Жизнеспособность гепатоцитов в монослойной культуре при воздействии витрифицирующих концентраций этиленгликоля и 1,2-пропандиола Диалло Мухамаду

Введение к работе

Большое значение в настоящее время представляют собой вопросы, которые связаны с определением особенности поведения биологических объектов разного уровня организации в присутствии витрифицирующих концентраций криопротекторов. При этом, на первом плане стоит определение принципов подбора композиционного состава среды насыщения, что в перспективе обеспечивает разработку оптимальных условий подготовки биообъектов к последующему замораживанию, пшотермическому или низкотемпературному хранению.

В современном представлении среди многих факторов, которые способны вызвать повреждение клеток, одним из первых является высокая осмолярность среды, которая способствует вымораживанию объемной воды при температурах, которые близки к евтетики. Повреждение клеток при воздействии высоких концентраций солей и неэлектролитов (а также криопротекторов) связано с осмотической деградацией и одновременно с изменением объема и формы клеток, а также с модификацией структурного состояния комплекса цитоскелет-мембраны. Степень этих изменений зависит от температуры, композиционного состава и осмолярности среды. Одновременно в каждом из этих факторов может быть изменение соответствующим образом, путем подбора компонентов среды, их концентрации и быстрого охлаждения. При этом важно обратить внимание на то, что осмотический эффект, который связан с естественной кристаллизацией, может быть отстранен при использовании высоких концентраций криопротекторов. В связи с этим большое внимание в этой работе уделялось определению осмотических и температурных параметров среды, которые обеспечивают жизнеспособность гепатоцитов при насыщении в присутствии вит-рификации концентрации криопротекторов и их стойкость при гипотермиче-ском сохранении и замораживании. Значение параметров среды обусловлено не только тем, что они обозначают следующую реакцию клеток на изменение параметров среды в процессе снижения температуры, а и тем, что они контроли-

руют сохранение жизнеспособности биообъектов при долгосрочной экспозиции в нефизиологических условиях.

В настоящее время практически отсутствуют данные о том, как начальные условия влияют на гепагоциты при их насыщении проникающими криопротек-торами в витрифицирующих концентрациях. Также данные, которые указывают, как модифицирующие действия высоких концентраций этих сред реализуются в условиях длительной экспозиции при конечных температурах сохранения.

Актуальность проблемы связана с недостатком данных начальных параметров среды на процессе насыщения биообъектов витрифицирующими концентрациями проникающих криопротекторов в условиях долгосрочного экспонирования при гипотермическом сохранении и замораживании.

Последнее обстоятельство чрезвычайно важно для криобиологической практики, поскольку низкотемпературное экспонирование является основой консервирования клеток. Здесь особенно заметно отсутствие данных о характере влияния конечных состояний клеток на их стойкость к осмотической дегидратации в криозащитных средах, которые могут быть использованы для эффективного гипотермического сохранения и замораживания, а также обуславливают новые способы низкотемпературного сохранения суспензии клеток, клеток в культуре и органов. Кроме того, остаются неизученными вопросы, связанные с реализацией механизмов, которые обеспечивают повышение или снижение структурной стабильности клеток в условиях их насыщения высокими концентрациями (до 60%) проникающих крипротекторов. С другой стороны, модельное исследование позволяет ответить на вопрос, как начальные стадии определяют поведение биообъектов в процессе длительного контакта с высокими концентрациями криозащитных веществ, например, при гипотермическом сохранении или перфузии.

з ЦЕЛЬ РАБОТЫ

С учетом вышеизложенного, целью этой работы является изучение влияния верифицирующих концентраций ЭГ и 1,2-ПД на жизнеспособность гепа-тоцитов в монослойной культуре при гипотермическом сохранении и замораживании.

1. Изучить влияние среды насыщения, содержащей проникающие крио-протекторы с разным коэффициентом проникновения (этиленпшколь - 10"³ и 1,2-пропандиол - 10'²), а также электролитов (75-450 мМ NaCl) на барьерных функциях гепатоштов (по выходу флуоресцейна ЛДГ, лактата и К⁺) при +20С и +4С.

2. Определить влияние начальных осмотических парамсіров растворов, содержащих NaCl, KG, CaCl? и сахарозы, а также температурных условий, среды насыщения гепатоцитов витрифицирующимн концентрациями (40-60%) ЭГ и 1,2-ПД на барьерных свойствах мембраны методами выхода флуоресцейна, ЛДГ, лактата и К*, и сохранности способности к биосинтезу белка и к эндогенному дыханию на этапе насыщения после гипотермического сохранения и замораживания.

