Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Этиология, патогенез, морфогенез и лечение воспалительно-деструктивных заболеваний пародонта. маргинальный периодонтит и его место в характеристике проблемы (обзор литературы) 8
1.1 Современные представления об этиологии, патогенезе пародонтита, маргинального периодонтита 8
1.2 Современные подходы к лечению воспалительно-деструктивных заболеваний пародонта 13
1.3 Использование клеточных технологий в реконструктивной медицине 18
1.4 Клинические и технические проблемы в применении клеточных технологий при лечении заболеваний пародонта 25
Глава 2 Материалы и методы исследования 28
2.1 Общая характеристика исследуемых животных 28
2.2 Модель периодонта у экспериментальных животных 29
2.3 Методика введения лекарственных средств, медицинских изделий и клеток пуповинной крови крыс в периодонт экспериментальным животным 38
2.4 Методы исследования 39
2.4.1 Клинические методы исследования 39
2.4.2 Гистологические методы исследования 41
2.4.3 Методы статистического анализа данных 42
ГЛАВА 3 Клинико-морфологическая характеристика периодонтита. Сравнительная оценка результатов лечения воспалительно-деструктивных процессов периодонтита 44
Заключение 71
Выводы 77
Практические рекомендации 79
Список сокращений и условных обозначений 80
Список литературы
- Современные подходы к лечению воспалительно-деструктивных заболеваний пародонта
- Клинические и технические проблемы в применении клеточных технологий при лечении заболеваний пародонта
- Методика введения лекарственных средств, медицинских изделий и клеток пуповинной крови крыс в периодонт экспериментальным животным
- Гистологические методы исследования
Современные подходы к лечению воспалительно-деструктивных заболеваний пародонта
Краевой, или маргинальный периодонтит, в последнее время, большинство исследователей относят к болезням пародонта [5; 18; 52]. Механизм развития воспалительных явлений в тканях маргинального пародонта тесно связан с нарушением тканевой и сосудистой проницаемости. По существу, характерно повышение проницаемости соединительнотканных структур пародонта, с присоединением воспалительного компонента. Маргинальный периодонтит возникает чаще всего под воздействием внешних факторов, таких как зубные отложения, нависающие края пломб, некачественно изготовленные зубные протезы, нарушение технологий ретракции десны, постановки пломб, острые и хронические заболевания, при которых инфекция может проникнуть в десневой карман. Так, в исследованиях J. B. Payne et al., T. Kobayashi, H. Yoshie [128; 179] показана взаимосвязь между ревматоидным артритом и нарушениями волоконно-связочного компонента пародонта.
Достаточно часто маргинальный периодонтит возникает без непосредственного участия инфекции, например, из-за механической травмы. Травматический периодонтит обычно развивается быстро и протекает достаточно остро. Периодонтит, начинающийся как травматический, в результате проникновения инфекции, становится инфекционным. Тогда провести четкую грань между этими типами заболевания становится практически невозможно. Возможно развитие периодонтита вследствие аллергических реакций на медикаменты, либо в результате неправильного лечения пульпита. В последнем случае сильнодействующие препараты (формалин, фенол и др.) попадают в периодонт, вызывая воспаление [5; 18; 52].
Интересным представляется аналитическое исследование G. Avila-Ortiz et al. [73] существующих подходов к изучению периодонтальной регенерации в области фуркационных дефектов, что подчеркивает актуальность выполнения комплексных клинико-морфологических исследований в данной области.
Этиологические факторы маргинального периодонтита – грамотрицательные бактерии полости рта, которые колонизируют поверхность зубов и десневую борозду. К основным периодонтопатогенным бактериям (маркерным микроорганизмам) относят: микрофилы – группа Bacteroides (род Porphyromonas, род Prevotella), факультативные анаэробы Actinobacillus actinomycetamcomitans (A. atinomycetamcomitans), Eicenella corrodens, важнейший фактор их вирулентности – липополисахаридный эндотоксин (ЛПС), находящийся на внешней мембране бактерий. Грамположительные: Peptostreptococcus (P. micros, P. anaerobicus) – обладают высокими адгезивными свойствами по отношению к эмали и эпителию, агрегируются с другими периодонтопатогенами, Actinomyces (A. viscosus, A. odontolyticus) – связывают с развитием гингивитов у взрослых
На ранних стадиях периодонтита бактериальная флора периодонтального кармана сходна с таковой при гингивите. Активная инвазия микроорганизмов в эпителиальные структуры периодонта рассматривается как переход гингивита в периодонтит [105].
