Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Молекулярные исйроиммуноэндокрипныс механизмы опухолевого роста . 10
Глава 2. Материал и методы исследования 23
2.1. Изучение действия вилона на карциному легких Льюис у старых мышей 23
2.2 Изучение действия вилона и эпиталона па саркому М-1 у старых крыс 25
2,3. Методы исследования 28
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Глава 3. Пептидная регуляция роста, микроокружения и ангиогенеза в карциноме легких Лыоис у старых мышей 30
3.1. Изучение кинетики роста карциномы легких Лыоис 30
3.2. Светооптическое исследование карциномы легких Льюис и внутренних органов у старых мышей 39
3.2.1. Животные — опухоленосители (контрольная группа) 39
3.2.2. Действие вилона на карциному легких Лыоис у старых мышей 57
3.2.3. Действие циклофосфана на карциному легких Льюис у старых мышей 60
3.2.4. Сочетанное действие вилона и циклофосфана на карциному легких Льюис у старых мышей 62
Глава 4. Пептидная регуляция роста, микроокружения и ангиогенеза в саркоме М-1 у старых крыс .66
4.1. Изучение кинетики роста саркомы М-1 66
4.2. Светооптическое исследование саркомы М-1 у старых крыс .72
4.2.1. Интактиые животные 72
4.2.2. Действие эпиталона на саркому М-1 у старых крыс 80
4.2.3. Действие ионизирующей радиации 85
4.2.4. Действие радиации и эпиталона 90
4.2.5. Действие вилона на кинетику роста, ангиогенсз и микроокружение саркомы М-1 у старых крыс 92
Заключение .95
Выводы 104
Указатель литературы 106
- Изучение действия вилона на карциному легких Льюис у старых мышей
- Изучение кинетики роста карциномы легких Лыоис
- Действие вилона на карциному легких Лыоис у старых мышей
- Действие эпиталона на саркому М-1 у старых крыс
Введение к работе
Актуальность работы
В связи с увеличением средней продолжительности жизни и доли пожилых людей в общей численности населения, особое внимание уделяется исследованиям механизмов развития возрастной патологии, в частности опухолей, и разработке новых геропротекторных препаратов.
Известно, что одной из важных особенностей злокачественных новообразований является их автономный рост, регулируемый локально продуцируемыми факторами [7, 24]. К таким аутокршшым и паракршшым регуляторам пролиферации опухолевых клеток относят «факторы микроокружения» опухолей, продуцируемые как самими опухолевыми клетками, так и клетками окружающей их стромы [30]. Продуцируемые эндотелиальными клетками, моноцитами, макрофагами, лимфоцитами и тучными клетками иптерлейкины, простагландины, регуляторные пептиды прямо или косвенно влияют на пролиферацию и индуцированную гибель опухолевых клеток.
Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о непосредственном участии клеток микроокружения опухолей в патогенезе злокачественного роста и их влиянии на чувствительность и ответ опухолевых клеток к той или иной методике лечения [26, 159]. В процессе злокачественной трансформации клеток белковые продукты аберрантной экспрессии мутантных генов потенциально иммупогснны и могут служить в качестве антигенов отторжения. Однако, несмотря на то, что опухолевые клетки несут антигены, способные активировать цитотоксические Т-лимфоциты и вызывать образование антител, многие опухоли способны избегать механизмов иммунного надзора и не разрушаться факторами иммунной системы. Помимо множественных механизмов «ухода» от иммунных факторов, существуют механизмы защиты опухолевых клеток, основанные на индукции иммуносупрессии [171]. Расшифровка и молекулярный анализ механизмов, лежащих в основе ухода опухолей от иммунного надзора, приведет к развитию новых стратегий для предотвращения у онкологических больных Т-клеточной иммуносупрессии, развитию новых иммунотерапевтических мероприятий, способных предотвращать прогрессию злокачественных новообразований и их развитие.
Одним из перспективных направлений терапевтических мероприятий в онкологии является применение биомодуляторов, повышающих иммунную защиту
организма и усиливающих эффект противоопухолевых химиопрепаратов [111-113]. Перспективными синтетическими пептидами, обладающими имму ном одул ирующими свойствами и оказывающими влияние иа клеточный и гуморальный иммунитет, неспецифическую резистентность организма, являются вилон (Lys-Glu) и эпиталоп (Ala-Glu-Asp-Gly), полученные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМП [10]. Исследование онкомодифицирующих свойств вилона и эпиталоиа, их влияния на ангиогенез и микроокружепие экспериментально индуцированных опухолей позволит более глубоко понять механизмы действия пептидов как биологических модификаторов, способных активировать эндогенные противоопухолевые защитные механизмы.
