивость и зудящую боль в области десен, которая провоцировалась чисткой зубов, приемом пищи, неприятный запах изо рта. 18 человек отмечали дискомфорт и боль под воздействием холодного и горячего (таблица 3.5.1.). Таблица
У 13 (38,23%) пациентов с хроническим воспалительным процессом в тканях пародонта легкой степени были выявлено незначительное увеличение регионарных лимфатических узлов, иногда их болезненность. При обострении пародонтита у 9 (26,47%) больных выявлялись лимфатические узлы - увеличенные, не спаянные с окружающими тканями, слабоболезненные при пальпации.
Среди факторов способствующих развитию пародонтита у 13 человек преддверие рта было мелким (глубина не более 5 мм), у 12 (35,29%) больных - средним — от 8 до 10 мм, у остальных - глубоким — более 10 мм.
У 3 (8,8%) больных выявлена недостаточная ширина прикрепленной десны, напряжение губ и натяжение уздечки, что способствовало рецессии десны.
Среди других местных этиологических факторов нами были выявлены: деформация зубных дуг у 3 (8,8%) больных, скученность зубов у 3 (8,8%%) больных, наличие трем и диастем у 6 (17,6%%) больных. У 3 (8,8%) больных отмечена травматическая окклюзия.
Клинические признаки первичной травматической окклюзии свидетельствовали о очаговости (локализованности) поражения, наличии дефектов зубных рядов, зубочелюстных аномалий, деформаций окклюзионной поверхности зубных рядов, пломб и протезов. При рентгенологическом обследовании (ортопантомограммы) выявлены отсутствие компактной пластинки, снижение вершин межальвеолярных перегородок до 1/3 их высоты (рис. 3.13.)
Ортопантомограмма пациента С, 54 года. Хронический генерализованный пародонтит легкой степени тяжести. Анализ данных рентгенологического исследования показал, что индекс по Fush в этой группе составил 0,96±0,1 балла. Исходное состояние пародонтологических и гигиеническихз индексов представлено в табл. 3.5.2.
Таким образом, состояние тканей пародонта у 34 из 50 пациентов, имеющих признаки хронического генерализованного пародонтита легкой степени тяжести требуют проведения комплексного пародонтологического лечения перед проведением операции, связанной с патологией сердечнососудистой системы. Следует отметить, что клиническое течение пародонтита, у данной категории пациентов, практически не отличается от «классического» течения и соответствует стадии обострения. Остальные пациенты этой группы не имели признаков обострения и стоматологическая помощь заключалась только в проведении профессиональной гигиены. При обращении к стоматологу пациенты данной группы, после обучения гигиены полости рта и проведения профессиональной гигиены, проводилась антимикробная химиотерапия с использованием препаратов Кларитромицин, Цефтриаксон, Амоксиклав обоснование применения которых у данного контингента больных представлено выше.
Кюретаж пародонтальных карманов у пациентов этой группы производился на фоне антимикробной химиотерапии.
Состояние пародонта у обследованных оценивали до пародонтологического лечения, через 14 дней (кроме зондирования пародонтальных карманов) после проведения комплекса лечебных мероприятий, и перед кардиологической операцией (так же кроме зондирования пародонтальных карманов) (табл. 3.5.2.)
Таблица 3.5.2. Состояние тканей пародонта при хроническом генерализованном пародонтите легкой степени у пациентов с патологией сердечнососудистой системы при подготовке к операциям на клапанах сердца до и после проведения пародонтологического лечения (М±т).
Параметры Индекс гигиены ПМА Глубина пародонтальны х карманов, мм Индексы частоты, %: кровоточивости десен выделения экссудата
Из данных, представленных в таблице, видно, что после проведения лечебных мероприятий значительно улучшилось гигиеническое состояние полости рта статистически достоверно (Р 0,05), уменьшались воспалительные явления в тканях пародонта, что отмечено существенными положительными изменениями всех исследованных клинических индексов (Р 0,05): ИГ, ПМА, кровоточивости.