Изучение патогенеза периодонтита традиционно концентрировалось на роли бактериальной инфекции, но в последнее время возросло количество исследований природы иммунного ответа. При заболеваниях периодонта в воспалительный процесс, возникающий в ответ на бактериальную инвазию, вовлекаются факторы как неспецифического, так адаптивного (специфического) иммунитета, и именно система иммунитета является одним из ключевых звеньев патогенеза острого и хронического воспалительного процесса в периодонте, определяющих развитие местных тканевых реакций на воздействие патогенов.
При пародонтите инфекция попадает в пространство между зубом и десной и разрушает опорно-удерживающий аппарат зуба. Распространенность заболевания у взрослых достигает 80%, из них 20-30 % составляют тяжелые формы [136, 145]. Хронический периодонтит обычно протекает бессимптомно до тех пор, пока не начнется ослабление прикрепления и формирование патологической подвижности зубов. Несмотря на то, что в развитии заболевания большую роль играет рост бактерий, значительное влияние оказывает предрасположенность организма пациента. Иммунно-воспалительный ответ формируется в области маргинальной десны и тканях пародонта в ответ на хроническое присутствие бактерий зубного налета и вызывает разрушение структурных компонентов пародонта, что, в свою очередь, приводит к прогрессированию клинических проявлений пародонтита и, в конечном итоге, выпадению зуба [123, 151].
Результаты нескольких проспективных когортных исследований и исследований случай-контроль обнаруживают связь между патологией пародонта и общесоматическими состояниям и, в частности, заболеваниями сердечнососудистой системы, эндокринной системы (чаще всего сахарный диабет), органов дыхания и др. [19, 32, 58]. Установлена взаимосвязь между заболеванием пародонта и преждевременными родами, что может быть связано с воздействием на децидуальные ткани патогенов из тканей пародонта вследствие транзиторной бактериемии или действием провоспалительных медиаторов, попадающих в системный кровоток, на ткани матки [17, 74, 77, 121].
Современные концепции этиопатогенеза заболевании пародонта предусматривают наличие главных, преобладающих бактериальных патогенов, с которыми связывают клинические формы и тяжесть течения заболевания. Эти патогены присутствуют минимально в начале каждого пародонтального воспалительного и деструктивного процесса. Этот процесс в значительной степени зависит от реактивности защитных сил организма [26].
Бактерии – это основнои этиопатогенетическии фактор заболевании пародонта. Болезни пародонта вызывают специфические бактерии – пародонтопатогены, содержащиеся в зубном налете, которыи находится в десневои борозде, на корне зуба, на поверхности соединительного эпителия и в пародонтальных карманах. В 1г зубного налета содержится около 1011 бактерии . Большая часть этих бактерии – грамотрицательные анаэробы, вырабатывающие большое количество эндотоксина, которыи обладает огромным иммунореактивным потенциалом. Выделяют 5 бактериальных комплексов зубного налееа. Комплекс 1 – локализуется в местах наибольшеи деструкции пародонта, коррелирует с глубокими пародонтальными карманами и кровоточивостью десен. В него входят следующие бактерии: Porphiromonas gingivalis, Bacteroides forsithus, Treponema denticola.
Клинические и технические проблемы в применении клеточных технологий при лечении заболеваний пародонта
Забор зубного камня осуществляли стерильной штопфер-гладилкой, помещали его в стерильный контейнер и в течение пяти часов использовали для введения экспериментальным животным.
