Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Использование биотехнологических методов в селекции плодово-ягодных растений 9
1.1. Клональное микроразмножение растений in vitro 9
1.2. Регенерация плодово-ягодных растений в культуре in vitro 19
1.3. Генотипическая и фенотипическая стабильность растений полученных in vitro 29
1.4. Хранение тканей и органов растений в культуре in vitro 35
ГЛАВА II. Цель, задачи, объекты, методика и условия исследований 40
2.1. Цель и задачи исследований 40
2.2. Место проведения и объекты исследований 40
2.3. Методика исследований 45
2.4. Климатические и почвенно-агротехнические условия проведения исследований 49
ГЛАВА III. Результаты исследования 53
3.1. Введение новых генотипов ремонтантной малины в культуру in vitro 53
3.1.1. Изучение возможности использования почек изолированных от побегов замещения при введении в культуру in vitro 53
3.1.2. Влияние размера экспланта на результат введения межвидовых ремонтантных форм малины в культуру in vitro 58
3.1.3. Влияние месторасположения почек на однолетних побегах замещения ремонтантной малины на жизнеспособность и развитие эксплантов 61
3.1.4. Оптимизация состава питательной среды при осеннем введении в культуру in vitro 64
3.1.5. Генотипические особенности ремонтантной малины при введении в культуру in vitro 66
3.1.6. Влияние интенсивности на приживаемость эксплантов ремонтантной малины на этапе адаптации к среде с БАП 69
3.2. Размножение новых ремонтантных форм малины в культуре in vitro 72
3.3. Укоренение и адаптация к нестерильным условиям ремонтантных форм малины размноженных в культуре in vitro 78
3.3.1. Укоренение ремонтантных форм малины in vitro 78
3.3.2. Адаптация пробирочных растений ремонтантной малины к нестерильным условиям 84
3.4. Регенерационная оценка межвидовых ремонтантных форм малины in vitro 85
3.5. Влияние регуляторов роста, осмотических ингибиторов и низкой температуры на хранение in vitro ремонтантной малины 97
3.6. Оценка размноженных in vitro растений ремонтантной малины в полевых условиях 104
3.7. Эффективность использования метода клонального микроразмножения для ускорения селекции ремонтантных форм малины 108
Выводы 110
Рекомендации производству 111
Литература 112
- Регенерация плодово-ягодных растений в культуре in vitro
- Изучение возможности использования почек изолированных от побегов замещения при введении в культуру in vitro
- Генотипические особенности ремонтантной малины при введении в культуру in vitro
- Адаптация пробирочных растений ремонтантной малины к нестерильным условиям
Введение к работе
Обнадеживающей альтернативой традиционной технологии возделывания малины является принципиально новая низкозатратная и экологически безопасная технология с использованием ремонтантных сортов, формирующих основной урожай в конце лета — начале осени на однолетних побегах. Эти сорта способны эффективно использовать благоприятные факторы внешней
ф среды и избегать экологических стрессов за счет однолетнего цикла форми-
рования урожая и особой технологии. Суть этой технологии в том, что после уборки урожая и наступления устойчивых осенних заморозков, надземную часть растений скашивают косилкой (КИР-1,5 Б) или срезают секатором. С весны следующего года отрастают новые побеги, которые во второй половине лета - начале осени плодоносят, а затем после замерзания почвы их снова скашивают. Возделывание ремонтантных сортов малины по типу однолетней культуры снимает проблему зимостойкости стеблей, а их удаление с плантации после скашивания позволяет избавиться от основных болезней и вредителей без применения пестицидов. Использование в производстве сортов ремонтантного типа с неполегающими под тяжестью урожая стеблями создает возможность максимальной механизации по уходу за насаждениями, вклю-
ф чая машинную уборку урожая. При этом отпадает необходимость в устрой-
стве дорогостоящей шпалеры, подвязке стеблей к проволоке и их поштучной вырезке после плодоношения (И.В. Казаков, 2000).
Выращивание сортов ремонтантного типа, наряду с обычными сортами дает возможность создать в условиях средней полосы России конвейер поступления свежих ягод малины в течение 2,5-3 месяцев, начиная с конца июня и
* до наступления осенних заморозков. При этом реализация ягодной продук-
ции ремонтантных сортов в «несезонное» для малины время по более высоким, чем летом ценам стимулирует расширение насаждений малины во всех категориях хозяйств (И.В. Казаков, 2000).
