Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Ангиопатия и патологические изменения в пародонте при сахарном диабете I типа 11
1.2. Возможности диагностики расстройств микроциркуляции в пародонте методом лазерной допплеровской флоуметрии 17
1.3. Терапия пародонтапри сахарном диабете 20
1.4. Хитозан - происхождение, свойства, возможности применения в медицине и стоматологии 23
Глава 2. Материалы и методы исследования 30
2.1. Получение и доклинические испытания изделия медицинского назначения на основе хитозан-альгинат-гидроксиапатитного комплекса 30
2.2. Экспериментальный и лабораторный методы анализа 32
2.3. Методы определения состояния пародонта 37
2.4. Функциональный метод оценки состояния микро-циркуляторного русла 38
2.5. Морфологический метод анализа состояния тканей пародонта 40
2.6. Методы статистической обработки результатов исследования 40
Глава 3. Результаты исследования 43
3.1. Получение полимерного комплекса на основе хитозан-альгинат-гидроксиапатита, результаты санитарно-химического и токсикологического исследования изделия медицинского назначения «ХАГ-БОЛ» 43
3.2. Результаты формирования экспериментальной модели инсулинозависимого сахарного диабета 45
3.3. Результаты оценки состояния тканей пародонта экспериментальных животных 47
3.4. Результаты лазерной допплеровской флоуметрии микроциркуляторного русла пародонта 56
3.5. Результаты морфологического исследования 60
Глава 4. Обсуждение полученных результатов и заключение 73
Выводы 82
Практические рекомендации 83
Список литературы 84
- Ангиопатия и патологические изменения в пародонте при сахарном диабете I типа
- Возможности диагностики расстройств микроциркуляции в пародонте методом лазерной допплеровской флоуметрии
- Получение и доклинические испытания изделия медицинского назначения на основе хитозан-альгинат-гидроксиапатитного комплекса
- Получение полимерного комплекса на основе хитозан-альгинат-гидроксиапатита, результаты санитарно-химического и токсикологического исследования изделия медицинского назначения «ХАГ-БОЛ»
Введение к работе
Актуальность исследования
В соответствии с приказом Минздравсоцразвития России от 07.04.05 № 262 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным сахарным диабетом»: рост числа людей страдающих сахарным диабетом (СД) требует пересмотра, оптимизации и повышения качества медицинской помощи таким больным, равно как и повышения качества их жизни [80]. Однако существующие стандарты оказания стоматологической помощи больным СД не учитывают особенностей возникновения и течения хронического генерализованного пародонтита (ХГП) связанных с общесоматическими изменениями в организме больных СД I типа.
При СД I типа возникает нарушение общего и местного иммунитета полости рта, понижается сопротивляемость к инфекции и грибковым поражениям, прогрессирует ангиопатия сосудов микроциркуляторного русла пародонта, что и провоцирует развитие пародонтита у таких больных независимо от исходного уровня гигиены полости рта [50,94].
По данным Э.С. Оганян, традиционное местное лечение пародонтита протекающего на фоне СД I типа эффективно в 42,9% случаев при компенсированном течении основного заболевания, малоэффективно при субкомпенсированном и неэффективно при декомпенсации уровня глюкозы крови [67].
Общепринятые методики профилактики и лечения пародонтита оказываются малоэффективны у больных СД I типа, так как не влияют на основное звено патогенеза — патологически измененные сосуды. Стоматологическая реабилитация больных СД I типа сложна и требует применения инновационных материалов и технологий для лечения заболеваний органов и тканей полости рта [35,37,83].
Необходима разработка новых изделий медицинского назначения обладающих комплексным действием на мягкие и твердые ткани пародонта, снижающих неблагоприятное влияние ангиопатии сосудов микроциркуляторного русла, устраняющих воспалительные явления, стимулирующих коллагено- и остеогенез, что позволит приостановить развитие патологического процесса на ранних этапах заболевания. Новые изделия должны иметь удобную для применения форму, не требующую дополнительного удерживающего покрытия и частого нанесения. Так же требуется разработка новых методик профилактики и лечения заболеваний пародонта у больных СД I типа, с применением инновационных препаратов.