Перед созданием модели периодонтита из каждой группы было выведено из эксперимента по одной особи для сравнения здоровых тканей периодонта (контроль – контрольные показатели) с течением патологических процессов и сравнения динамики регенеративных процессов после введения препаратов животным. на 14 день в область середины альвеолярного В группах животных проводили следующие манипуляции: Группа 1 (не получавшая лечение) – естественное течение модели экспериментального периодонтита (9 крыс). Группа 2 – на 14 день в область середины альвеолярного отростка, между резцами нижней челюсти, в слизистую оболочку десны вводили антибиотик широкого спектра действия – 30 % раствор линкомицина гидрохлорида в течение 7 дней, в объеме 1,0 мл (9 крыс). Группа 3 – отростка, между резцами нижней челюсти, в слизистую оболочку десны однократно вводили клеточный концентрат пуповинной крови крысы, в объеме 1,0 мл (9 крыс). Группа 4 – на 14 день в область середины альвеолярного отростка, между резцами нижней челюсти, в слизистую оболочку десны однократно вводили биоматериал «Аллоплант» в объеме 1,0 мл (9 крыс).
В начале эксперимента был проведен предэксперимент: отбор 10 самцов крыс в экспериментальную группу 3 с использованием клеток пуповинной крови крысы. Забор крови у самцов и самок осуществляли методом пункции хвостовой вены; критерием отбора самцов была отрицательная реакция агглютинации, что свидетельствовало о групповой совместимости образцов крови самок крыс.
Экспериментальных 5 крыс-самок в возрасте 5-10 месяцев подсаживали к самцам на оплодотворение и ежедневно изучали вагинальные мазки на наличие сперматозоидов. День обнаружения сперматозоидов в мазках считали первым днём беременности; определение беременности проводили по методу Папаниколау с добавлением иммерсионного масла и просматривали под микроскопом мазок при 40 на наличие жизнеспособность сперматозоидов. Дополнительным признаком наступления беременности являлось отсутствие очередной течки у самки, а через 2 недели – признак, получаемый после ощупывания брюшка крысы. Беременных самок содержали отдельно в родильной клетке, с гнездовым домиком с мягкой подстилкой.
Под общим ингаляционным эфирным наркозом, в условиях чистой операционной , при соблюдении правил асептики и антисептики, после обработки кожи спиртом, скальпелем производили разрез передней брюшной стенки. Переднюю брюшную стенку вскрывали послойно: скальпелем производили разрез кожи длиной 5-6 см по средней линии живота, затем рассекали подкожную жировую клетчатку, вскрывали апоневроз, мышцы и брюшину – через него извлекали плацентарный мешок с зародышами (рисунки 5). Забор крови у зародыша крысы осуществляли путем прерывания беременности у крысы на 18 сутки и пункции пуповины инсулиновым шприцом с диаметром иглы 0,3 мм (30G).
После забора крови ее смешивали с антикоагулянтом и помещали в специальный контейнер, после чего доставляли в лабораторию, где из крови путем центрифугирования выделяли лейкоцитарный концентрат клеток пуповинной крови (рисунок 6).
Смешивание в контейнере пуповинной крови с антикоагулянтом Лабораторный этап эксперимента предусматривал выделение концентрата ядросодержащих клеток из пуповинной крови крысы путем центрифугирования. После забора крови эмбриона ее помещали в пробирку, взвешивали массу собранной крови с подсчетом ее объема, учитывая массу антикоагулянта. В нашем исследовании у каждой особи получено 4,5 мл. пуповинной крови. Удаление эритроцитов позволяет снизить риск развития реакции несовместимости по эритроцитарным антигенам. Метод автоматической сепарации путем центрифугирования пуповиннои крови, предложенный Rubinstein et al. в 1995 году [162], основан на ускорении седиментации эритроцитов при добавлении 6 % гидроксиэтиленкрахмала (рисунок 7).
Антикоагулянт берется в виде цитрат-фосфат-декстроза-аденин с массой, равной 0,46 (Pак V) г, среднее значение плотности крови равно 1,05 г/мл, а объем антикоагулянта – 0,3 (9 : 1) мл, после перемешивания пуповинной крови с антикоагулянтом, внесенным в пробирку с пуповинной кровью, вводят седементирующее средство в виде 6% раствора гидроксиэтилкрахмала в объеме, рассчитанным по формуле V2 = 0,2 V1, гидроксиэтилкрахмала в соотношении его с пуповинной кровью 1 : 5. После удаления осевших эритроцитов получают надосадок, обогащенный леи коцитарный концентрат пуповинной крови.
