Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Эпидемиология 10
1.2. Этиология и патогенез 11
1.3. Классификация лейкоплакии СОР 15
1.4. Клинико-морфологическая характеристика лейкоплакии 17
1.5. Лечение лейкоплакии СОР 22
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Клинические методы обследования больных с лейкоплакией 31
2.2. Лабораторные методы исследования 34
2.2.1. Оптическая когерентная томография 34
2.2.1.1. Методика ОКТ - исследования лейкоплакических участков 34
2.2.1.2. Идентификация оптических изображений 35
2.2.2. Исследования биопсийного материала 35
2.2.2.1. Методика приготовления гистологических препаратов 35
2.2.2.2. Методика приготовления иммуногистохимических препаратов 36
2.3. Статистическая обработка 37
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 38
3.1. Частота встречаемости больных с различными формами лейкоплакии в структуре заболеваний слизистой оболочки рта по данным ФГБУ ЦНИИС и ЧЛХ» за последние 5 лет 38
3.2. Клиническая характеристика больных с различными формами лейкоплакии 43
3.3. ОКТ-исследования различных форм лейкоплакии и неизмененной слизистой 60
3.4. Морфологическое исследование здоровой и патологической слизистой при лейкоплакии СОР 70
3.4.1. Гистологическая характеристика неизмененного эпителия слизистой оболочки рта 71
3.4.2. Гистологическая характеристика лейкоплакии слизистой оболочки рта 72
3.4.3. Гистологическая характеристика плоскоклеточного рака слизистой оболочки рта 75
3.4.4. Иммуногистохимическая характеристика лейкоплакии и плоскоклеточного рака слизистой оболочки рта 75
3.4.4.1. Экспрессия Кі-67 75
3.4.4.2. Экспрессия PI6INK4a 78
3.4.4.3. Экспрессия антигенов папилломавируса человека высоко риска HPV16 80
ГЛАВА 4. Алгоритм лечения пациентов с различными формами лейкоплакии слизистой оболочки РТА 91
4.1. Результаты лечения пациентов контрольной группы 91
4.2. Результаты лечения пациентов основной группы 95
Заключение 101
Выводы 114
Практические рекомендации 116
Список литературы
- Классификация лейкоплакии СОР
- Методика ОКТ - исследования лейкоплакических участков
- Клиническая характеристика больных с различными формами лейкоплакии
- Результаты лечения пациентов основной группы
Классификация лейкоплакии СОР
Существует множество работ, посвященных данному заболеванию [Arduino P.G. et al, 2013, Barnes L. et al., 2005, Carrard V.C. et al., 2013, Gillenwater A.M. et al., 2013, Parlatescu I. et al, 2014], однако остается открытым вопрос о причинах возникновения ненормальной кератинизации слизистой оболочки рта. Одним из основных экзогенных факторов многие авторы [Гилева О.С. и соавт., 2013, Lee С-Н. et al., 2003, Petti S. et al., 2006, Poate T.W. et al., 2006] считают табачный дым или жевание наса, горячую пищу и алкоголь. Однако, в некоторых источниках можно встретить описание лейкоплакии у пациентов, никогда не курящих или курящих редко [Martin G.C. et al., 1999, Zubairy Y.F. et al, 2012]. Горячая, острая, пряная пища также могут вызвать развитие заболевания. При строгих ограничениях в еде есть возможность предотвратить развитие лейкоплакических бляшек, а иногда и вызвать их полное исчезновение. По мнению некоторых зарубежных авторов [Adhikari A. et al., 2013, Lee С-Н. et al, 2003], жевание бетеля приводит к возникновению лейкоплакии во рту. Особенно это характерно для стран южной Азии и Индии. Бетель является субстанцией ореха пальмы, листьев перца (piper betle) и извести (СаО). Известно, что экстракт бетеля является митогеном для В- и Т-клеток. Хроническая иммуностимуляция лимфоидной ткани полости рта при его жевании способствует возникновению лейкоплакии, субмукозального фиброза и плоскоклеточной карциномы [Goud S.N. et al.,1993].
Причинами возникновения лейкоплакии полости рта может стать хроническая травматизация СОР острыми краями разрушенных зубов, неправильно изготовленными протезами, гальваническим током, возникающим при наличии протезов из разнородных металлов [Гожая Л. Д., 2001, Расулов М.М., 1978, Тимофеев А.А. и соавт., 2011].