Цель работы
Повышение эффективности лечения и профилактики заболеваний пародонта при сахарном диабете I типа в стадии компенсации, путем разработки и применения в эксперименте биополимерной композиции, на основе хитозан-альгинат-гидроксиапатитного (ХАГ) комплекса.
Задачи:
Разработать биополимерную композицию на основе хитозана, альгината и гидроксиапатита для применения в пародонтологии.
Провести санитарно-химические и токсикологические испытания изделия медицинского назначения «ХАГ-БОЛ».
Исследовать воздействие хитозан-альгинат-гидроксиапатитного и хитозан-альгинатного комплексов на состояние тканей пародонта экспериментальных животных с моделью аллоксанового сахарного диабета при компенсированном течении, путем анализа динамики показателей пародонтальных индексов.
4. Произвести сравнительную оценку влияния хитозансодержащих композиций на состояние микроциркуляторного русла пародонта при помощи лазерной допплеровской флоуметрии в эксперименте.
5. Изучить эффективность применения хитозан-альгинат- гидроксиапатитного и хитозан-альгинатного комплексов, путем сравнительного анализа результатов морфологического исследования тканей пародонта экспериментальных животных.
6. Разработать практические рекомендации по применению изделия медицинского назначения «ХАГ-БОЛ», для лечения и профилактики пародонтита на фоне инсулинозависимого сахарного диабета.
Научная новизна
Впервые получен хитозан-альгинат-гидроксиапатитный комплекс содержащий сульфатированные и несульфатированные гликозаминогликаны, проведена экспериментальная оценка эффективности применения данного изделия при пародонтите на фоне компенсированного течения сахарного диабета I типа. Доказана высокая эффективность изделия медицинского назначения «ХАГ-БОЛ»: способность нивелировать неблагоприятное влияние микроангиопатии на ткани пародонта, обеспечить адекватную микроциркуляцию за счет активного новообразования сосудов капиллярного типа, приостановить воспалительные и деструктивные процессы в тканях пародонта.
Практическая значимость
Получено новое изделие медицинского назначения, экспериментально обосновано его применение для профилактики и лечения пародонтита на фоне компенсированного сахарного диабета I типа. Подготовлена база для клинической апробации патогенетически обоснованной методики лечения пародонтита на фоне сахарного диабета I типа учитывающей особенности развития пародонтопатии на фоне имеющихся общесоматических изменений характерных для данной патологии.
Реализация результатов исследования
Результаты диссертационной работы легли в основу клинических исследований по эффективности применения хитозан-альгинат-гидроксиапатитного комплекса при пародонтите на фоне сахарного диабета I типа. На результатах данного диссертационного исследования базировалась разработка изделия медицинского назначения «ХАГ-БОЛ» и создание способа лечения пародонтита у больных сахарным диабетом I типа препаратом «ХАГ-БОЛ» (Патент РФ № 2309748 от ЮЛ 1.2007).
Проведенные исследования положены в основу медицинских испытаний изделия «ХАГ-БОЛ» в формате GCP для России с целью включения разработанного и исследуемого биополимера в реестр изделий медицинского назначения Росздравнадзора.
Личное участие автора:
Автор принимала участие в создании нового изделия медицинского назначения «ХАГ-БОЛ», организации проведения токсикологических испытаний этого изделия.
Автором проведено экспериментальное исследование эффективности изделия медицинского назначения: лично воспроизводила модель аллоксанового сахарного диабета, оценивала состояние пародонта экспериментальных животных с применением Йодного числа Свракова и индекса кровоточивости PBI, производила функциональное исследование состояния микроциркуляции в пародонте экспериментальных животных методом лазерной допплеровской флоуметрии. При непосредственном участии автора организованны и проведены лабораторные и патоморфологические исследования.
Автором подробно проанализированы результаты проведенного экспериментального исследования, проведена статистическая обработка и обобщение полученных результатов.
Автором разработаны рекомендации по применению изделия «ХАГ-БОЛ» в клинических исследованиях. При участии автора разработана и запатентована методика лечения пародонтита на фоне сахарного диабета I типа.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийских научно-практических конференциях «Сибирский стоматологический форум» (Красноярск, 2008, 2009), заседании проблемной комиссии по стоматологии «Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» МЗ и СР РФ (2009).