В большинстве технологий разделения биологических жидкостей на составные части используется метод их центрифугирования, к основным параметрам которого относятся время и скорость центрифугирования. Время первого центрифугирования в среднем составляет 428 оборотов/мин., 7 минут, а второго центрифугирования 1220 оборотов/мин., 13 минут. От использования стандартной скорости центрифугирования, указанной в работах работе Rubinstein (1995), было решено отказаться по следующим причинам: потери образца и снижение жизнеспособности клеток пуповинной крови крысы [55]. Исходя из представленной информации, для получения концентрата клеток пуповинной крови и последующего его использования в эксперименте, было выбрано однократное центрифугирование c 6 % гидроксиэтилкрахмала и скорость вращения центрифуги, равная 3000 об/мин., в течение 3 минут. Таким образом, нам удалось получить концентрат клеток, зона которого четко определялась в пробирке, он легко забирался тонкоигольным шприцем, с минимальной потерей
Методика введения лекарственных средств, медицинских изделий и клеток пуповинной крови крыс в периодонт экспериментальным животным
Для решения поставленных задач были проведены исследования на экспериментальных животных – крысы линии Вистар, представляющих собой половозрелых особей в возрасте от восьми месяцев до года общей численностью – 45 особей. Все животные находились на одинаковом пищевом рационе и проходили предоперационную подготовку в течение 12 часов до проведения этапа моделирования экспериментального периодонтита по методу, предложенному С. П. Рубниковичем (2011) [36]. Состояние слизистой оболочки десны и глубину зубодесневых карманов оценивали с 1 по 14 день создания модели периодонтита. Оценку развития воспалительных изменений в периодонте животных производили по наличию кровоточивости при пальпации десны, показателям глубины зубодесневых карманов, характеру отделяемого из них, наличию патологической подвижности резцов нижней челюсти.
Забор пуповинной крови крысы осуществляли путем прерывания беременности у крысы на 18 сутки, под общим ингаляционным эфирным наркозом, в условиях чистой операционной, путем пункции пуповины инсулиновым шприцом с диаметром иглы 0,3 мм. Лабораторный этап эксперимента предусматривал выделение лейкоцитарного концентрата клеток пуповинной крови крысы путём центрифугирования. Удаление эритроцитов проводили методом неавтоматической сепарации пуповиннои крови по Rubinstein et al. (1995) [162]. Разделение пуповинной крови на эритроцитарную массу и лейкоцитарный концентрат производили с помощью 6 % раствора гидроксиэтилкрахмала, 0,3 мл (кл. 3,5 107/мл). Для выявления жизнеспособности СК использовали окраску клеток с помощью 0,1 % раствора трипанового синего, смешанного с равным количеством клеточной суспензии. Считали на 100 клеток количество окрашенных синим, таким образом определяя процент жизнеспособности (85-95%).
Экспериментальные животные были разделены на 4 группы: группа 1 (не получавшие лечения) – естественное течение модели экспериментального периодонтита; группа 2 – на 14 день модели экспериментального периодонтита в область середины альвеолярного отростка, между резцами нижней челюсти в слизистую оболочку десны вводили антибиотик широкого спектра действия – 30 % раствор линкомицина гидрохлорида в течение 7 дней по 1 мл; группа 3 – на 14 день производили однократное введение лейкоцитарного концентрата клеток пуповинной крови по 1 мл; группа 4 – на 14 день модели экспериментального периодонтита в исследуемую область однократно вводили биоматериал «Аллоплант», по 1 мл.