Определенная роль в этиологии лейкоплакии нижней губы принадлежит гландулярному хейлиту в сочетании с неблагоприятными метеорологическими условиями, в результате которых красная кайма подвергается постоянному раздражению [Брусенина Н.Д. с соавт., 2007, Машкиллейсон А.Л., 1970, Пашков Б.М. с соавт., 1970, Huber М.А., 2014]. Кроме того, при локализации лейкоплакии на красной кайме губ большое значение имеет хроническая травма мундштуком, папиросой, трубкой или сигаретой.
Лейкоплакия может возникнуть как профессиональное заболевание у лиц, работающих на химическом производстве или в цехах с высокой температурой [Napier S.S. et al., 2008, Wierzbicka M., 1982]. По данным некоторых авторов частота поражения лейкоплакией обследуемого контингента составляет до 20% случаев [Rhodus N.L. et al, 2014].
Рассматривая лейкоплакию как реакцию нарушения ороговения слизистой оболочки рта на различные внешние раздражители, нельзя отрицать влияние эндогенных факторов, которые в свою очередь нарушают резистентность слизистой оболочки к внешним раздражителям.
Снижение резистентности, по-видимому, может быть связано с патологией желудочно-кишечного тракта - ЖКТ [Каспина А. И. и др., 2003, Colella G. Et al.,1999, Lundstrom I.M., 2009]. По данным других авторов [Лукина Г.П., 2011, K dra В. et al, 2012, Skrzypczak W., 2011] хронический гастрит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки отмечалась у 90,3% пациентов, наблюдающихся по поводу лейкоплакии, однако, клиническая картина лейкоплакии и патологии ЖКТ не выявила существенных параллелей между ними.
Недостаток или нарушение обмена витамина А и Е, роль которых в процессе ороговения общеизвестна [Машкиллейсон А.Л., Антонова Т.Н., 1976, Ehrl P.A., 1980, Lippman S.M. et al., 1993] может явиться одной из причин возникновения лейкоплакии.
Некоторыми авторами прослеживается связь развития лейкоплакии с хронической кандидозной инфекцией [Garber G.E., 1994, Wu L. et al, 2013]. В процессе своей жизнедеятельности Candida albicans образует N-nitroso-benzymethylamine (NBMA), который может способствовать малигнизации очагов лейкоплакии [Field Е.А. et al., 1989, Gainza-Cirauqui et al, 2013, Padayachee S. et al, 2012].
Макаров Я.Л. (2004), Стрюк Р.И. (2008) определенную роль в возникновении и озлокачествлении заболевания отводят эндокринным нарушениям. Так при обследовании пациентов с лейкоплакией в 15% случаев был выявлен сахарный диабет типов 1 и 2. А у женщин в некоторых случаях прослеживалась связь между изменениями уровня прогестерона и возникновением лейкоплакических бляшек во рту. Колебания уровня соотношения половых стероидных гормонов, связанные с возрастной инволюцией как у мужчин, так и у женщин, нарушают процессы метаболизма и синтеза белка, что в свою очередь снижает устойчивость тканей к воздействию неблагоприятных факторов и может повлечь за собой возникновение лейкоплакии. Однако обзор доступной литературы по данному вопросу не выявил однозначных связей.
Определенное место в патогенезе лейкоплакии занимают генетические факторы, что подтверждается развитием лейкоплакии у больных с врожденными и наследственными дискератозами. С риском развития лейкоплакии связывали экспрессию белка р53 и одновременное присутствие генотипов GSTMlo и GSTTlo [Humayun S. et al, 2011, Varan B.R. et al., 2013].
В настоящее время остается дискутабельным вопрос о наличии связи между возникновением лейкоплакии полости рта и выявлением вируса папилломы человека (ВПЧ) [Miller C.S. et al, 2001, Ostwald С. Et al, 2003, Varnai A.D. et al, 2009]. Вирусы ВПЧ, поражающие СОР, подразделяют на вирусы низкого риска в отношении озлокачествления (ВПЧ - 6, 11, 13, 32) и высоко риска (ВПЧ -16,18,31,33 и 35) [Cianfriglia F. et al, 2006, Hennessey P.T. et al, 2009].