Положения выносимые на защиту
1. Применение соединений хитозана: хитозан-альгинатного и хитозан-альгинат-гидроксиапатитного комплексов для местного лечения пародонтита на фоне компенсированного течения сахарного диабета I типа способствует нормализации микроциркуляции, снижению воспаления и профилактике деструктивных процессов в тканях пародонта.
2. Применение хитозан-альгинат-гидроксиапатитного комплекса «ХАГ-БОЛ» для местного лечения экспериментального пародонтита на фоне компенсированного течения сахарного диабета I типа является наиболее эффективным среди предложенных полимерных изделий на основе хитозана.
Публикации ,
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 в реферируемых изданиях рекомендованных ВАК, получен патент РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы включающего 173 источника, в том числе 105 на русском языке и 68 на иностранных языках. Текст иллюстрирован 37 рисунками и 7 таблицами.
Ангиопатия и патологические изменения в пародонте при сахарном диабете I типа
Сахарный диабет (СД) является серьезной медико-социальной проблемой мирового масштаба. По информации ВОЗ 2008 года, число людей больных сахарным диабетом превышает 180 млн. и эта цифра продолжает неуклонно расти [33]. В соответствии с данными S.Wild et al. (2004) распространенность диабета к 2030 году возрастет до 4,4 % населения Земли составив 366 млн. человек [130].
Общее количество больных сахарным диабетом в России в 2002 году официально составляло 2,5% населения [92]. При изучении заболеваемости сахарным диабетом среди жителей Сибири на примере г. Новосибирска (2006), сахарный диабет был выявлен у 3,5% обследованных [64].
При изучении эпидемиологии сахарного диабета в Амурской области (2007) выявлен значительный темп прироста показателей заболеваемости сахарным диабетом среди населения - 7,3% в год [34].
По данным И.Г. Лысенко (2008) в г. Красноярске распространенность сахарного диабета с 2001 по 2005 годы выросла на 16% - среди детей до 15 лет и на 28,3% - среди 15-18 летних составив в первой возрастной группе 89,2 на 100 тыс. детей, а во второй 168,4 на 100 тыс. детей [56].
Анализируя структуру осложнений при различных типах сахарного диабета Е.А. Дроздова (2007) отмечает доминирование при СД 1 типа микрососудистых осложнений, при СД 2 типа кардиоваскулярных нарушений [35] . В патогенезе ангиопатий при СД участвуют внутренний (генетическая предрасположенность) и внешний факторы (гипергликемия и каскад метаболических, гормональных, реологических и др. нарушений). Первичным в развитии микроангиопатии (МИАП) при сахарном диабете считается поражение эндотелия артериол, затем патологические изменения распространяются на базальную и эластическую мембраны, гладкомышечные клетки (ГМК), перициты и клетки адвентиции. МИАП затрагивает все звенья мик-роциркуляторного русла: артериолы, венулы, капилляры, сосудистые анастомозы [7, 48, 105].
В условиях гипергликемии усиливается синтез адгезивных молекул (Р-селектинов) клетками эндотелия сосудов, способствующих прилипанию полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЯЛ), что в свою очередь приводит к активации и усилению синтеза адгезивных молекул на поверхности эндоте-лиальных клеток (ЭК) и ПМЯЛ, а так же усилению выработки PAF (platelet-activating factor) - фактора активирующего тромбоциты. Комплексирование PAF с рецепторами лейкоцита инициирует образование Ь2-интегринов (собственных адгезивных белков). Аналогичным образом происходит вовлечение в патологический процесс моноцитов и макрофагов, начинающих секретиро-вать цитокины и хемокины, активированные макрофаги так же секретируют факторы роста ГМК [7, 26, 48, 105] .
Нарушение функции сосудистого эндотелия сопровождается усилением выделения, а затем истощением вазодилататоров: эндотелинов, фактора Виллибранда, тканевого активатора плазминогена и оксида азота (NO).
При манифестации сахарного диабета 1 типа, в ответ на гипергликемию, обнаруживается ускорение кровотока связанное с повышением высвобождения N0. Длительная гипергликемия, приводит к истощению содержания в ЭК глютатиона и NADPH, ингибированию эндотелиальной NO-синтазы, увеличивается количество гликогемоглобина и других продуктов конечного гликозилирования которые снижают активность оксида азота.