После выведения животных из эксперимента проводили препарирование и выделение нижних челюстей, из которых образцы тканей периодонта помещали в 10 % забуференный формалин, с дальнейшим обезвоживанием в батарее спиртов и изготовлением парафиновых блоков. Срезы толщиной 4-6 мкм для выявления коллагеновых волокон окрашивали гематоксилин – эозином и по Ван Гизону, эластические и преэластические волокна окрашивали орсеином по Унна-Тенцеру [35]. Светооптическое исследование и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе «Axiostar» (Германия) при увеличении ( 200 и 400). Морфометрическое исследование полученных срезов проводили при помощи программы «Image Tool»: сфотографированные в цифровом формате срезы (при увеличении 200 и 400) вводили в компьютер (операционная система Windows XP) в формате BMP и посредством копирования из буфера обмена анализировали данной программой. В отношении каждого случая производили измерение определенного критерия в 10 полях зрения. В течение первой недели эксперимента у животных наблюдались признаки воспаления, которые сопровождались отеком и гиперемией слизистой оболочки десны.
В результате созданной модели на 14 сутки экспериментального периодонтита наблюдались изменения слизистой оболочки десны, которые сопровождались кровоточивостью и серозным-гнойным отделяемым из зубодесневых карманов, и образование во всех группах свищей в поднижнечелюстной области. При гистологическом исследовании свищи были представлены очагом некроза периодонта, отграниченного от окружающих тканей зоной демаркационного воспаления.
В 1 группе на 21 сутки эксперимента у особей наблюдалось снижение доли клеточного компонента и образование зрелой соединительной ткани, представленной коллагеновыми волокнами, с небольшой долей межклеточного вещества и лимфоцитами, со значительной долей волокнистого компонента, представленного коллагеновыми волокнами. Патологическая подвижность резцов нижней челюсти – отсутствовала. Средняя глубина зубодесневых карманов составила (2,47 ± 0,27 мм).
В 2 группе на 21 сутки эксперимента у животных данной группы признаков воспаления отмечено не было, подвижность резцов нижней челюсти отсутствовала. Средняя глубина зубодесневых карманов в этой группе на 21 сутки эксперимента составила (2,22 ± 0,13 мм). В этой группе также наблюдали образование молодой волокнистой соединительной ткани с преобладанием коллагеновых волокон.
В 3 группе на 21 сутки эксперимента у животных отделяемое и кровоточивость при пальпации десны, патологическая подвижность резцов нижней челюсти отсутствовали. Средняя глубина зубодесневых карманов в этой группе составила (1,48 ± 0,04 мм).
В 3 группе за счет активной миграции ПЯЛ и макрофагов, удовлетворительной фагоцитарной активности фибробластов произошла адекватная регенерация – образование молодой соединительной ткани, содержащей коллагеновые и преэластические волокна. В основе этого процесса лежит сбалансированная деградация коллагена, которая предотвращает образование грубой соединительной ткани. Соотношение коллагеновых и преэластических волокон – 3:1. В данной группе отмечена выраженная динамика регенеративных процессов в тканях периодонта по сравнению с 1 и 2 группами.
Гистологические методы исследования
Попарное сравнение глубины зубодесневого кармана между группами на 7 день позволяет определить статистически значимые различия между 1 группой и группами 2, 3, 4. На 14 и 21 день имелись статистически значимые различия между 3 группой и группами 1, 2, 4. Нулевая гипотеза не отвергается только в следующих случаях: – группа без лечения / группа с применением 30 % раствора линкомицина гидрохлорида, – группа без лечения / группа с применением материала «Аллоплант» и 30 % раствора линкомицина гидрохлорида, – группа без лечения / группа с применением материала «Аллоплант».
Вышеизложенное позволяет говорить о том, что с момента начала эксперимента до введения препаратов глубина зубодесневых карманов увеличивалась равномерно во всех группах (p = 0,819).
После инъекций 30 % раствора линкомицина гидрохлорида, клеток пуповинной крови и «Аллопланта» патологическая глубина зубодесневых карманов во всех группах уменьшалась неравномерно. Согласно статистическим показателям наибольший регенеративный эффект наблюдался у экспериментальных животных 3 группы – средняя глубина зубодесневых карманов на 21 сутки эксперимента составила (1,48 ± 0,04 мм). Изучение количества коллагеновых и преэластических волокон в тканях периодонта на 21 день эксперимента позволяет говорить о наличии статистически значимых различий (p 0,001).