Такое подразделение ВПЧ универсально для исследований онкогенной значимости во всех областях верхней части пищеварительного тракта [Campisi G. Et al, 2009, van der Waal I., 2009].
По данным зарубежных авторов [Palefsky J.M. et al, 1995, Ha P.K. et al, 2004] виды высокого риска, в особенности ВПЧ-16, обнаруживались при веррукозной лейкоплакии. Вероятность наличия ВПЧ в интактной слизистой и у больных с простой лейкоплакией и лейкоплакией веррукозной составили соответственно 10 %, 20,2 %, 26,2 % [Furrer V.E. et al., 2006]. Тем не менее, роль ВПЧ в патогенезе лейкоплакии и ее озлокачествлении до конца не изучена. Возможно, что ДНК ВПЧ при лейкоплакии имеет значимую онкогенную роль. С другой стороны, ВПЧ может присоединяться в виде суперинфекции к уже трансформированным кератиноцитам и, таким образом, влиять на развитие диспластических изменений при лейкоплакии.
Методика ОКТ - исследования лейкоплакических участков
С помощью ОКТ исследования были оценены микроструктурные изменения лейкоплакических очагов поражения СОР у 82 пациентов, для чего был использован ОКТ-томоскоп ОКТ 1300-Е. Прибор разработан в Институте Прикладной Физики РАН г. Нижний Новгород. Регистрационное удостоверение № ФСР2012/13479 от 30 мая 2012 года.
Нами было получено 176 изображений. Каждая интересующая нас область сканировалась несколько раз до получения повторного ОКТ изображения, затем в этой области выполняли биопсию для проведения морфологического анализа биоптата. Численный анализ ОКТ изображений проводили полуавтоматическим способом с помощью программы Image J.
Процедура ОКТ исследования in vivo не требует обезболивания. Оптический зонд под контролем зрения подводят к интересующему участку слизистой и придерживают в течение 4-6 секунд (Островский А.Д., 2008). Сначала сканируют контрольную (эталонную) томограмму симметричного здорового участка слизистой. Далее последовательно выполняют сканирование всех интересующих участков патологического очага. Вся процедура обследования занимает 20 минут.
Каждую полученную томограмму кодировали, записывали электронные комментарии о пациенте (ФИО, пол, год рождения), форму и локализацию лейкоплакического очага.
Для описания томографических изображений СОР использовали определенные понятия: яркость, слоистость, структурность, контраст, характеристика границ, оптическая неоднородность, характер поверхности, глубина изображения. Полученные томограммы представлены в позитивной псевдоцветной коричневой палитре, усреднены по трем квадратам. Горизонтальная шкала на томограмме дается в масштабе 1 мм.
Из мест сканирования выполняют прицельную биопсию для проведения морфологического анализа.
Идентификация изображений проводилась путем сопоставления клинической картины, оптического изображения и морфологических данных одного и того же пациента. С помощью параллельности томографического и морфологического анализа определяли оптические характеристики, присущие как здоровой слизистой оболочке, так и лейкоплакическим очагам СОР. Оценивали размер, форму, глубину залегания визуализированных внутриклеточных структур и соответствующих им оптическим изображениям, проводили измерение толщины эпителия на уровне угасания сигнала лазерного излучения.
В ходе исследования были сформулированы качественные оптические критерии, соответствующие морфологическим изменениям при различных формах лейкоплакии.
Биопсийный материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, промывали в проточной воде, тщательно обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Готовили серии срезов толщиной 4-5 мкм, фиксировали на предметные стекла, проводили депарафинизацию и окрашивали гематоксилин-эозином. На последнем этапе стекла заключали в канадский бальзам под покровное стекло и исследовали под микроскопом. 2.2.2.2. Методика приготовления иммуногистохимических препаратов
Иммуногистохимическое исследование биопсийного материала проводилось в соответствии со стандартным протоколом. Ткани фиксировали в 10% забуференном формалине (рН 7,4), после проводки на гистопроцессоре заливали в парафин, с температурой плавления +54С.
Для иммуногистохимического исследования (ИГХ) серийные срезы толщиной 5 мкм монтировали на стекла, покрытые поли-Ь-лизином. Блокирование эндогенной пероксидазной активности выполнено с помощью 3% перекиси водорода в течение 10 минут. В качестве первичной - на срезы наносили 50 мкл разведенной сыворотки.