Цель и задачи исследования
Целью исследования явилось изучение онкомодифицирующих свойств вилона и эпиталоиа, их влияния на ангиогенез и микроокружение экспериментально индуцированных опухолей у старых крыс.
Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
изучить действие вилона на продолжительность жизни старых мышей -опухолеиосителей эпителиоидной опухоли - карциномы легких Льюис (КЛЛ);
определить способность вилона влиять на пролиферативную активность опухолевых клеток и уровень апоптоза в КЛЛ;
оценить эффекты действия вилона на КЛЛ при сочетанном применении с цнклофосфаном;
изучить эффекты вилона при иммуносупрессорном действии опухоли на организм старых мышей;
исследовать влияние вилона и эпиталоиа на рост солидной соединительнотканной опухоли - саркомы М-1 у старых крыс и их онкомодифицирующее действие в условиях нарушенного ангиогенеза и пострадиационной гипоксии.
Научная новизна
В работе впервые получены новые данные о пролиферотропных и онкомодифицирующих свойствах синтетических пептидов - вилона и эпиталоиа, их
влиянии на микроокружение экспериментально индуцированных опухолей и на продолжительность жизни старых животных - опухоленосителей. Установлены молекулярно-клеточные механизмы действия пептидов на пролиферацию эндотелиальных клеток, функциональное состояние иммунокомпетентных клеток и ангиогенез.
Практическая ценность работы
Полученные данные об ингибировании роста экспериментальных опухолей под действием пептидов, снижении иммуносупрессорного действия опухоли на организм под их влиянием, коррекции вилоном тимусзавнсимого иммунодефицита создают основу для дальнейшего изучения синтетических коротких пептидов, как естественных оикомодифицирующих факторов и разработки новых методов биотсрапии опухолей в пожилом и старческом возрасте.
Основные положении, выносимые на защиту
Синтетический пептид вилон оказывает онкомодифицирующее действие на рост эпителиоидной опухоли - карциномы легких Льюис у старых мышей, при этом эффективность его действия на опухоль зависит от дозы и продолжительности применения,
Выявленное снижение иммуносупрессорного действия опухоли на организм старых животных и коррекция вилоном тимусзавнсимого иммунодефицита создают основу для изучения его применения в качестве стимулятора иммунной системы при лечении у онкологических больных пожилого и старческого возраста иммунных нарушений, в том числе и в реабилитационный период после химиотерапии.
При сочетай ном применении вил она и циклофосфана тормозящее действие циклофосфана на рост опухолей менее выражено, чем при его изолированном применении и сопровождается повышением пролиферативной активности клеток нормальных тканей, что предполагает нецелесообразность одновременного применения вилона и цитостатических препаратов.
Действие вилона на рост саркомы М-1 у старых животных зависит от вводимой дозы и стадии развития опухоли. Объективно регистрируемый
эффект иигибирования роста опухоли проявляется лишь после введения вилона в достаточно малых дозах в латентном периоде формирования новообразования. Инъекции вилона в аналогичных дозах в период активной фазы роста опухоли практически не влияют па ее кинетические параметры. Увеличение разовой дозы исследуемого препарата до 5,0 мкг может сопровождаться как усилением, так и инвертированием ингибирующего действия.
Синтетический пептид эпиталон достоверно замедляет рост солидной соединительнотканной опухоли - саркомы М-1 у старых крыс. По механизму действия исследованный препарат можно отнести к классу модификаторов биологических реакций, при этом эффект его действия реализуется через сосудистое русло опухолей.
Полученные данные свидетельствуют об актуальности дальнейших исследований по изучению синтетических коротких пептидов как естественных биологических модификаторов опухолевого роста в пожилом и старческом возрасте.
Апробация и реализация диссертации
Материалы диссертации доложены на конференции Белорусской Академии Наук, (Минск, 2003), на конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), 2-ом съезде геронтологов России (Москва, 2003), Международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2003).