Кроме того для адекватной вазодилатации требуется интактный эндотелий, а утолщение коллагена при диабете препятствует диффузии N0 к гладкой мускулатуре микрососудов [49,112, 133].
Гликозилированный гемоглобин изменяет поверхностный потенциал эритроцитов, что приводит к стазу, агглютинации и сладжу эритроцитов. Микротромбоз создает местную гипоксию и активацию перикисного окисления липидов [7, 48, 105].
Окислительный стресс при сахарном диабете может быть следствием повышенного образования реактивных оксидантов, снижения активности ан-тиоксидантной системы, нарушения работы ферментных систем. Органические пероксиды приводят к образованию реактивных альдегидов, дикарбони-ловых соединений, индуцирующих в тканях цитотоксичность, апоптоз, цепную реакцию окисления субстратов и окислительное повреждение — формируется порочный круг (первичный окислительный стресс индуцирует образование вторичных источников окислительного стресса) [7, 48, 105].
Начинаются морфологические изменения, хемотаксис, перемещение гладкомышечных клеток и образование гранул протеолитических ферментов и свободных радикалов повреждающих сосудистую стенку. Повышается по-розность цитолеммы, разрушение митохондрий, лизосом, вакуолизация эн-доплазматической сети, нарушение конформации микрофиламент приводит к аутолизу ЭК [7, 48, 105].
Накопление в ЭК сорбитола, одного из возможных продуктов метаболизма глюкозы, приводит к осмотическому отеку, вплоть до гиперосмо-лярных «взрывов» клеток [48].
При сахарном диабете все восстановительные процессы резко нарушены, а причины этого точно не известны: предположительно нарушается миграция сохранных ЭК к месту разрушения эндотелия, оказывается невозможным завершение дифференцировки ЭК, слабость прикрепления таких клеток к базальной мембране (БМ) и быстрая гибель с оголением БМ. Так же в снижении регенеративных возможностей ЭК играют роль патологические изменения в БМ [7, 48, 105].
При МИАП в БМ, перицитах и ГМК возникают повреждения метаболической, гипоксической и иммунной природы. Поражение БМ микрососудов характеризуется изменением заряда мембран, повышением их проницаемости, снижением адгезии ЭК, инфильтрацией белками плазмы. БМ повреждается протеолитическими ферментами макрофагов и ПМЯЛ. В перицитах и ГМК усиливается синтез цитокинов и снижается выработка факторов роста необходимых для регенерации сосудистой стенки. ГМК и перициты приобретают способность синтезировать аномальные белки базальной и эластической мембран и разрушать волокнистые структуры стенок сосудов [7, 48, 105].
Морфологически МИАП проявляется плазматическим пропитыванием стенок сосудов, явлениями склероза и гиалиноза, гемо- и лимфостазом [105].
Распространенность ангиопатий, равно как и других видов диабетических осложнений напрямую зависит от длительности заболевания и степени компенсации сахарного диабета [25, 67, 112]. Однако при стаже заболевания свыше 10 лет сосудистые осложнения выявляются у 100% больных, а компенсация углеводного обмена по данным Э.П. Касаткиной и И.Г. Сичинава (1999) остается неудовлетворительной у 68,1% детей и 78,9% подростков [44].
Согласно исследованиям Т.В. Кочемасовой с соавт. (2002) уже при впервые выявленном сахарном диабете 1 типа увеличивается уровень Е се-лектина, - свидетельства активации ЭК, кроме того не выявлено корелляции уровня Е селектина с показателями метаболического контроля, что подтверждает возможность развития ангиопатий и в условиях компенсированного течения основного заболевания [38].
Возможности диагностики расстройств микроциркуляции в пародонте методом лазерной допплеровской флоуметрии
Метод лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) позволяющий оценить состояние кровотока на капиллярном уровне, получил широкое развитие благодаря циклу работ, выполненных в период 1977 — 1985 годы несколькими исследовательскими коллективами. Первый коммерческий прибор, реализующий принципы метода ЛДФ, был создан шведской группой исследователей: Т. Tenland and al. [171] .