Выявление тканевых антигенов осуществляли с помощью поликлональных кроличьих антител к вирусу папилломы человека 16 типа (АВВЮТЕС) в разведении 1:400 и моноклональных антител pi6INK4a (clon EPR1473, EPITOMICS) 1:200 и Ki-67 (ММ1, Diagnostic Biosystems) 1:100. Срезы инкубировались в течение 30 минут.
Выявление иммунных комплексов проводили при помощи безбиотиновой системы детекции на основе пероксидазы хрена (N-Histofme, Япония), срезы докрашивали гематоксилином Майера. Затем стекла со срезами снова промывали, погружая в проточную воду. Стекла извлекали, обезвоживали в спиртах, заключали в канадский бальзам и исследовали под микроскопом.
Для определения средних статистических величин в нашей работе реакции к вирусу папилломы человека 16 типа и pi6INK4a оценивались качественно по клеточным зонам: в базальном, парабазальном и шиповатом клеточных слоях, в плоскоклеточном раке оценивали периферическую и центральную зону распределения опухолевых клеток.
Индекс пролиферации Кі-67 (ИП Ki-67) оценивали также по клеточным зонам, определяли отношением количества иммунореактивных ядер клеток к общему числу ядер в %. Оценку показателей осуществляли в соответствующих участках тканей. Подсчет клеток производили при увеличении х400.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы STATISTICA 10.0. стандартными методами с определением средней арифметической (М) и среднего квадратического отклонения (а). Учитывая ненормальное распределение отдельных статистических показателей, сравнение двух независимых групп осуществляли непараметрическим методом при помощи U-критерия Манна-Уитни. Достоверным считали различия средних при уровне статистической значимости р 0,05. Анализ таблиц сопряженности выполнен с помощью классического критерия %2 по Пирсону. С помощью коэффициента R Спирмена изучались корреляционные взаимоотношения между пролиферативной активностью клеток (по экспрессии белка Ki-67) при лейкоплакии с явлениями гиперплазии, дисплазии, плоскоклеточном раке и выраженностью экспрессии антигенов вируса папилломы человека (16 типа)
Клиническая характеристика больных с различными формами лейкоплакии
Лейкоплакия - это наиболее часто встречающееся потенциально злокачественное поражение слизистой оболочки рта (СОР) [Feller L. et al., 2011, Sciubba J.J., 2011]. Лейкоплакия относится к разновидности гиперкератозов, характеризующихся хроническим течением и поражающих СОР и красную кайму губ [Рабинович ОФ. и др., 2012]. Микроскопическое исследование при клиническом диагнозе «лейкоплакия» в 80-85% поражений обнаруживает гиперкератоз с гиперплазией базального и парабазального клеточных слоев, в 5-15% - гиперкератоз с различной степенью дисплазии, а в 2-5% - плоскоклеточный рак [Brandwein-Gensler M.S., 2009].
Причины, приводящие к развитию лейкоплакии многофакторны. К ним относятся травмы механического, химического, термического генеза, генетическая предрасположенность. Около 70-90% лейкоплакий слизистой рта связаны с курением, имеется прямая зависимость между частотой и длительностью курения и развитием лейкоплакии слизистой оболочки рта [Neville В. et al., 2009; Dietrich Т. et al, 2004], в то же время, факторы вызывающие идиопатическую лейкоплакию неизвестны.
В настоящее время выявлена связь развития лейкоплакии с наличием вируса папилломы человека (HPV) [Асау R. et al., 2008]. Папилломавирус человека - это небольшой ДНК-содержащий вирус, который проявляет тропизм к многослойному плоскому эпителию. В настоящее время идентифицировано около 120 типов HPV. HPV высокого онкогенетического риска являются причиной около 40% раков слизистой оболочки рта [Parkin D.M., Bray F., 2006]. Репликация вируса F1PV осуществляется только в пролиферирующих эпителиальных клетках слизистой оболочки рта. В связи с этим, выявление подобных клеток с помощью иммуногистохимического маркера пролиферации Ki-67 может служить дополнительным критерием предраковых состояний, поскольку известно, что при увеличении степени дисплазии количество пролиферирующих клеток, экспрессирующих белок Ki-67, в эпителии СОР возрастает [Ковязин В.А. и др., 2010; Бабиченко И.И. и др., 2011].