Результаты диссертации используются в научной, клинической и педагогической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Минздрава РФ, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования Минздрава РФ.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Связь с научно-исследовательской работой Института
Диссертация выполнена по основному плану научно-исследовательских работ Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и указателя литературы. Глава I (обзор литературы) представляет собой анализ современного состояния проблемы биорегуляции злокачественного роста, роли регуляторних пептидов в онкогенсзе и коррекции иммунного статуса при опухолевом процессе. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, примененных в данном исследовании. Главы 3 и 4 являются изложением полученных экспериментальных данных и их обсуждением.
Текст диссертации изложен па 119 страницах, иллюстрирован 21 рисунком, 3 таблицами. Список литературы содержит 175 работ, из них отечественных - 26, иностранных- 149.
Изучение действия вилона на карциному легких Льюис у старых мышей
1-я серия экспериментов выполнена на 80 самцах мышей линии C57BI/6 в возрасте 16-18 месяцев. Животные содержались в условиях вивария МРНЦ РАМН при естественном освещении и сбалансированном рационе питания в весенний период времени. В эксперименте были сформированы 6 групп животных (см. далее). Исследование препарата проведены на 5 опытных группах животных с имплантированными опухолями.
За неделю до начала эксперимента проведена обработка кожи бедра мышей депиляпионным кремом. Данная обработка не вызывает повреждений кожи, а отсутствие волосяного покрова в течение последующих 2-3-х недель способствует более точному измерению размеров опухолей.
В качестве объекта исследования использовали перевиваемый штамм эпитслиоидной опухоли - карциному легких Льюис (КЛЛ), представляющую удобную модель злокачественного роста для проведения экспериментальных исследований. По данным литературы, КЛЛ обладает высокой прививаемостью и скоростью роста, самопроизвольное рассасывание наблюдается редко. Продолжительность жизни линейных мышей с трансплантированной опухолью составляет 3-4 недели. Кинетические параметры, биологические характеристики и морфологический фенотип КЛЛ хорошо изучены [32, 52,70,71,76,123, 146,148, 169].
Опухоль, взятую от животного - донора, освобождали от соединительной ткани и очагов некроза, промывали стерильным раствором Хенкса и измельчали в специальном гомогенизаторе, продавливая через металлическое сито. К полученному гомогелату добавляли раствор Хенкса (1:5) и 50 ЕД пенициллина, Суспензию опухолевых клеток вводили подкожно в правую заднюю конечность мышей инсулиновым шприцем по 50 мкл из расчета 105 клеток на одну инокуляцию.
Чтобы обеспечить однородность опухолевого штамма в исследуемых группах материал от одной опухоли был введен 80 животным. Методом случайного отбора животных с имплантированной карциномой распределили на 5 групп. Опытные группы включали:
1-я группа - животные - опухоленосители, не подвергающиеся воздействиям препаратов;
2-я группа- введение вил она животным на 8-17 сутки роста опухолей в разовой дозе 2 мкг/мышь (0,1 мг/кг) - 10 инъекций через сутки с курсовой дозой 20 мкг препарата на мышь (1 мг/кг массы тела);
3- я группа - введение вилона животным на 8-17 сутки роста опухолей в разовой дозе 100 мкг/мышь (5,0 мг/кг) — 10 инъекций через сутки с курсовой дозой 1,0 мг препарата на мышь (50 мг/кг массы тела);
4-я группа - введение животным опухоленосителям циклофосфана курсовой дозой 100 мг/кг. Производили три введения циклофосфана в разовой дозе 0,67 мг/мышь: первое на 8 день после перевивки опухолей, второе на 13-е и третье па 17-е сутки роста КЛЛ;
5-я группа - введение вилона по схеме 3-й группы и циклофосфана по схеме 4-й группы.
Вилон и циклофосфан вводили внутрибрюшинно отдельными инсулиновыми шприцами.
Размеры опухолей на месте прививки определяли 2-3 раза в неделю и рассчитывали их объем по формуле эллипсоида: V = 4/Зя(Ь/2)- (D/2)2 [мм3], где L - длина опухоли; D = (Di + D2)/2, a Di и D2 - 2 других взаимно перпендикулярных диаметра (мм).