3. Выяснить влияние условий удаления криопротекторов на морфофунк-шюнальное состояние изолированных гепатоцитов, например, при их использовании в клинической практике.

Установлено, что исходные условия среды насыщения криопротекторов определяют поведение клеток в условиях действия гипотермического (+4С) и замораживании (-196 С).

Физико-химические характеристики криопротекторов обусловлены разной стойкостью клеток к действию повреждающих факторов температурного влияния. Повышение чувствительности клеток к смене осмотических условий сред при насыщении клеток витрифицирующнмн концентрациями криопротекторсв связано с нарушением барьерных функций мембран, т.е. развитием потери катионов. Эти изменения происходят на фоне изменения форм клеток. Проведен анализ, который показывает связь между проникающей способностью криопротекторов, которая оценивается коэффициентом проникновения, количеством связанной не вымераженной воды и исходными условиями среды эквилибра-нии (композиционный состав и температура) на этапе насыщение гепатоцитов витрифицирующими ЭГ и 1,2-ПД.

Определение исходных параметров среды в условии насыщении гепатоцитов витрифицирующими концентрациями криопротекторов, при которых происходит изменение стойкости к гипотермическому сохранению и замораживанию. Полученные данные могут быть использованы для разработки методов низкотемпературного консервирования биообъектов в витрифицирующем состоянии при условии действия умеренных температур +4С, что не требует использование дорогого оборудования, также они обуславливаю! подходы для разработки метода долгосрочного сохранения органов после после их насыщения витрифицирующими концентрациями криопротекторов в условиях действия гипотермической перфузии.

Диссертационное исследование выполнено под научным руководством член. кор. Академии Наук Украины A.M. Белоуса, в сотрудничестве с канд. биол. наук В.А. Коптелоаым, с которыми автор имеет совместные публикации. Все результаты, приведенные в рукописи, получены соискателем самостоятельно. Диссертантом лично проведены эксперименты и определение выбран-

ных для исследования биохимических показателей, проанализирована литература по теме исследования, обсуждены полученные результаты.

Похожие диссертации на Жизнеспособность гепатоцитов в монослойной культуре при воздействии витрифицирующих концентраций этиленгликоля и 1,2-пропандиола

Фармакологическая регуляция функции Na#2+#1-K#2+#1-2Cl#2-#1-котранспортера скелетных мышц и изучение его роли в гомеостазе калия и водыГосманов Айдар Рауисович

Токсиколого-гигиеническая характеристика триазавирина (натрия 7-метилтио-3-нитро-4-оксо-1,4-дигидро[1,2,4] триазоло[5,1-с] [1,2,4]триазин-1-ид дигидрата)Черкащенко Ольга Сергеевна

Особенности субпопуляции цитокинопродуцирующих клеток (INF\Nc#2+#1 и IL-4#2+#1) при атопической и смешанной формах бронхиальной астмы [Электронный ресурс]Удалова Валентина Александровна

Местноанестезирующие свойства некоторых 1- и 9-замещенных 2-трет-бутилимидазо[1,2]бензимидазолаБогус, Саида Казбековна

Местноанестезирующие свойства некоторых N-аминоэтилзамещенных 2-арилимидазо[1,2-a]бензимидазолаВасильева, Светлана Викторовна

Поиск новых антидепрессантов в ряду производных 1,2,4-триазола и тиетан-1,1-диоксидаГабидуллин Ришат Анварович

Na#2+#1/Li#2+#1-противотранспорт в мембране эритроцита больных с разной клинической характеристикой рассеянного склерозаПопова Наталия Анатольевна

Типовые реакции и особенности многоуровневых взамиосвязей ремоделирования миокарда и сосудов у пациентов с артериальной гипертензией 1 - 2 степени, их вклад в конечные точки сердечно-сосудистого контиГригоричева Елена Александровна

Динамика клинического статуса и показателей электрического и геометрического ремоделирования миокарда при одногодичном комплексном лечении пациентов с артериальной гипертензией 1 - 2 степени (рандомизированное, контролируемое проспективное исследование) [Электронный ресурс]Жаворонкова Елена Юрьевна

Гипотензивное действие 3-(3-[1,2,4-триазоло])-оксатриазолиум-5-олата: физиологический и биохимический анализ в экспериментах на крысахАртемьева, Марина Михайловна