HPV активизирует пролиферативную активность эпителиальных клеток за счет блокирования белка Р16ЮК4а. Ген р16ЮК4а располагается на участке 9р21 хромосомы, содержит три экзона и кодирует ядерный фосфопротеин молекулярным весом 16 kDa. Функция белка данного гена заключается в торможении клеточного цикла за счет связывания циклин-зависимых киназ 4 и 6 и взаимодействия с циклином Dl [Murphy N. Е. et al., 2004, Ramasubramanian A. et al, 2013].
В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования было выявление белков Ki-67, pi6INK4a и антигенов папилломавируса человека высоко риска (HPV 16) при гиперплазии, дисплазии и плоскоклеточном раке слизистой оболочки рта.
При проведении гистологического исследования в качестве контрольной группы был взят неизмененный эпителий по краям биопсийного материала при лейкоплакии у 10 пациентов. Неизмененный некератинизированный многослойный плоский эпителий СОР включает от базальной мембраны до поверхности - базальный слой, представленный одним рядом клеток имеющих цилиндрическую либо кубическую форму, парабазальный клеточный слой, состоящий из 1-2 рядов клеток, расположенных над базальными и не имеющие связи с базальной мембраной, шиповатый слой, содержит 5-6 рядов крупных неправильной формы клеток с отростками, напоминающими шипы роз; затем отмечается уплощение клеток и их превращение в плоские. На твердом небе, спинке языка и деснах к поверхностному ороговевающему слою прилежит зернистый, состоящий из удлиненной формы клеток с кератиносомами и кератогиалиновыми гранулами и роговой слой с рядами ороговевших клеток, в которых ядра и цитоплазматические органеллы не выявляются (рисунок 34). Цитологически от базального к поверхностному кератиновому слою эпителия отмечается прогрессивное уменьшение ядерно-цитоплазматического соотношения и накопление внутриклеточного кератина.
Лейкоплакия - это клинический термин, и в настоящее время он не используется для описания гистопатологии. Ранее его применяли для обозначения определенного злокачественного потенциала новообразований, не описывая гистологическую картину клинического диагноза. Клинически лейкоплакия является проявлением гиперпластических процессов в многослойном плоском эпителии под воздействием различных повреждающих агентов и выражающаяся в формировании поверхностного гиперкератоза. Эти изменения отмечаются в базальном, парабазальном или более поверхностных слоях эпителия. Клинически лейкоплакия может иметь сходные проявления, но гистологических характеризоваться различными нозологическими процессами от проявления доброкачественного гиперкератоза до инвазивной плоскоклеточной карциномы и только биопсия может установить окончательный диагноз. По классификации ВОЗ 2005 г. при лейкоплакии возможно выявить четыре вида изменений: лейкоплакию без атипии (плоскоклеточная гиперплазия), плоскоклеточную интраэпителиальную неоплазию 1-й степени (SIN1), плоскоклеточную интраэпителиальную неоплазию 2-й степени (SIN2) и плоскоклеточную интраэпителиальную неоплазию 3-й степени (SIN3). Распределение наших пациентов было следующим: слизистая оболочка без изменений- 10 (12%) случаев, лейкоплакия без атипии- 35 (43%), лейкоплакия с явлениями SIN 16 (20%) и плоскоклеточный рак 21 (25%) случай соответственно (рисунок
При гиперплазии отмечается увеличение толщины эпителия в связи с увеличением одного из компонентов базального, шиповатого (акантоз) или поверхностного (гипер-, паракератоз) обычно в комбинации с последним без нарушения в развитии и без какой-либо клеточной атипии (рисунок 36). Небольшое увеличение плотности клеток и клеточнаяатипия могут наблюдаться на фоне воспаления.
Простая или плоская гиперплазия, при которой базальная мембрана остается хорошо определяемой в виде линии, отделяющей утолщенный эпителий от подлежащей стромы. Простая гиперплазия может сопровождаться воспалительными изменениями и проявлять реактивные (атипичные) цитологические изменения.
Термины плоскоклеточная интраэпителиальная неоплазия характеризуют повреждения слизистой с вовлечением плоского эпителия различной толщины с нарушением развития, ориентации, полярности клеточных слоев и цитологическими изменениями с ядерной атипией, полиморфизмом и повышенной митотической активностью. При гистологических исследованиях эти изменения имеют определенный биологический потенциал для перехода в ороговевающий рак.
При плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии 1-й степени в эпителии имеются клетки с немного измененными цитологическими характеристиками, но они ограничены нижней третью эпителия, при этом сохраняется нормальное созревание эпителиальных клеток в верхних 2/3 эпителия. Митозы могут выявляться, но ограничены базальным слоем и имеют нормальную конфигурацию, может наблюдаться кератоз (рисунок 37).
При плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии 2-й степени измененные клетки с атипическими цитологическими характеристиками отмечаются в нижней и средней трети эпителия. Клеточная атипия более выявлена по сравнению с SIN 1: в ядрах определяются выраженные ядрышки. Дифференцировка сохраняется в верхней трети слизистой оболочки, митозы нормального вида могут отмечаться в парабазальном и промежуточном слоях.
При плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии 3-й степени (SIN 3) атипические клетки проявляют выраженную ядерную изменчивость и сильную митотическую активность, занимая более 2/3 эпителиального слоя. Они не образуют скоплений и в них нет цитологической атипии, характерной для карциномы in situ. Дифференцировка клеток сохранена в поверхностных слоях как доказательство фокального поверхностного плоскоклеточного дифференцирования и фокального сохранения межклеточных контактов. Митозы, включая атипические, могут располагаться в верхней трети эпителия. Может присутствовать ассоциативный кератоз. По мере нарастания неопластических изменений в эпителии, в подлежащей дерме усиливаются воспалительные явления, сопровождающиеся инфильтрацией лимфоцитами.
Результаты лечения пациентов основной группы
В ходе нашего исследования выявлены 10 участков неизмененной слизистой, 35 - лейкоплакии без атипии, 16 биоптатов лейкоплакии с дисплазией различной степени от SIN 1 до SIN 3 и 21 пациент с диагнозом «плоскоклеточный рак».
При гистологическом исследовании биопсийного материала у пациентов с гиперплазией отмечается увеличение базального, шиповатого (акантоз) или поверхностного (гипер-, паракератоз) слоев эпителия без какой-либо клеточной атипии. Небольшое увеличение плотности клеток и клеточная атипия могут наблюдаться на фоне воспаления.
При плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии 1-й степени (SIN 1) в эпителии имеются клетки с немного измененными цитологическими характеристиками, но они ограничены нижней третью эпителия, при этом сохраняется нормальное созревание эпителиальных клеток в верхних 2/3 эпителия.
При неоплазии 2-й степени (SIN 2) измененные клетки с атипическими цитологическими характеристиками отмечаются в нижней и средней трети эпителия. В ядрах выявляются выраженные ядрышки. Дифференцировка клеток сохраняется в верхней трети слизистой оболочки.
При неоплазии 3-й степени (SIN 3) атипические клетки проявляют выраженную ядерную изменчивость и сильную митотическую активность, занимая более 2/3 эпителиального слоя. Дифференцировка клеток сохранена в поверхностных слоях как доказательство поверхностного дифференцирования и сохранения межклеточных контактов.
При гистологическом исследовании плоскоклеточного рака определялись комплексы атипичных клеток плоского эпителия с инвазивным ростом в подслизистый слой. Измененные клетки имеют цитологические признаки злокачественности, включая высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, выраженные одно или несколько ядрышек, ядерную гиперхромазию и плеоморфизм. Митотические фигуры, включая патологические митозы, встречаются часто. По мере нарастания неопластических изменений в эпителии, в подлежащей дерме усиливаются воспалительные явления, сопровождающиеся инфильтрацией лимфоцитами. С целью выявления самых ранних признаков диспластических изменений в клетках эпителия в нашей работе мы применяли иммуногистохимический метод исследования биоптатов, взятых с элементов поражения.
Благодаря этому методу мы смогли проследить связь развития лейкоплакии от гиперплазии с гиперкератозом до плоскоклеточного рака в эпителиальных клетках многослойного плоского эпителия, выявляя экспрессию белка Ki-67, антигены вируса папилломы человека высокого риска HPVI6 и белки, ассоциированные с HPV (P16INK4a). Белок рібЮК4а тормозит формирование опухолей за счет блокирования циклинзависимых киназ. Подавление экспрессии данного гена за счет гиперметилирования или мутации часто наблюдается в большинстве раковых клеточных линий и первичных опухолей человека.