По динамике и дивергенции линий роста опухолей в испытуемых группах был определен контрольный срок для гистологического изучения карциномы. На 18-е сутки роста опухолей (10-е сутки от начала курсового лечения препаратами; 24 часа после последней инъекции препаратов в опытных группах) в каждой группе было отобрано по 5 мышей с объемами опухолей в диапазоне М ± а. Эвтаназию мышей осуществляли путем дислокации спинного мозга. В контрольной группе для гистологических исследований выделяли кусочки мягких тканей правой задней лапы мышей (зона имплантации опухолей в опытных группах), тимус и желудок. В опытных группах исследования выполнены на ткани опухоли с прилегающей кожей, тимусе и желудке.
Ткань карциномы вырезали в виде пластинок толщиной 3-4 мм, ориентированных вдоль длинной оси опухолевого узла. Кусочки опухоли и выделенные органы фиксировали в течение 24 ч кислой жидкостью Буэна для светомикроскопических исследований и по Карновскому для электронной микроскопии. Обезвоженный материал заливали, соответственно, в очищенный гомогенизированный парафин для гистологических исследований и смесь эпонов (Epoxy-Einbettimgsmittcl-Kit, SMT Geraetehandel GmbH, Германия) для электронной микроскопии.
Парафиновые срезы толщиной 7 мкм помешали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-Ь-лизина (Sigma).
Изучение кинетики роста карциномы легких Лыоис
Первую группу составили животные - опухоленосители без воздействия препаратов. Опухолевые узелки у них появляются под кожей бедра на 4 - 6 сутки после имплантации опухолевых клеток. Опухоли привились у всех животных первой группы и к 8-м суткам достигли размеров, позволяющих проводить достаточно точные измерения. Самопроизвольного рассасывания привившейся карциномы не зарегистрировано. В интервале 8-х - 18-х суток большинство опухолей растет в достаточно узком диапазоне варьирования (рис. 1,а). Наиболее интенсивный рост наблюдается до 20-х суток (рис. 1,6), а кривая роста отображается степенной зависимостью (рис. 1 ,в) по формуле: V(t) = Vo х t", где а - коэффициент, определяющий скорость роста опухолей.
В процессе роста время удвоения объема опухолей постепенно увеличивается от 2-х до 4-х суток. Считается, что замедление темпа роста отражает относительное снижение объемной фракции, занимаемой активно размножающимися опухолевыми клетками в паренхиме новообразований.
В контрольном интервале времени прирост массы опухолей по средней геометрической (G (8-18)) составил 289 ± 29,5 мм3 (табл. 1).
Первые животные в этой группе погибли на 21 сутки, последние — на 24. Средняя продолжительность жизни мышей после имплантации опухолей — 23,0 ± 0,5 суток.
По данным сравнительного анализа существенных изменений в динамике роста опухолей после инъекций вилона в разовых дозах 2 мкг/мышь не отмечено {рис. 2). Прирост массы опухолей и коэффициент а по уравнению степенной зависимости в контрольном интервале времени увеличились незначительно относительно контрольной группы (Ри [2,1] 0,05). Однако средняя продолжительность жизни животных в этой группе возросла на 13% и составила 26,0 ± 0,7 суток (Ри [2,1] 0,05).
В начальном интервале времени диапазон варьирования и кривые роста опухолей, построенные по средним значениям, в третьей и контрольной группе практически совпадают (рис. 3). Явных отклонений параметров роста отдельных опухолей от средних значений не выявлено. Однако после пятой инъекции вилона на 13-е сутки появляется отчетливая дивергенция между кривыми роста в опыте и контроле, а в последующий период линия роста новообразований в третьей группе располагается выше (рис.4). Прирост массы опухолей по средней геометрической увеличился относительно первой группы на 33,5% (Pj,i 0,05), а коэффициент а - на 11% (таблица 1).
Средняя продолжительность жизни животных в третьей группе снизилась до уровня контрольной группы опухоленосителей. Индивидуальный рост опухолей после введения циклофосфана показан на рис. 5а. У большинства животных эффект торможения роста начинает проявляться уже после первой инъекции цитостатика. Однако у 3-х мышей замедление прироста массы новообразований зарегистрировано лишь через 3-е суток. По данным сравнительного анализа, на этапе наблюдений между 13-ми - 27-ми сутками отмечается наиболее выраженное торможение роста первичных опухолевых узлов (рис. 6). В контрольном интервале прирост массы привившихся опухолей на 25% ниже, чем в контроле (G g.ig = 219 ± 33; P4,i 0,05). Козффициеігг а, определяющий кинетику роста по степенной зависимости, снижается до 1,8. Средняя продолжительность жизни животных увеличилась на 15% относительно первой группы опухоленосителей и составила 26,4 ± 0,8 суток. 38
Индивидуальный рост опухолей после сочетапного воздействия препаратов показан на рис. 5. Обращает внимание своеобразная «синхронизация» ответа опухолей на циклофосфан в этой группе. Практически у всех животных регистрируется снижение скорости роста имплантированных новообразований в раннем периоде совместного применения вилона и циклофосфана, что подтверждается и тенденцией к снижению прироста массы опухолей (G g.ig = 189 ± 23). До 20-х суток диапазон варьирования и кривые роста, построенные по средним значениям, для пятой и четвертой группы в основном, совпадают. Мало отличаются и количественные данные, полученные по уравнениям линий тренда, (рис. 5,в). Однако в последующий период времени при сочетай ном применении вилона и циклофосфана наблюдается очевидное ускорение роста новообразований.