Свое начало лазерная допплеровская флоуметрия (ЛДФ) берет от измерения скорости потока жидкости с помощью гелий-неонового лазерного спектрометра, которое провели Yeh и Cummins в 1964 г., но научное обоснование частотной составляющей сигнала дали F.Durst, J.H.Whitelaw в 1971 г. [146].
При проведении ЛДФ монохроматический пучок света малой интенсивности, излучаемый лазерным диодом, встроенным в допплеровский лазерный флоуметр, проходит по гибкому световоду и через наконечник датчика освещает исследуемую ткань, где рассеивается отражающими частичками. Часть света отражается обратно и по приемному световоду попадает на внутренний фотоприемник аппарата. В соответствии с эффектом Доплера, только движущиеся частицы (главным образом эритроциты) приводят к частотному сдвигу. Спектр принятого сигнала обрабатывается в аппарате в соответствии с алгоритмом, полученном Боннером для такого типа отражения, и рассчитывается объем потока (мл/мин/100 г ткани) [87].
Метод ЛДФ обладает высокой информационной эффективностью, прост в исполнении и не требует длительной обработки результатов [84], благодаря чему в течение последнего десятилетия находит все большее применение для оценки состояния кровотока в микрососудах и активно внедряется во всех областях медицины [49,69,87]. Данная методика часто применяется при наличии системных заболеваний сопровождающихся изменением гемоциркуляции и патологией сосудов: сахарный диабет, системные васкулиты и системные заболевания соединительной ткани, для диагностики различной сосудистой патологии конечностей: лимфедемы, облитерирующего атеросклероза [24, 30, 46, 59, 93].
Существует методика эндоскопической лазерной допплеровской фло-уметрии, когда световод датчика лазерного доплеровского флоуметра во время эндоскопии проводят через биопсийный канал эндоскопа к исследуемой области, после контактной установки световода регистрируют ЛДФ-грамму. Такая методика применяется в гастроэнтерологии, в частностри для диагностики предрецидивного синдрома и определения стабильности эндоскопического гемостаза при кровоточащей гастродуоденальной язве [36, 66].
А.М.Беляев и СЮ. Дворецкий (2007) предлагают использовать метод ЛДФ для исследования микроциркуляции толстой кишки стандартным све-товодным зондом во время проведения оперативного вмешательства [10].
Предложено использовать показатели лазерной допплеровской фло-уметрии в остром периоде ожоговой болезни для диагностики глубины поражения, в качестве критерия определения степени тяжести шока и его окончания, для оценки влияния оперативного вмешательства на течение ожоговой болезни, а также на различных этапах закрытия раневых дефектов сложными лоскутами на временной питающей ножке [96].
М.В. Козлова (2008) предлагает применять метод ЛДФ для диагностики и выявления особенностей нарушения микроциркуляции у женщин по-стменопаузального периода с артериальной гипертонией [47].
Х.Д. Асадов с соавт.(2005) производили оценку микроциркуляторных изменений методом ЛДФ в мошонке при различных температурных режимах для определения фертильности [5].
М.В. Жидков с соавт. (2007) предлагают использовать метод ЛДФ для динамической оценки течения управляемого масочного наркоза у детей, компьютеризированный метод ЛДФ позволит в режиме реального времени диагностировать признаки тканевой гипоксии, нарушения перфузии на уровне микроциркуляторного звена, а так же послужит критерием оценки болевого порога пациента при хирургических манипуляциях [98].
М.А. Апраксин (2009) изучая состояние микроциркуляции крови слизистой оболочки ротоглотки у больных хроническим тонзиллитом методом ЛДФ, отмечает преимущества данного метода в сравнении с реотонзилло-графией, где электоды вводимые в ткань небных миндалин приводят к ее повреждению и искажению результатов [4].
Все более широкое распространение находит методика ЛДФ в стоматологии. Н.К. Логинова, Т.В. Троицкая (2007) сообщают о широком использовании ЛДФ пульпы зуба за рубежом как для диагностики ее витальности после травмы, так и для исследования сосудистых реакций на различные воздействия [53, 54].