На Кокинском опорном пункте ВСТИСП (Брянская область) с начала 70-х годов прошлого века ведется интенсивная работа по созданию ремонтантных сортов малины, формирующих основной урожай в конце лета — начале осени на однолетних побегах.
Актуальной проблемой при создании таких сортов является оптимизация селекционного процесса. Ряд ремонтантных сортообразцов малины сложного межвидового происхождения отличается низкими коэффициентами размножения, а отдельные из них вовсе не образуют корневой поросли (И.В. Казаков, 2001). Эта биологическая особенность затрудняет размножение таких генотипов традиционными способами и, таким образом, значительно удлиняет период от выделения гибридов в элиту до передачи в сортоиспытание. Кроме того, ограничивается объем скрещиваний при использовании их в качестве родительских форм. Эти препятствия в значительной мере можно преодолеть путем использования метода клонального микроразмножения (В.В. Вовк, 2000). Данная работа является продолжением исследований по оптимизации клонального микроразмножения новых межвидовых ремонтантных форм малины для ускорения селекционного процесса.
Для межвидовых ремонтантных форм малины остаются неизученными вопросы регенерации из листовых эксплантов, что представляет определенный интерес для получения генетического разнообразия форм с использованием клеточной селекции, генетической инженерии и других биотехнологических методов.
В настоящее время в лаборатории биотехнологии БГСХА накоплено в пробирочной культуре около 100 селекционно-ценных генотипов ремонтантной малины, которые нуждаются в совершенствовании методологических подходов для выяснения наиболее эффективных способов их длительного хранения in vitro.
Крайне мало информации о поведении размноженных в культуре in vitro растений малины в полевых условиях и практически отсутствуют такие сведения о ремонтантных сортах межвидового происхождения.
7
Решение затронутых выше проблем является актуальным и имеет важ
ное теоретическое и практическое значение для ускорения селекции ремен
ів тантной малины.
Научная новизна. В результате проведенной работы показана возмож
ность осеннего введения в культуру in vitro межвидовых ремонтантных сор
тов и форм малины с использованием в качестве источника экспланта фраг
ментов почек, изолированных от побегов замещения. Изучены факторы,
ф влияющие на приживаемость и регенерационную способность эксплантов.
Изучено поведение в культуре in vitro новых ремонтантных гибридов на всех этапах клонального микроразмножения с использованием различных типов регуляторов роста.
Оптимизированы условия адвентивного органогенеза из листовых эксплантов для новых генотипов ремонтантной малины и изучена их регенераті-
ционная способность.
Показано увеличение генеративной и вегетативной продуктивности у размноженных in vitro растений ремонтантных сортов малины в сравнении с растениями, полученными традиционным способом.
Реализация результатов исследований. Растения малины, полученные в
щ> лаборатории биотехнологии in vitro, использованы для закладки маточников
ремонтантных форм малины на участке Кокинского опорного пункта ВСТИСП. Всего передано для высадки в почву 4325 растений малины 41 генотипа.
В результате проведенной работы подготовлены для передачи в госсор
тоиспытание три новых сортообразца ремонтантной малины Бриллиантовая,
^ Элегантная и Надежная.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международных научно-практических конференциях: «Молодые учёные - возрож-
8 дению сельского хозяйства в XXI веке» (Брянск, 2000); «Молодые учёные — возрождению сельского хозяйства в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2001). «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии» (Брянск, 2002); V съезде общества физиологов растений России «Физиология растений — основа фитобио-технологии» (Пенза, 2003)
По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из 3 глав, выводов и рекомендаций для практической селекции, списка использованной литературы. Работа содержит 36 таблиц и 13 рисунков. Список использованной литературы включает 220 наименований, в том числе 154 на иностранных языках.