Средняя продолжительность жизни животных после сочетапного применения вилона и цитостатика снизилась до 21 суток (P[T]j,4 0,05). Таким образом, результаты кинетических исследований свидетельствуют, что синтетический дипептид вилочковой железы «вилон» оказывает неоднозначное действие на рост имплантированной эпителиоидной опухоли. Онкомодулирующее действие этого препарата зависит от дозы и продолжительности его применения. Введение вилона в разовых дозах 0,1 мг/кг в период активной фазы роста карциномы легких Льюис практически не влияет на ее кинетические параметры, но достоверно увеличивает продолжительность жизни опухоленосителей. Увеличение разовых доз исследуемого препарата до 5,0 мг/кг сопровождается активизацией темпа роста опухолей.
При сочетанном действии вилона и циклофосфана, в раннем периоде комбинированного лечения проявляется синхронизация ответа опухолей на тормозящее действие цитостатика с последующим ускорением скорости роста новообразований и снижением продолжительности жизни животных.
Действие вилона на карциному легких Лыоис у старых мышей
При изучении препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, особых изменений в гистологическом строении карциномы легких Льюис у животных второй опытной группы не выявлено. На ультратопких срезах организация стромы, сосудов и паренхимы карциномы в зонах инвазивного роста и солидной организации, в целом, также соответствует вариантам первой группы. Обращает лишь внимание некоторая концентрация опухолевых клеток вокруг кровеносных сосудов, и усиление в этих местах интенсивности иммуноокрашивания ядер пролиферирующих клеток на PCNA. Результаты гистохимических и иммуногистохимический исследований практически полностью совпадают с данными по первой группе. В периферической зоне паренхимы количественная плотность опухолевых клеток во второй группе составляет 5033 ± 220 на 1 мм . Пролиферативная активность по PCNA незначительно повышается (IPCNA = 49,8+ 1,1%), но по индексу митозов остается на уровне первой группы (Ім 2,1 ± 0,1%). По данным компьютерного анализа, апоптотичсская гибель опухолевых клеток во 2 группе практически не изменилась (Іалопт = 0,9 ±0,1).
У мышей этой группы гипоплазия тимуса выражена менее интенсивно, чем у опухоленосителей в первой группе. Гистоструктура органа относительно нормализуется. Большое количество митозов выявляется не только в субкапсулярной зоне, но и по всей территории коркового вещества. Усиливается иммупоокрашивание ядер пролиферирующих тимоцитов на PCNA. Количественная плотность тимоцитов в корковой зоне увеличивается до 44910 ± 2087, в мозговом веществе составляет 31582 ± 2444 клеток на 1 мм2. В корковом веществе индекс PCNA возрастает на 2,1%, в мозговом веществе остается па уровне первой группы. В отличие от животных первой группы, деструктивные изменения в слизистой оболочке желудка выражены в меньшей степени. Инфицирование микроорганизмами носит, как правило, очаговый характер. В покровном эпителии и обкладочных клетках дистрофические изменения имеют локальный характер и топографически соответствуют местам инвазии желудочной флоры. Отечность подслизистой и мышечной оболочек менее выражена. В зонах лейкоцитарных инфильтратов в подслизистой оболочке и собственной пластинке слизистой появляются скопления лимфоцитов и плазматических клеток.
Обращает на себя внимание хорошая сохранность нейронов межмышечных ганглиев. Они имеют крупные базофильные ядра с выраженным ядрышком. Признаки отека ганглиев практически отсутствуют, а цитоплазма большинства нейронов имеет выраженную базофилию.