Таким образом, повышенная экспрессия гена pl6INK4a является непрямым маркером HPV, отражающим нарушение механизмов, контролирующих клеточную пролиферацию и характеризующим персистирование инфекции с высоким риском развития неоплазии.
При ИГХ исследовании неизмененного эпителия пролиферирующие клетки выявлялись только в базальном слое, при этом в 6 случаях в ядрах клеток всех слоев выявляется белок Р16ЮК4а, а в 2 случаях - HPV16.
Ki-67 является маркером пролиферации клеток, его определение может служить дополнительным критерием предраковых состояний, поскольку известно, что при увеличении степени дисплазии количество пролиферирующих клеток, экспрессирующих белок Ki-67, возрастает.
При лейкоплакии с гиперплазией СОР и явлениями гиперкератоза экспрессия Ki-67 выявлялась в ядрах эпителиальных клеток базального и парабазального слоев. При данном виде патологии экспрессия белка рібЮК4а отмечалась в ядрах многослойного плоского эпителия всех исследованных зон в 77% случаев, положительная реакция на вирусные антигены HPV16 в 34%.
При лейкоплакии СОР с явлениями SIN количество пролиферирующих клеток увеличилось в парабазальной области и зоне шиповатых клеток. В этих же зонах в 75% случаев выявлялась экспрессия белка pi6INK4a и в 50% -антигены HPV16 в виде небольших включений в клеточные ядра и цитоплазму.
При диагностировании плоскоклеточного рака клинически по результатам ИГХ исследования в периферических и центральных клеточных зонах количество пролиферирующих клеток значительно увеличилось по сравнению с гиперплазией и SIN, в этих же областях в 86% случаев отмечена высокая ядерная экспрессия белка P16INK4a, и в 62% случаев включений антигенов HPVI6 в клеточные ядра и цитоплазму.
Проведенные исследования показали, что при различных морфологических вариантах лейкоплакии от гиперплазии с гиперкератозом до плоскоклеточного рака в эпителиальных клетках многослойного плоского эпителия выявляются антигены вируса папилломы человека высокого риска HPV16 и белки ассоциированные с HPV - Р16ЮК4а.
Таким образом, повышенная экспрессия гена pl6INK4a является непрямым маркером HPV, отражающая нарушение механизмов, контролирующих клеточную пролиферацию и характеризующая персистирование инфекции высоким риском развития неоплазии.
Анализ полученных данных о выявлении папилломавирусной инфекции при лейкоплакии позволил нам решить не только вопросы ее генеза, но и явился патогенетической основой для эффективной профилактики и дифференцированного подхода в лечении различных форм лейкоплакии.
Алгоритм лечения лейкоплакии сводился к следующему. По результатам собственных исследований у больных основной и контрольной группы учитывались особенности клинической картины, данные ОКТ и патоморфологического исследования.
При всех формах лейкоплакии проводили санацию полости рта, включающую профессиональную гигиену (снимали мягкий, цветной зубной налет, над- и поддесневые зубные отложения) с местной противовоспалительной терапией; замену амальгамовых пломб, некачественных пломб; сошлифовывание острых краев зубов; удаление зубов, не подлежащих лечению. При необходимости рекомендовали рациональное протезирование с использованием однородных металлов или безметалловых конструкциий.
Пациентам было настоятельно рекомендовано придерживаться диеты: исключенить из рациона питания горячую, острую, кислую, пряную пищу.
Пациентам в контрольной группе (п=22) с плоской формой лейкоплакии назначали витамин Е - как препарат, нормализующий процесс ороговения и улучшающий метаболизм в поражённых тканях; витамин А по 3300МЕ в сутки, в течение 21 дня; комплекс витаминов группы В -чередовать через день инъекции в/м по 1,0мл витамина В2 №10 и В12 №10; из общеукрепляющей терапии - витамин С по 1,0 г в сутки, в течение 1 месяца, а также комплекс витаминов группы В. Местно: туалет языка содовым раствором, антисептические полоскания, аппликации масляными растворами и противогрибковым препаратами местного действия - кремом Клотримазол, Кандид 1% или 10% раствором буры в глицерине.