Регенерация плодово-ягодных растений в культуре in vitro
Большой прогресс, достигнутый в разработке способов генетической трансформации высших растений, открывает совершенно новые перспективы для целей практической селекции. Важнейшим ограничивающим фактором в получении трансгенных плодово-ягодных растений является проблема регенерации целых растений из трансформированных тканей (P.L. Schuerman, A.M. Dandekar, 1993). Решение проблемы регенерации трансгенных растений при Agrobacte rium — опосредованной трансформации, осложняется тем, что антибиотики, используемые для уничтожения агробактерий и как селективные агенты, также существенным образом влияют на регенерационный процесс (J.A. Fiola et al., 1990; М.А. Hassan et. al., 1993; Бурдейная, 1998). Регенерацию растений из культуры тканей можно достичь, используя один из трех методов: культуру зародышей, соматический эмбриогенез и органогенез (Б. Тиссера, 1989). Культура зародышей представляет собой стерильную культуру зиготи-ческих зародышей. Зародыш изолируют из семени или семяпочки и помещают в искусственные условия, заменяющие эндосперм (т.е. питательную среду). Последующее развитие и прорастание зародыша происходит так же, как это было бы в семени. Соматический, или неполовой, эмбриогенез представляет собой процесс формирования зародышеподобных структур из соматических клеток. Соматический зародыш - это независимая двухполюсная структура, физически не прикрепленная к ткани, из которой происходит. Такие зародыши в дальнейшем могут развиваться и прорастать в регенеранты через стадии, соответствующие тем, что встречаются при развитии зиготы. Формирование растений путем органогенеза состоит в появлении и росте побегов из каллусов или в инициации и росте побегов из пазушных почек, развивавшихся на культивируемых верхушках побегов и образовавших впоследствии адвентивные корни (Б. Тиссера, 1989). Интенсивные исследования морфогенеза растений затруднены интегральным характером морфогенетических процессов, зависимостью их от многих внутренних и внешних факторов и их взаимодействий (Р.Г. Бутенко, 1990; Р.Г. Бутенко, 1994). Среди факторов оказывающих влияние на регенерацию, генотип растения можно отнести к основным. Регенерационная способность эксплантов из однолетних растений заметно контрастирует с ростом тех же эксплантов, полученных из многолетних растений. Существенное влияние на реализацию морфогенетического потенциала оказывают сортовая и родовая специфика исходного экспланта (B.C. Шевелуха и др., 1998). Примером высокой органогенной способности у растений малины in vitro может служить сорт Скромница, частота регенерации которого составила 70-80% (Ф.Н. Хамукова, 1994). У земляники хорошей регенерацией отличался сорт Redcoat (N.S. Nehra et al., 1990a). Как правило, в дальнейшем эти сорта становятся модельными в исследованиях регенерации и трансформации данных культур (В.А. Высоцкий и др., 1998; Е.М. Крылова и др., 1999; N.S. Nehra etal., 19906). Для успеха работ по регенерации растений отбор экспланта играет первостепенную роль. Лучше всего отбирать экспланты из здоровых, сильных растений. Практически любую часть растения можно успешно культивировать in vitro и получить регенеранты, если эксплант отобран на соответствующей стадии развития (Б. Тиссера, 1989). В качестве источников экспланта для регенерации адвентивных побегов малины могут использоваться листья (J.A. Fiola et al., 1990; H.J. Swartz et al., 1990; С Owens у de Novoa & A.J. Conner, 1992), черешки (С. Cousineau & A.J. Donnelly, 1991), листовые диски и сегменты стеблей (R.J. McNicol & J. Graham, 1990), семядоли (J.A. Fiola et al., 1990; V.M. Gingas & B.D. Stokes, 1993) и зрелые зародыши (J.A. Fiola & H.J. Swartz, 1986). Разные структуры одного и того же растения проявляют неодинаковую активность к регенерации. По мере усиления специализации структур наблюдается тенденция ослабления их потенций к регенерации (А.Г. Юсуфов, 1982, с.70). У изученных растений ежевики и малины черной минимальной регене-рационной способностью обладали пыльники, максимальной — черешки и отрезки междоузлий, листья и листовые диски занимали промежуточное положение (М.