Гистологический анализ свидетельствует, что после введения вилона в дозе 1 мг/кг происходит активизация функциональной активности практически всех типов клеток покровного эпителия. По-видимому, усиливаются процессы пролиферации в герминативных зонах слизистой оболочки, а на дне желудочных ямок отмечается накопление молодых клеточных форм, переходящих в покровный эпителий. Усиливается эозинофилия цитоплазмы и базофилия ядер обкладочных клеток, что косвенно свидетельствует об усилении внутриклеточных процессов, связанных с синтезом соляной кислоты. Следует отметить, что особенно выражена активизация главных клеток желудочных желез. Их размеры увеличиваются, цитоплазма содержит хорошо выявляемую базофильную зернистость, а просвет желез, выполненных главными клетками, практически не просматривается. В некоторых зонах слизистой оболочки тела желудка распространенность главных клеток достигает середины желудочных желез.
В периферической зоне опухоли при действии вилона в курсовой дозе 50 мг/кг (3-я опытная группа) определяются гистологические признаки активизации опухолевого роста. У большинства животных этой группы опухоли прорастают дерму, а зоны инвазии достигают эпидермиса. Обращают внимание высокая плотность заполнения периферических отделов паренхимы опухолевыми клетками и многочисленные фигуры митоза. Концентрирующиеся вокруг сосудов клетки карциномы образуют плотно упакованные агрегаты. Судя по ультраструктуре митохондрий (нет выраженных признаков отека и деструкции крист), после введений вилона в больших дозах опухолевые клетки не испытывают недостаток в кислороде. Клеточный состав микроокружения включает мопоциты,а также активированные макрофаги, утилизирующие погибшие клетки, и тучные клетки с характерными электронно-плотными гранулами.
На электронно-микроскопическом уровне регистрируется активизация функциональной активности эндотелия сосудов в опухоли.
Известно, что морфологическими показателями уровня обменных процессов в эндотелии является поверхность внутреннего контура сосудов. По нашим наблюдениям, просвет синусоидов в зоне роста карциномы очень неровный и в зоне их расширения цитоплазма эндотелиальных клеток образует многочисленные выросты и микроворсинки разной величины и формы.
На препаратах, иммуноокрашенных на PCNA, определяется усиление концентрации пролифериругощих клеток вокруг сосудов. Как и в предыдущих группах, в паренхиме карциномы визуализируются немногочисленные клетки, погибающие по механизму апоптоза.
По данным компьютерного анализа, плотность заполнения паренхимы опухолевыми клетками достигает 5225 ± 408, количественная плотность PCNA-позитивных ядер достоверно увеличивается до 2714 ± 68 (р 0,05), а индекс PCNA - до 53,5 ± 5,5. Индексы митоза и апоптоза, объемная плотность иммуноглобулинов, а также содержание тучных клеток остаются на уровне второй группы. Определяется тенденция к уменьшению размеров зон ядрышковых организаторов, что косвенно свидетельствует о снижении физиологической нагрузки, обусловленной недостатком оксигенации опухолевых клеток.
Гистологические признаки гипоплазии тимуса сохраняются. Однако в субкапсулярной зоне появляются крупные незрелые лимфобласты, а в средней зоне коркового вещества лимфоциты концентрируются в виде характерных скоплений. Корковое и мозговое вещество довольно густо заполнено ретикулоэпителиальными клетками. В центральных отделах долек часто наблюдаются группы морфологически активизированных эпителиальных клеток с глыбчатым распределением хроматина в ядрах и базофильной цитоплазмой.
При иммуноокрашивании на PCNA, ядра пролиферируюншх клеток распределены зонально. Их большая часть сконцентрирована по периферии коркового вещества и в зоне кортико-медуллярного сочленения. По данным количественного анализа, пролиферативный показатель по ядерному антигену в корковом веществе увеличивается до 27,6 ± 3,5 (ри 3,1 0,05), а в мозговом веществе остается на уровне предыдущей группы.