О.В. Казаков с соавт. (2007) использовали метод ЛДФ для диагностики изменений перфузии тканей десны при экспериментальном дефекте зубных рядов у крыс [42].
Однако максимальное значение в стоматологической практике метод ЛДФ приобретает для диагностики нарушений микроциркуляции при заболеваниях пародонта.
С применением методики ЛДФ К.М. Расулов с соавт. (2004) исследовали влияние перфторана на течение экспериментального пародонтита. По результатам исследования при пародонтите в сравнении с данными интакт-ных экспериментальных животных отмечался рост показателя уровня микроциркуляции, свидетельствующий об ухудшении кровоснабжения пародонта. Наиболее выраженные нарушения определялись в маргинальной десне [61].
А.Б. Серов (2009) разрабатывая метод профилактики развития хронических локализованных пародонтитов при протезировании несъемными протезами исследовал изменения микроциркуляции пародонта до и после протезирования [88]. Т.М. Бакерникова (2008) производила сравнительную оценку различных методик протезирования детей с дефектами зубных рядов с применением метода ЛДФ, в результате чего было выявлено более выраженное восстановление капиллярного кровотока в тканях десны под нейлоновыми протезами в сравнении с протезами из акриловых пластмасс [6].
Е.М. Келенджеридзе (2006) изучала процесс адаптации опорных тканей при ортопедческом лечении с использованием имплантатов по данным микроциркуряторных показателей [45].
С.А. Нарыкова (2005) при диагностике ранних стадий заболеваний пародонта методом ЛДФ предлагает использовать разработанный фиксатор стекловолоконного зонда, который позволит снизить уровень погрешностей измерений возникающих из-за разности нажима зондом на ткани исследуемой области. А так же специальное программное обеспечение для распознавания состояния микроциркуляции в пародонте, призванное ускорить и облегчить процесс интерпретации полученных данных [3,62, 63-].
Получение и доклинические испытания изделия медицинского назначения на основе хитозан-альгинат-гидроксиапатитного комплекса
Эксперимент проводился на базе кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии ГОУ ВПО КрасГМУ (зав. кафедрой д.м.н., проф. П.А. Самотесов). Анализы крови изучались на базе ЦНИЛ КрасГМУ (зав. лабораторией д.м.н., проф. Ю.В. Котловский).
Экспериментальное исследование проведено на 55 крысах-самцах линии Wistar, в возрасте 5-6 месяцев, массой 200-220 г. Содержание, уход, манипуляции и выведение животных из эксперимента произведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977г. №755, «Бюллетень ВАК России» №3 от 2002). Животные содержались в стандартных условиях вивария с соблюдением гигиенических нормативов, в качестве пищи использовался стандартный корм (набор злаков) (рис. 1). Все манипуляции с экспериментальными животными осуществлялись утром с 800 до 1200 с целью исключения влияния суточных колебаний метаболизма.
Экспериментальные животные были разделены на 5 групп: 1 группа - крысы с моделью инсулинозависимого сахарного диабета, адекватной инсулинотерапией и местным применением в области тканей па-родонта хитозан-алъгинат-гидроксиапатитного (ХАГ) комплекса (15 особей); 2 группа - крысы с моделью инсулинозависимого сахарного диабета, адекватной инсулинотерапией и местным применением в области тканей па-родонта хитозан-альгинатного (ХА) комплекса (15 особей); 3 группа - крысы с моделью инсулинозависимого сахарного диабета, адекватной инсулинотерапией и местным применением в области тканей парод онта гидроксиапатита (ГА) (15 особей). 4 группа - крысы с моделью инсулинозависимого сахарного диабета и адекватной инсулинотерапией, не получавшие местной терапии в области тканей пародонта (5 особей); 5 группа - интактные крысы (5 особей); Модель инсулинозависимого сахарного диабета воспроизводилась по методике Н.А. Пальчиковой с соавт. [73] путем однократного внутрибрю-шинного введения аллоксан гидрата из расчета 17,5 мг на ЮОг массы тела животного. Манипуляция производилась натощак - после 24 часового голодания, на фоне нормальных показателей уровня глюкозы в крови животных.