Перед проведением кардиологической операции уровень гигиены полости рта оставался удовлетворительным - ИГ составил 0,3 балла вместо 1,34 балла до начала профессиональных гигиенических мероприятий (Р 0,05). Индексы ПМА, ПИ и частоты кровоточивости также были достоверно ниже исходных значений.
Таким образом, клинические показатели стоматологического статуса, в частности состояние тканей пародонта, перед проведением операций на сосудах и сердце соответствовало ремиссии воспалительного процесса. Полость рта данных пациентов оценивалась как «санирована», что было подтверждено при проведении исследования на пародонтопатогенные микроорганизмы в области зубо-десневой борозды.
В третьей подгруппе сравнения наблюдали и лечили 30 пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом средней степени в возрасте от 21 до 56 лет (11 мужчин и 19 женщин). Пациенты предъявляли жалобы на кровоточивость десен при приеме пищи и запах изо рта, подвижность зубов. Отмечены гиперемия и отечность десен, изменение их конфигурации, глубина ПК выявлялись до 5 мм.
При рентгенологическом обследовании выявляли признаки резорбции смешанного типа, что обуславливало подвижность зубов I-II степени и развитие травматической окклюзии. Индекс по Fuch составил 0,89±0,01 балла (рис. 3.14.)
Выявление пародонтопатогенных бактерий у больных с ХГП легкой и средней степеней тяжести в пародонтальных карманах и атеросклеротических бляшках
Опыт хирургии при активном ИЭ нативных клапанов сердца показывает, что выбор времени операции является одним из определяющих результаты фактором, потому что госпитальная летальность часто зависит от метастатической инфекции и полиорганной недостаточности.
Избежать этих негативных явлений, позволяет правильная этиологическая диагностика с использованием молекулярно-биологического метода исследования (ПЦР-диагностика). микробиологически обоснованная тактика выбора антибиотикотерапии с учётом видовой идентификации инфекционного агента и его чувствительности к антибактериальным препаратам. Это позволило нам обосновать и применить различные схемы применения антибиотиков для периоперационной профилактики.
Аналогичные исследования были проведены ранее при ИЭ за рубежом. Эффективность амоксиклава для профилактики бактериемии после лечения зубов была продемонстрирована у детей и у взрослых. Недавно Локхарт (Lockhart, 2004) обнаружил, что профилактика амоксиклавом также уменьшала продолжительность бактериемии, вызванной удалением зубов у группы детей, подвергающихся лечению зубов под общей анестезией, поскольку все гемокультуры, собранные в амоксиклав группе через 30 и 45 минут после завершения заключительного удаления оказались отрицательными (0 % против 16% и 14% положительных гемокультур для контрольной группы, соответственно). В настоящем исследовании профилактика амоксиклавом также значительно уменьшала распространенность и продолжительность бактериемии, вызванной удалением зубов. Балч и другие (Baltch et al., 1982) и Джозефссон и другие (Joseffson et al., 1985) продемонстрировали, что полимикробная бактериемии, вызванная удалением зубов была менее частой в случаях, когда пациент получил профилактическую дозу бета-лактамного антибиотика; в настоящих исследованиях, случаи полимикробной бактериемии в амоксиклав группе не наблюдались. Стрептококки группы Viridans являются наиболее часто выделяемыми бактериями в гемокультурах после удаления. Профилактика амоксиклавом показала "избирательное действие" на Streptococcus spp., с отмеченным сокращением их распространенности в положительных гемокультурах после удаления, когда все стрептококки в амоксиклав группе принадлежали к группе S. raitis.
С 1990 г., вследствие высокой распространенности нежелательных желудочно-кишечных последствий, вызванных эритромицином, экспертные комитеты, рекомендовали назначение клиндамицина в качестве альтернативы профилактики при риске ИЭ для пациентов, имеющих аллергию к бета-лактамам, перед некоторыми зубоврачебными процедурами. Аиткен и другие (Aitken et al., 1995) предложили, что клиндамицин был более эффективен, чем эритромицин в уменьшении распространенности бактериемии, вызванной удалением зубов стрептококковой этиологии; но другие авторы не обнаружили значительных различий между двумя режимами профилактики антибиотиками. Мы обнаружили только один отчет в литературе, опубликованный Геккером (Goker, 1992) в 1992, который сравнивал распространенность положительных гемокультур после извлечения зуба мудрости у пациентов, получающих профилактику клиндамицином и у пациентов в контрольной группе; частота бактериемии, вызванной удалением зубов в обеих группах была схожей.