Гистологически определяется снижение признаков высокой функциональной активности главных и обкладочных клеток тела желудка, характерных для предьщущей группы, и усиление пролиферативной активности покровного эпителия. Некоторые клетки находятся в состоянии деструкции. В отдельных участках слизистая оболочка фундального отдела истончена за счет уменьшения размеров клеток и их частичной гибели. В области перешейка желез как в фундальном, так и пилорическом отделе выявляются многочисленные делящиеся клетки. Слизистые клетки дна пилорических желез увеличены за счет накопления в них слизи, а просветы желез в этих местах расширены. Как и в предыдущей группе, деструктивных изменений в слизистой оболочке, вызванных патогенной флорой, немного. Инфицирование микроорганизмами носит очаговый характер. Практически по всем иммуногистохимическим и морфометрическим показателям данные по эндокринным клеткам в желудке у животных второй и третьей группы совпадают Результаты регрессионного анализа показали, что после введения опухоленосителям вилона в дозе 50 мг/кг реципрокпые отношения между ЕС и G клетками восстанавливаются.
Действие эпиталона на саркому М-1 у старых крыс
Микроскопически в опухолях этой группы обнаружено появление в периферических зонах обширных, протяженных очагов некроза с вовлечением сосудов. В этих зонах пролиферирующие клетки сохранялись в виде «опухолевых манжеток», а оставшаяся часть паренхимы была представлена полями недавно погибших клеток с пикнотичными ядрами. В двух случаях гистологический рисунок опухолей в целом мало отличался от контроля. Однако в подкапсульной зоне крупные сосуды расширены, а в капиллярах видны признаки стаза крови. Кроме этого, в качестве характерного признака опухолей в этой группе можно отметить появление вокруг сосудов многочисленных клеток, окрашивающихся толуидиновым синим. В отдельных участках их количественная плотность достигала 90 на 1 мм2 площади паренхимы опухоли. Клетки дали отчетливую позитивную иммуногистохимическую реакцию па серотонин. При использовании метода серийных полутонких - ультратонких срезов эти серотонинпозитивные клетки были идентифицированы как тучные клетки. По своим ультраструктурным и иммуногистохимическим характеристикам идентифицированный нами тип клеток фенотипически отличается от тучных клеток, концентрирующихся по периферии опухолей, и больше соответствует интраэпителиальным тучным клеткам желудочно-кишечного тракта. Детальное электронно-микроскопическое исследование показало, что после пролонгированного введения эпиталона основные события развертываются в периваскулярпой строме. Судя по увеличению содержания коллагеновых волокон, активизировалась деятельность фибробластов. В подкапсульных участках опухолей обнаружены многочисленные моноциты, являющиеся, как известно, предшественниками макрофагов, и наряду с естественными киллерами, активированными Т-лимфоцитами и тучными клетками, обладающие противоопухолевой цитотоксичностыо [65, 72].
При иммуноокрашивании препаратов на ламинин особых изменений в его экспрессии и характере контурирования стенок сосудов не обнаружено. Однако, обращало на себя внимание появление в периваскулярном пространстве бесклеточных участков в виде своеобразных «зон отчуждения». На электроннограммах эти участки были представлены в виде скопления прозрачных вакуолей, отделяющих базальную мембрану эндотелия от прилегающих к сосудам опухолевых клеток, в цитоплазме которых появляются признаки ультраструктурной патологии, характерные для клеток, испытывающих недостаток в кислороде: уплотняется цитоплазма, усиливается гетерогенность строения внутриклеточных органелл, развивается субтотальное набухание и отек митохондрий
При изучении гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, обращает также внимание появление в периферических зонах опухолей обширных протяженных зон некроза с вовлечением сосудов. Сосуды синусоидного типа паретически расширены и заполнены стазированными эритроцитами. Основная масса пролиферирующих опухолевых клеток сохраняется в виде характерных «опухолевых манжеток». Большая часть паренхимы представлена полями недавно погибших клеток с пикнотичными ядрами.
Второй характерной чертой этих препаратов является появление вокруг сосудов многочисленных клеток, окрашивающихся толуидииовым синим. В отдельных участках их количественная плотность достигает 90 на I мм2 площади паренхимы опухоли. Клетки дают позитивную имму но гистохимическую реакцию на серотонин. Кроме того, интенсивное иммуноокрашивание на серотонин дает также кровь, сохранившаяся в сосудистом русле. При использовании метода серийных полутонких -ультратонких срезов эти клеточные элементы были идентифицированы как тучные клетки. По-видимому, неслучайно в последние годы обращается особо пристальное внимание на роль этих клеток в патогенезе опухолевого роста.