Т. Упадышев, 1991). Достаточно высоким органогенным потенциалом у плодовых культур обладают изолированные семядоли (М. Kouider et al. 1985; J.A. Fiola et al., 990). Процент регенерации из листьев ( 30%) более чем в два раза уступал семядолям ( 75%) у исследованных растений рода Rubus (J.A. Fiola et al., 1990). Однако для большинства гетерозиготных культур, используемых в биотехнологических исследованиях, предпочтение должно отдаваться листь ям или другим вегетативным частям растений, которые сохраняют признаки и свойства исходного сорта. Приведенные данные о регенерационной способности разных тканей и органов нельзя абсолютизировать, так как при подборке благоприятных условий во многих случаях можно добиться успешной регенерации почти из любой части растений (Р.Г. Бутенко, 1975; Р.Г. Бутенко, 1978; G. Hussey, 1975). Подтверждением тому могут быть разработанные методики регенерации даже из единичных клеток растений — протопластов (Е.М. Patat-Ochatt al., 1988; A. Wallin and L. Johansson, 1989; M. Nyman and A. Wall in, 1988). Незрелые ткани и органы более пластичны с точки зрения способности к морфогенезу in vitro, чем зрелые ткани и органы (F. Fasolo et al., 1989; М. Welander & G. Maheswaran, 1992). Молодые листья малины, изолированные с верхушки растения, обладают большей частотой регенерации и образуют большее количество побегов на эксплант в сравнении с листовыми пла- стинками нижних ярусов (Н.И. Туровская, О.В. Стрыгина, 1992; В.A. Turk et al., 1994). С увеличением возраста используемых семядолей и незрелых заро дышей растений персика, частота образования адвентивных побегов умень шалась (S. Mante et al., 1989; F.A. Hammerschlag et al., 1985). Для яблони же предпочтительнее оказалось использовать зрелые семядоли (А.С. Rubos, PrykeJA., 1984). Регенерация адвентивных побегов проходит более успешно при исполь зовании молодых растений, т.е. культивируемых в условиях in vitro не более 4-6 недель (J.A. Stamp et al., 1990; С. Leblay et al., 1991). Иногда хорошие результаты удается получить при использовании укорененных микроразмно женных растений (DJ. James et. al., 1984; DJ. James et al., 1988). При сравнении листовых эксплантов земляники, полученных в теплице и в культуре in vitro, установлено, что выращенные in vitro экспланты обладают большей частотой регенерации (О.Р. Jones et al., 1988; Z.R. Liu and J.C. Sanford, 1988). Противоположные результаты, полученные на землянике сорта Redcoat, объясняются авторами гормональным дисбалансом растений, культивируемых in vitro, связанным с накоплением цитокининов в тканях листа (N.S. Nehra et al., 1990).
Изучение возможности использования почек изолированных от побегов замещения при введении в культуру in vitro
Полевые исследования проводились в 2001 - 2002 годах на селекционном участке Кокинского опорного пункта ВСТИСП, работающего на базе учебно-опытного хозяйства «Кокино» Брянской госсельхозакадемии.
Брянская область находится в центральной части Нечерноземной зоны и занимает южную окраину центрального подзолистого региона. Климат умеренно-континентальный, с умеренно-тёплым летом и холодной зимой. Согласно многолетним данным Брянской метеостанции среднегодовая температура воздуха в северо-восточных и юго-восточных районах колеблется в пределах 4,7—5,9С. Абсолютный многолетний максимум температуры воздуха достигает 36-39С, а абсолютный минимум — 36-42С. Однако, такие высокие и низкие температуры наблюдаются крайне редко, менее, чем 5 раз в столетие. Общая продолжительность теплого периода с положительной среднесуточной температурой воздуха составляет 220-230 дней в году, без 50 морозный период длится 130-150 дней (первая половина мая — конец сентября), средняя температура января -8,5С. Дата первого возможного заморозка приходится на 15 сентября. Среднее значение суммы активных температур (+10С и выше) находится в пределах 2001-2300С. Гидротермический коэффициент, характеризующий температурный и водный режим периода активной вегетации, составляет 1,5. Коэффициент увлажнения, представляющий собой отношение количества осадков за год к испаряемости, равен 1,2.
Период интенсивного роста и развития растений (со среднесуточными температурами выше 10С) составляет 140-150 дней. Он начинается в середине апреля — начале мая и заканчивается в конце сентября.
Количество осадков за период вегетации — 560-600 мм, из них 390-450 мм (65-70 %), приходится на тёплый период и 140-190 мм (30-35 %) - на зимнее время. Устойчивый снежный покров формируется обычно в первой половине декабря, толщина его колеблется в значительных пределах (от 5-10 см до 30-45 см).