На 21 день количество коллагеновых волокон в 1 группе составило – (56,62 ± 1,59); во 2 группе – (65,59 ± 0,67); в 3 группе – (45,96 ± 0,46); в 4 группе – (45,94 ± 0,38). Эти данные позволяют определить статистически значимые различия между группами 1 и 3, 1 и 4, 2 и 3. Статически незначимы различия между группами 3 и 4. На 21 сутки количество преэластических волокон в 3 группе составило (10,34 ± 0,18); в 4 группе – (9,08 ± 0,16), что позволяет определить статистически не значимые различия между группами 3 и 4. Данный результат отражает то, что в 1 и 2 группах наблюдается наибольшее количество коллагеновых волокон и отсутствие преэластических волокон (Таблица 3). Наиболее близкое к контрольным показателям количество коллагеновых (46,08 ± 0,75) и преэластических (11,73 ± 0,31) волокон наблюдалось у экспериментальных животных 3 группы. Количество коллагеновых волокон в этой группе составило (45,96 ± 0,46), а преэластических волокон (10,34 ± 0,18) (таблица 4).
Количество преэластических волокон на 21 день по сравнению с контрольными показателями указывает на наличие статистически значимых различий как для СК, так и для материала «Аллоплант». На основании статистических данных можно сказать о том, что в группах 3 и 4 количество преэластических волокон статистически значимо не отличается от контрольной группы. Это свидетельствует о качестве регенеративных процессов в периодонта животных (таблица 5).
Результаты изучения количества коллагеновых волокон в тканях периодонта на 21 день эксперимента, в сравнении с контрольным показателям, свидетельствуют о наличии статистически значимых различий для групп 1 и 2. Из этого следует, что гистологическое строение периодонта в группах 3 и 4 близко к контрольным показателям.
В группах 1 и 2 количество коллагеновых волокон статистически значимо больше, чем в контрольных показателях, что свидетельствует о формировании грубоволокнистой соединительной ткани (рисунок 28).
Количественные показатели коллагеновых волокон в тканях периодонта в результате использования различных методов лечения экспериментального периодонта (21 сутки), – наличие статистически значимых различий по сравнению с контролем
На основании статистических данных можно сказать, что в группах 3 и 4 количество коллагеновых волокон приближенно к контрольным показателям, что подтверждает качество регенеративного процесса в группах со СК и материалом «Аллоплант».
Попарное сравнение толщины преэластичеческих волокон между 3 и 4 группами позволило определить статистически значимые различия по всем дням измерений, что свидетельствует о более выраженных процессах регенерации (таблица 6). Таблица 6 – Толщина преэластичеческих волокон измерений в группах по дням
Сравнение толщины коллагеновых волокон по дням позволяет говорить о наличии статистически значимых различий (p = 0,005) между группами только на 21 день измерения (таблица 7). Попарное сравнение между группами на 21 день позволяет определить статистически значимые различия в группах: 1 и 2.
Межгрупповое сравнение по критерию Шеффе Сравнение толщины преэластических волокон между контрольными показателями и остальными экспериментальными животными в группе с использованием СК в сочетании с материалом «Аллоплант» позволило установить статистически значимые различия, заключающиеся в меньшей толщине преэластических волокон на 21 день у животных 3 и 4 групп в сравнении с контрольными показателями (таблица 8).
Номер группы сравнения Анализ характера отделяемого из зубодесневых карманов выявил статистически значимые отличия на 14 день эксперимента между частотой выявления серозного отделяемого в группах с использованием СК и материала «Аллоплант». На 7 день значимые отличия по встречаемости гнойного отделяемого отмечались для групп 1–3 и 3–4. На 14 сутки установлены существенные различия по признаку прекращения выделений из зубодесневых карманов между группой с использованием СК и остальными группами наблюдения. К 21 дню эксперимента во всех изучаемых группах, за исключением группы без лечения (р 0,05), отмечалось прекращение выделений из зубодесневых карманов, что свидетельствует об устранении воспалительных явлений в периодонте животных групп 2, 3 и 4. При этом следует отметить, что к 14 дню отмечалось 3 летальных случая в 1 группе, что объясняет отсутствие случаев гнойного выделения при оценке результатов данного дня (таблица 11).