В норме тучные клетки являются одним из постоянных компонентов соединительной ткани. Известно, что их предшественники образуются в костном мозге, мигрируют через кровоток и дифференцируются в зрелые ТК под контролем локальных факторов микроокружения, в том числе, лимфокинов сенсибилизированныхлимфоцитов [48]. В гранулах тучных клеток содержатся сульфатиро ванные протеогликаны, различные медиаторы, включая пептиды, гистамии, серотонин (у грызунов) и др. Кроме того, в ТК выявлен целый спектр мультифункциональных цитокинов (в том числе туморонекротический фактор), которые принимают непосредственное участие в регуляции ряда физиологических, иммунологических и патологических функций. Противоопухолевая активность мастоцитов проявляется в их непосредственном киллериом действии [154].
По своим ультраструктурным и иммуногистохимическим характеристикам идентифицированный тип клеток фенотипически отличается от тучных клеток, концентрирующихся по периферии опухолей, и больше соответствует интраэпителиальиым тучным клеткам желудочно-кишечного тракта. Подобный тип тучных клеток в коже мышей был описан при изучении механизмов экспериментального канцерогенеза [62], Поэтому мы обозначили их как тучные клетки интратуморалыюго типа.
Тщательное электронно-микроскопическое исследование показало, что после пролонгированного введения эпиталона основные события развертываются в периваскулярной строме. Судя по увеличению содержания коллагеновых волокон, активизируется деятельность фибробластов. Появляются многочисленные моноциты, являющиеся, как известно, предшественниками макрофагов, и наряду с естественными киллерами, активированными Т-лимфоцитами и тучными клетками, обладающие противоопухолевой цитотоксичностью.
В сохранившихся участках паренхимы количественная плотность опухолевых клеток определяется на уровне 4200 на 1 ммг, а их пролиферативная активность остается столь же высокой, как и в контрольной группе; Ірскл = 74,5 ± 2,7%; \мт 1,9 ± 0,11; Вместе с тем, по данным компьютерного анализа, апоптозная гибель увеличивается практически в 2 раза: 1ап0гтт = 0.67 ± 0,13. На препаратах, импрегнированных в растворе нитрат серебра - метенамин, хорошо видно, что клетки с конденсирующимся хроматином поодиночке и в виде небольших групп достаточно равномерно распределены среди жизнеспособных, интенсивно пролифериругощих опухолевых клеток.
Возвращаясь к вопросу об индуцированной гибели клеток, следует отметить, что по современным представлениям, апоптозу отводится ведущее место в поддержании клеточного баланса как в физиологических условиях, так и при действии разных токсических стимулов. Есть данные, что при противоопухолевой терапии апоптоз может выступать как один из ведущих патогенетических факторов, определяющих либо рост, либо регрессию злокачественных новообразований [24. 102, 117, 170] Достаточно хорошо изучены факторы, присутствие или отсутствие которых инициирует запуск генетически запрограммированной смерти клеток [170, 171]. К числу таких факторов относится и гипоксия. Однако в данном случае объяснить увеличение апоптозной гибели опухолевых клеток только за счет нарастающей гипоксии, по-видимому, нельзя. Количественный подсчет пролиферативной активности и апоптозной гибели клеток проводился на смежных полях серийных гистологических срезов. Между тем существуют веские иммулогистохимические доказательства, что в зонах гипоксии нролиферативный потенциал опухолевых клеток снижается. Иммуноокрашивание ядер клеток на PCNA в зоне локализации маркера гипоксии СС1-103F проявляется слабее, либо эти поля не перекрываются. Количественный анализ свидетельствует об отрицательной корреляционной связи между связыванием гипоксического маркера пимонидазола и иммунолокализацией PCNA [106]. Если бы зарегистрированное нами увеличение апоптозного индекса было обусловлено только гипоксией, то и пролиферативная активность клеток саркомы должна была снизиться. Поэтому, на наш взгляд, апоптоз, индуцированный после введения эпиталона, обусловлен активизацией клеток, обладающих прямым цитотоксическим действием -тучных клеток интратуморального типа и моноцитов.
![Клинико-патогенетическое значение фактора некроаз опухоли-[А], интерлейкина-6 и трансформирующего фактора роста-[В]1 при хроническом гепатите С](/i/i/4301/291158.png "Клинико-патогенетическое значение фактора некроаз опухоли-[А], интерлейкина-6 и трансформирующего фактора роста-[В]1 при хроническом гепатите С Широнина Наталья Леонидовна")