Зима 2000/2001 годов была сравнительно тёплой. Частые снегопады отмечены в первой половине декабря и в середине января. Начало снеготаяния приходилось на первую декаду марта. Активный рост однолетних побегов ремонтантных форм малины начался с середины апреля, катализатором послужило повышение среднесуточных температур до 11,6С, что в 2 раза выше среднемноголетних показаний. Доля выпавших осадков в это время была ниже нормы на 12 мм, но запас почвенной влаги был достаточным для нормальной жизнедеятельности растений. Погодные условия в мае, также можно охарактеризовать как благоприятные для развития ремонтантной малины.
Тёплый и сухой сентябрь способствовал продолжительной вегетации растений малины. У ряда сортов и гибридных форм на дату первого возможного заморозка (15 сентября) в структуре генеративных образований доля зрелых ягод составила 70-100 %.
Снежный покров высотой до 20 см сформировался в конце ноября. В декабре отмечены морозы до — 25С. В январе наблюдалось некоторое потеп 51 ление до -Ю...18С. Февраль отличался частыми и продолжительными оттепелями. В марте с третьей декады началось иссушение почвы периодическими утренними заморозками (-3...-5С), а затем высокими среднесуточными температурами (до 17С).
Температурный режим в апреле 2002 года, мало чем отличался от среднемноголетних данных. Жаркая погода в конце месяца, способствовала активному протеканию ростовых процессов у растений и более раннему пробуждению цветочных почек. Количество выпавших осадков в это время было на 29,4 и 31,3 мм соответственно ниже среднемноголетних показателей.
Температура воздуха в июне находилась в интервале 16-27С, в результате чего среднемесячная температура превысила среднемноголетнюю на 12 С. За июль выпало 11,2 % месячной нормы осадков или 7,3 мм. Процессы оплодотворения и плодообразования у сортов и форм малины с обычным типом плодоношения протекали в крайне неблагоприятных условиях. Среднесуточная температура июля поднималась до 36 С. Плодоношение ремонтантных форм малины протекало в условиях повышенных температур и сильной почвенной и воздушной засухи.
Август также характеризовался высокими среднесуточными температурами и существенными осадками. Такая продолжительная засуха в Брянской области отмечена впервые за последние 50 лет.
Почвы селекционного участка, где проводились исследования, серые лесные. Содержание гумуса - 3,8-4,0 %, фосфора 25 - 35 мг Р2 05 на 100 г почвы, калия 9,77 - 14,12 мг КгО на 100 г почвы. Реакция почвенного раствора варьирует по участкам от кислой (рН=4,9) до слабо-кислой (рН=6,1).
Анализ почвенных образцов выполняли в межкафедральной лаборатории Брянской ГСХА. Агротехника при выращивании малины общепринятая в Нечернозёмной зоне. Предшественник — чёрный пар. Схема посадки растений однорядная, расстояние между рядами 3 м между растениями 0,5 м.
Генотипические особенности ремонтантной малины при введении в культуру in vitro
Через 2,5 недели культивирования на листовых эксплантах при концентрации TDZ 0.1, 0.2,0.5, 1 мг/л было отмечено начало стеблевого морфогенеза. После 26 дней инкубации увеличения числа образовавшихся регенерантов не происходило, за исключением варианта TDZ 0.5 мг/л. При концентрации TDZ 0.5 и 1.0 мг/л регенерировавшие побеги имели морфологические нарушения. Наибольшая частота регенерации была отмечена в варианте TDZ 0.2 мг/л и составила 46.7 %. Адвентивные почки формировались главным образом в месте среза центральной жилки без заметного каллусообразования, что уменьшало возможность появления сомаклональных вариантов, вероятность возникновения которых велика при морфогенезе через каллус.
После 7 недель культивирования регенеранты отсекали от листовой пластинки и помещали на среду размножения (6-БАП 2 мг/л). Приживаемость растений, снятых с меньших концентраций TDZ, была выше и составила 90.9%, 30.0% и 12.5% соответственно на средах с 0.1, 0.2, 0.5 мг/л TDZ.