Забор крови производили из хвостовой вены по следующей методике: место укола обрабатывалось ватным тампоном смоченным 70% спиртом, вкол иглы производился на глубину до 2 мм, первую каплю крови стирали как содержащую случайные примеси и лимфу - не пригодную для эксперимента, затем производился забор свободно вытекающей крови в пробирку. Для предотвращения свертывания крови добавлялся антикоагулянт: на 15-20 мл крови 3-4 капли 10%-ного раствора Трилон Б.
Уровень глюкозы в цельной крови определялся при помощи тест-полосок и глюкометра One touch II, для чего на тест-полоску вставленную в аппарат наносили каплю забранной крови. Для получения сыворотки, пробы крови помещали в емкость с водой t=38C на 1-2 часа, затем отделившуюся сыворотку сливали и центрифугировали в течение 20 минут при скорости вращения 3000 об/мин. Уровень глюкозы в сыворотке крови определялся при помощи биохимического анализатора Stat Fax 1904 Plus. Содержание глюкозы в цельной крови интактных крыс соответствовало 1,8-3,3 ммоль/л, в сыворотке крови 1,08 - 3,7 ммоль/л.
Развитие сахарного диабета регистрировали путем определения содержания глюкозы в цельной крови и в сыворотке крови экспериментальных животных натощак. Констатацией факта развития сахарного диабета считали стойкое повышение уровня глюкозы в цельной крови и ее сыворотке в 3 раза. В среднем данный показатель составил 9-10 ммоль/л.
Экспериментальная модель сахарного диабета формировалась через 2 недели после введения аллоксан гидрата, с этого момента животным была начата общая инсулинотерапия: ежедневно, подкожно крысам вводился на-тивный инсулин в адекватной дозе - ЮЕд. Котроль эффективности инсули нотерапии производился еженедельно до момента завершения эксперимента путем измерения глюкозы цельной крови натощак и после нагрузочкого теста через 2,3,4,5,6 ,7 часов при помощи тест-полосок и глюкометра One touch П.
Через 4 недели от начала эксперимента, была начата местная терапия тканей пародонта. 1 раз в 3 дня препараты (ХАГ, ХА, ГА) в форме геля, при помощи инсулинового шприца с затупленной иглой и стоматологической гладилки наносились на десну и в пародонтальные карманы в области жевательных зубов экспериментальных животных. Гелевую массу получали путем разведения сухого вещества в дистиллированной воде в соотношении 1:1 (рис. 2). Во время проведения процедур животные находились под легким эфирным наркозом (рис. 3,4).
Перед началом проведения местных терапевтических мероприятий и по окончании курса терапии, состояние пародонта крыс было оценено при помощи индексов PBI и йодного числа Свракова [50].
Индекс кровоточивости сосочков (PBI) по Saxer и МиЫетапп Для определения данного индекса, проводят осторожное зондирование десневой борозды, затем оценивают наличие и уровень кровоточивости межзубных сосочков. Значения индекса определяют отдельно для каждого квадранта и затем выводят среднее значение для всего прикуса.
Получение полимерного комплекса на основе хитозан-альгинат-гидроксиапатита, результаты санитарно-химического и токсикологического исследования изделия медицинского назначения «ХАГ-БОЛ»
В результате смешивания исходных составляющих в расчете на грамм сухого хитозана молекулярной массы 300-700 Ша и степени дезацетилиро-вания свыше 95%: аскорбиновой кислоты - 1,8 г, хондроитинсерной кислоты - 5-100 мг, гиалуроновой (D-глюкуроновой) кислоты - 10-100 мг, сывороточный фактор роста крупного рогатого скота (гликопротеид с ММ около 20000 Da, сахаридная часть- 25%, белковая часть - класс S-белков) - 11-220 мкг, гепарина - 2,5-5 мг, натриевой соли альгиновой кислоты - 2 г, гидроксиапати-та высокодисперсного - 0,25-0,5 г, получен полимерный комплекс представляющий собой сублимированную массу светло-кремового цвета, содержащую 2% аскорбат-хитозана, хондроитинсерную и гиалуроновую кислоты, гепарин, сывороточный фактор роста крупного рогатого скота, 4% альгинат-натрия и 50% аморфный гидроксиапатит, в соотношении аскорбат-хитозана и альгинат-натрия 1:1.