В некоторых современных протоколах профилактики ИЭ назначение макролидных антибиотиков, таких как азитромицин и кларитромицин предлагалось в качестве второго возможного выбора для пациентов с риском ИЭ, аллергичных к пенициллинам (Браунвальд Е.,1995, Матвеев С.А., 1994).
Кларитромицин показал хорошую активность в искусственных условиях против обоих ротовых стрептококков (макролид - чувствительного или устойчивого) и анаэробных болезнетворных организмов (Белов Б.С., 2001). Недавно, мы обнаружили в исследованиях бактериемии, вызванной удалением зубов, что весь выделенный стрептококк показал низкий МІЖ на кларитромицин. Кроме того, свойства кларитромицина благоприятны-и с фармакокинетической точки зрения (высокое бионакопление, длинный период полувыведения и хорошее проникновение в ткани) и с фармакодинамической (кларитромицин является дезинфицирующим при концентрациях в два - четыре раза превышающих МПК). Наиболее общие неблагоприятные эффекты, связанные с применением препарата, касались желудочно-кишечного тракта и центральной нервной системы, носили обычно переходный характер и были умеренно тяжелыми. Отсутствие значительного взаимодействия препарата с другими лекарственными средствами в целевых группах делает возможным как его применение для диабетических пациентов и пожилых людей, так и у больных с почечной дисфункцией или с нарушениями работы печени (от слабых до умеренных). кларитромицин, по-видимому, переносится пациентами с реакциями повышенной чувствительности к бета-лактамам. Хотя все эти аргументы оправдали бы клинические испытания этих антибиотиков, по нашим данным, исследования, в которых бы изучалось бы влияние кларитромицина на профилактику бактериемии, как результата лечения зубов, до настоящего времени не были опубликованы. В настоящем исследовании, назначение единственной дозы 400 мг кларитромицина орально приводит к значительному сокращению распространенности и продолжительности бактериемии, вызванной удалением зубов.
Эффект от профилактики антибиотиками в кровотоке в первые минуты после начала бактериемии был подвергнут сомнению, так как время воздействия антибиотика на бактерии, вероятно, недостаточно для того, чтобы он подействовал. Ввиду этого, считается, что успех профилактики антибиотиками в предотвращении бактериемии, вызванной удалением зубов, мог быть вызван местным эффектом воздействия препарата на бактерии в полости рта, прежде, чем они проникли в кровоток. В нашем исследовании применение антибиотика было выполнено за 1 - 2 часа перед вводом анестезии, показывая, что для большинства пациентов прошло, по крайней мере, 2 часа прежде, чем были выполнены манипуляции в полости рта,,что, по оценкам, является минимальным временем, необходимым, чтобы амоксициллин мог вызвать значительное сокращение популяции Streptococcus sanguis и S. mitis. Учитывая уровень концентрации, достигнутый применением амоксициллин и кларитромицин, в слюне, жидкости десневой борозды, капиллярной крови и альвеолярной кости после применения лечебных доз , 90 % бактерий в настоящем исследовании были бы чувствительны к воздействию амоксициллина и кларитромицина.
Несмотря на местный эффект от профилактика антибиотиками, предполагалось, что полное устранение бактерий из десневой борозды посредством назначения антибиотика невозможно, вероятно вследствие полимикробной природы десневой флоры и способности микроорганизмов формировать биопленки. Как следствие, как и в настоящем исследовании, профилактика антибиотиками не предупреждала возникновения некоторых положительных гемокультур в первые 15 минут после зубоврачебных операций. Кларитромицин может иметь дополнительное действие на более поздних стадиях, основываясь на низких МІЖ для бактерий, выделенных из положительных гемокультур после удаления, его длинного периода полувыведения, и его способности уменьшать плотность биопленок, сформированных стрептококком группы viridans, выделенным у пациентов с ИЭ.