Для изучения влияния гормонов на приживаемость и дальнейшее развитие, растения-регенеранты были перенесены со среды с 0.1 мг/л TDZ на среды без гормонов, с 6-БАП и TDZ.
Лучшая приживаемость регенерантов, перенесенных с TDZ, была получена при использовании среды, несодержащей регуляторы роста. В этом варианте образовывались нормальные побеги (табл. 25). При перенесении растений со среды с TDZ снова на среду с TDZ часть растений оказалась жизнеспособными, однако, имелись признаки витрификации и образовывался каллус. Худший результат по приживаемости регенерантов был получен при перенесении регенерантов на среду содержащую 6-БАП. На этой среде побеги не имели морфологических изменений, однако были мелкими. Плохая приживаемость растений, образовавшихся на средах с TDZ на среде с БАП, может быть связана с явлением витрификации, которое наблюдается в присутствии TDZ. Витрификация побегов у растений при их культивировании in vitro на средах, содержащих TDZ также отмечалось на побегах азалии и винограда (В.A. Brigss et al., 1988,1. Gribaudo & A. Fronda 1991). Гибель растений, после их перенесения на 6-БАП, может быть также связана с разной природой тидиазурона и 6-БАП, первый из которых относится к классу дифенилмочевины, а второй к производному аденина. Такое явление прослеживалось нами на этапе введения в культуру in vitro, при этом выживаемость образовавшихся растений при переносе на 6-БАП повышалась при их культивировании при низкой интенсивности света. Вероятно такой прием может быть полезен при адаптации регенерантов полученных из листовых дисков.
Увеличения регенерации у ряда плодовых культур можно добиться, используя темновую инкубацию листовых эксплантов (F. Fasolo et al., 1989; B.S. Baker & S.K. Bhatia, 1993). Для изучения влияния темноты на частоту регенерации ремонтантной малины был заложен опыт с использованием предкультивации листовых дисков растений сорта Бабье лето — 2 в течение 2 и 10 дней в темноте.
На третий-пятый день инкубации листовых дисков в темноте была отмечена некоторая потеря хлорофилла. Через две недели в контрольном варианте наблюдалось появление единичных очагов регенерации, а на дисках, перенесенных из темноты, происходило только каллусообразование. После трех-четырех недель культивирования в третьем варианте (10 дней темноты) и в меньшей степени во втором варианте (2 дня темноты) была отмечена регенерация побегов (рис. 9) Таким образом, на свету наблюдалось более раннее начало регенерации. Тем не менее, варианты с темновой инкубацией догнали и перегнали по этому показателю контрольный вариант. В целом можно сделать вывод, что темновая прединкубация уменьшила степень каллусообразо-вания и увеличила степень регенерации. Наиболее высокая частота регенерации наблюдалась в третьем варианте (10 дней темноты) и составила 31,3 %.
Во всех следующих экспериментах мы использовали предкультивацию листовых эксплантов в темноте.
Большинство исследователей использующих в качестве индуктора регенерации листовых эксплантов малины TDZ отмечают, что образование адвентивных побегов происходит непосредственно из ткани без промежуточной фазы каллусообразования (J.A. Fiola, 1990). Хотя есть данные и об органогенезе растений малины через каллус (В.A. Turk et al., 1994) или при небольшом каллусообразовании (H.J. Swartz et al., 1990). В наших исследованиях в большинстве случаев регенерация наблюдалась без заметного каллусообразования в очаге регенерации. На некоторых генотипах в зависимости от используемой концентрации TDZ, имело место сочетание нескольких моделей органогенеза, наблюдаемое в динамике.
Адаптация пробирочных растений ремонтантной малины к нестерильным условиям
Важным требованием при клональном микроразмножении in vitro является получение клонов, сохраняющих признаки и свойства материнских растений. Нередко в практике культуры ткани исследователи обращали внимание на появление аномальных форм, имеющих фенотипические или геноти-пические отклонения от исходных растений. К основным факторам, влияющим на стабильность растений в культуре in vitro обычно относят метод, используемый при регенерации растений, генетическую гетерогенность соматических клеток экспланта, тип и концентрации используемых регуляторов роста, источник экспланта, количество проведенных субкультивирований и генотип растения (М.М. Yeoman, 1986; R.L.M. Pierik, 1987; А. Каїр, 1995; В.А. Высоцкий, 1995).