По результатам проведения санитарно-химических исследований полимерной композиции на основе хитозан-альгинат-гидроксиапатитного комплекса - покрытия раневого, стерильного «ХАГ-БОЛ»: содержание восстановительных примесей в водных вытяжках из образцов, найденное по расходу 0,04 Н раствора тиосульфата натрия составило 0,1 при допустимом значении критерия не более 1,0 мл. Изменение значения рН вытяжки по сравнению с контролем составило 0,24 при допустимом значении критерия не более 1,0. Содержание органических примесей в водных вытяжках из образцов, определяемое спектрофотометрически по величине оптической плотности в диапазоне 230-260 нм, составило 0,18, при допустимом значении критерия не более 0,300. По результатам метода атомно-абсорбционной спектрофотометрий в водных вытяжках из образцов содержание меди 0,01 мг/л, при допустимом значении критерия до 1,0 мг/л, содержание свинца 0,01 мг/л, при допустимом значении до 0,01 мг/л, содержание хрома 0,01 мг/л, при допустимом значении 0,1 мг/л, содержание кадмия 0,0001 мг/л, при допустимом значении 0,001 мг/л, содержание бария 0,01 мг/л, при допустимом значении критерия 0,1 мг/л и содержание олова 0,01 мг/л при допустимом значении 0,1 мг/л. Содержание формальдегида составило 0,01 мг/л, пр допустимом значении критерия 0,1 мг/л.
При токсикологическом исследовании «ХАГ-БОЛ» установлено: в экспериментах на крысах и кроликах показано отсутствие местнораздра-жающего действия вытяжек на кожу и слизистые оболочки, в опытах in vitro с изолированными и отмытыми эритроцитами кролика не отмечено гемолитического эффекта вытяжек. В остром опыте на белых беспородных мышах при внутрибрюшинном введении вытяжек в дозе 50 мг/кг массы тела животного не наблюдалось гибели животных. Не выявлено клинических признаков интоксикации животных: общее состояние, поведенческие реакции, состояние шерстного покрова, поедание корма в опытной группе не отличалось от контроля. На вскрытии ткани в месте введения вытяжки, регионарные лимфатические узлы, внутренние органы животных не имели признаков патологии. Весовые коэффициенты внутренних органов (печень, почки, селезенка) у опытных мышей в пределах физиологической нормы.
По результатам испытаний образца на стерильность - стерильно, на пирогенность - апирогенно. Значение индекса токсичности составило 98,3% при допустимом значении критерия от 70 до 120%.
По результатам проведенных испытании вынесено следующее заключение: изученные образцы отвечают требованиям, предъявляемым к изделиям медицинского назначения, имеющим контакт с тканями организма, в условиях эксперимента материалы изделий проявили достаточную химическую стабильность, вытяжки из них не оказали неблагоприятного воздействия на биологические объекты.
Формирование экспериментальной модели аллоксанового сахарного диабета было зарегистрировано через 2 недели после введения аллоксан гидрата: наблюдалось стойкое повышение уровня глюкозы цельной крови и сыворотки крови в 3 и более раза в сравнении с соответствующими показателями интактных крыс (р 0,001) (табл. 1).
С третьей недели (15 дня) от начала эксперимента была начата общая инсулинотерапия, в результате которой достигнута компенсация течения экспериментального сахарного диабета: показатели уровня глюкозы цельной крови натощак и после нагрузочного теста у крыс с моделью аллоксанового сахарного диабета не имеют достоверных отличий (р 0,005) от принятых значений для компенсированного течения СД I типа (табл. 2).
Наличие клинических признаков поражения пародонта: воспаление и кровоточивость оценивалось при помощи Йодного числа Свракова и индекса PBI. Регистрация состояния пародонтальных тканей производилась троекратно: в 1 день эксперимента до процедуры введения аллоксан гидрата, на 29 день эксперимента перед началом курса местной терапии и на 56 день после окончания курса аппликационной терапии.
Показатели пародонтологических индексов интактных крыс полученные до начала эксперимента соответствуют данным здорового пародонта: в результате обработки десны раствором Люголя окрашивания не происходит, после зондирования кровоточивость осутствует (табл. 3).