Для оценки полученных in vitro растений ремонтантной малины в полевых условиях были изучены сорта Бабье лето — 2 и Геракл, которые сравнивали с растениями, размноженными традиционным способом (порослью). Учеты проводились на третий год после посадки растений в нестерильные условия.
Продуктивность изученных сортов ремонтантной малины зависела как от использованного генотипа, так и от способа размножения. Растения, полученные in vitro, превосходили растения размноженные порослью по следующим компонентам продуктивности: количеству образовавшихся побегов, числу латералов, общему количеству генеративных органов и зрелых ягод (табл. 34).
Независимо от происхождения, большей продуктивностью характеризовались растения сорта Бабье лето — 2, для которого потенциальная продуктивность составила 1568 и 2142 г. соответственно при традиционном и мик-роклональном способе размножения. Для сорта Геракл эти показатели составили 1260 и 2066 г. При оценке влияния различных способов размножения на побегообразо-вательную способность растений ремонтантной малины в полевых условиях было обнаружено, что полученные in vitro растения обладают существенно большей способностью образовывать корневую поросль в сравнении с растениями, размноженными традиционным способом (табл. 35). У размноженных in vitro растений сорта Геракл за 2 года исследований было отмечено также существенное увеличение количества образовавшихся побегов замещения и тенденция к их увеличению для сорта Бабье лето — 2. Увеличение вегетативной и генеративной продуктивности растений, полученных in vitro, наблюдалось также у многих плодово-ягодных растений (C.S. Walsh et al., 1986). Обычно это явление связывают с реювенилизацией растений, т.е. приобретением ювенальных свойств под действием условий культивирования in vitro и, в частности, экзогенных регуляторов роста. Положительное влияние на рост и развитие растений также может оказывать оздоровление полученных in vitro растений. Применительно к сортам ремонтантной малины, характеризующихся низкой порослеобразовательной способностью, это свойство последействия условий in vitro имеет большое значение при закладке маточников этой культуры. Наблюдения селекционеров за ростом размноженных in vitro растений за 10 лет использования метода клонального микроразмножения показали, что со временем (4-5 лет) явление увеличения вегетативной и генеративной продуктивности у ремонтантной малины затухает. При оценке размноженных in vitro растений в полевых условиях не было обнаружено каких-либо мутантных форм, отличающихся от исходных сортов и гибридов, хотя в культуре in vitro наблюдалось появление растений с признаками точечных листовых мутаций, которые проявлялись в виде безхлоро-фильных пятен и морфозов листовых пластинок. После высадки растений в нестерильные условия, такие химерные ткани погибали, а растения приобретали нормальный вид. Селекционная практика свидетельствует, что на создание нового сорта малины, с учетом всех этапов его формирования (от гибридизации до районирования), в лучшем случае требуется 12-15 лет. При этом не учитывается время на дальнейшее размножение этих сортов в питомнике, откуда они должны поступить к потребителю. Еще более длительным оказывается путь создания сортов малины с использованием межвидовой гибридизации, нередко необходимой для радикального совершенствования исходного материала. В этом случае часто приходится преодолевать трудности, связанные с плохой скрещиваемостью родительских форм, низкой фертильностью потомства, бесплодием. Требуется немало времени для подбора определенных экотипов и форм для гибридизации, проведения серий возвратных скрещиваний, неоднократного пересева семян от малоплодовитых гибридов, использование мутагенеза и других приемов.
Метод микроклонального размножения позволяет получать в сравнительно короткий срок необходимое количество генетически идентичных растений. Сроки создания и оценки новых ремонтантных форм малины можно сократить в 1,5-2 раза, размножив в течение 1 года до необходимого количества и высадить на участок по схеме конкурсного испытания. В зависимости от генотипа срок размножения элит в полевых условиях может занять до 5 лет (табл. 36). По трем урожаям этой посадки дается оценка испытываемых форм в сравнении со стандартом и выделяются элиты для представления их в качестве нового сорта. Именно таким путем удалось на 4-5 лет сократить сроки создания и подготовки к передаче в госсортоиспытание ряда межвидовых форм малины (Бабье лето - 2, Геракл).
