Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Клональное микроразмножение 8
1.1.1. Этапы клонального микроразмножения 9
1.1.2. Методы клонального микроразмножения 15
1.1.3. Факторы, влияющие на процесс клонального микроразмножения 20
1.2. Морфогенез в культуре in vitro 23
1.2.1. Морфогенез в каллусных тканях 24
1.2.2. Факторы, влияющие на морфогенез in vitro 29
1.3. Сомаклональная вариабельность 33
1.4. Методы клеточной селекции 34
Глава 2. Задачи, объекты и методика исследований 38
2.1. Цель и задачи исследований 38
2.2 Объекты исследований 38
2.3 Методика исследований 42
2.3.1 Техника изолирования эксплантов, субкультивирования, укоренения in vitro и адаптации растений ex vitro 42
2.3.2. Методика получения каллусной культуры 50
2.3.3. Техника получения регенерантов из листовых эксплантов 51
Глава 3. Результаты исследования 52
3.1. Клональное микроразмножение элитных форм и сортов малины 52
3.1.1 Особенности введения в культуру in vitro 52
3.1.2. Этап собственно размножения растений малины в культуре in vitro 63
3.1.3. Этап укоренения и адаптации 71
3.1.4. Влияние витаминно-минерального комплекса «Компливит» на рост и развитие растений малины в культуре in vitro 74
3.1.5. Оценка сортов и элитных форм малины на этапе элонгации 79
3.1.6. Этап адаптации растений летних сортов и форм малины к нестерильным условиям 80
3.1.7. Интенсивность транспирации растений малины при адаптации к нестерильным условиям 82
3.2. Получение каллусной ткани на эксплантах растений малины 86
3.3. Адвентивный органогенез в культуре in vitro некоторых генотипов малины 91
Выводы 96
Рекомендации 97
Список литературы 98
- Этапы клонального микроразмножения
- Морфогенез в каллусных тканях
- Техника изолирования эксплантов, субкультивирования, укоренения in vitro и адаптации растений ex vitro
- Особенности введения в культуру in vitro
Введение к работе
Актуальность темы. Регенерацию растений считают краеугольным камнем всей методологии культуры тканей, без которой становятся бесполезными исследования по гибридизации протопластов, росту и дифференцировке, получению генетически изменчивых растений, культуре пыльников. Благодаря знаниям в области регенерации растений, подобные исследования превратились в мощные инструменты, применяемые в сельском хозяйстве и садоводстве (Тиссера, 1989).
Наиболее разработанным биотехнологическим методом является клональное микроразмножение растений. За рубежом этот метод стал рутинным при тиражировании ценного селекционного материала плодово-ягодных культур в различных селекционных программах (Hаll, 2009).
Применение биотехнологических приемов в селекционном процессе нашло место на Кокинском опорном пункте ВСТИСП (Брянская обл.), где уже более 15 лет ведется работа в этом направлении. Необходимость использования культуры ткани возникла в связи с трудностью размножения ценных форм ремонтантной малины (Казаков, Евдокименко, 1997). В ходе проведенных исследований были оптимизированы все этапы культивирования ремонтантной малины in vitro (Вовк, 2000, Сковородников, 2004, Нам, 2004, Озеровский, 2007).
Из факторов, определяющих успех культуры тканей, наибольшее значение имеет генотип исходного растения. Экспериментально доказано, что сорта многих видов растений, культивируемых in vitro, обладают различным морфогенетическим потенциалом, т.е. имеют более или менее выраженную способность к образованию дополнительных почек и побегов, их росту, укоренению и, в конечном итоге, получению более высокого коэффициента размножения. Поэтому знания этих особенностей исследуемых генотипов растений даёт возможность планировать проведение работ в культуре in vitro и получать заданный объем селекционного материала.
Основой успешной работы в таких направлениях как генная инженерия, соматическая гибридизация и клеточная селекция является, прежде всего, получение стабильной и высокой частоты регенерации растений in vitro. Однако сложность данной проблемы заключается в том, что морфогенетические потенции тканей многолетних культур, к которым относится малина, не высоки. Отсюда и трудность, возникающая при регенерации целых растений из тканевых культур различных генотипов.
Цель исследований: оценить регенерационный потенциал новых форм малины, созданных на Кокинском опорном пункте ВСТИСП.
Задачи исследования:
1. Оценить морфогенетический потенциал новых элитных форм малины в культуре in vitro на всех этапах клонального микроразмножения;
2. Оптимизировать состав питательной среды для активной пролиферации и укоренения побегов;
3. Определить интенсивность транспирации растений малины в условиях in vitro и ex vitro;
4. Усовершенствовать состав питательной среды для индукции каллусогенеза и адвентивного органогенеза листовых эксплантов малины.
Научная новизна. Сделана оценка 45 элитных форм и сортов малины, культивируемых в условиях in vitro по основным морфобиологическим показателям. Установлено положительное влияние витаминно-минерального комплекса «Компливит» на рост и развитие растений малины in vitro. Обоснована замена этапа укоренения микрочеренков малины этапом элонгации с последующим укоренением растений в субстрате. Продемонстрировано изменение интенсивности транспирации растений малины в процессе их адаптации к нестерильным условиям среды.
Основные положения, выносимые на защиту:
морфогенетическая реакция новых элитных форм малины в культуре in vitro;
оптимизированный состав питательной среды для клонального микроразмножения малины;
способы индукции каллусогенеза и адвентивного органогенеза в культуре листовых эксплантов малины.
Практическая значимость. Оптимизирован состав питательной среды на этапах клонального микроразмножения малины. При адаптации к нестерильным условиям растений in vitro увеличен процент их приживаемости за счет включения этапа элонгации. Выявлена оптимальная концентрация производных дифенилмочевины (CPPU и TDZ), индуцирующая каллусогенез и адвентивный органогенез листовых эксплантов малины в культуре in vitro.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и одобрены на заседаниях кафедры биологии, кормопроизводства, селекции и семеноводства, на заседаниях ученого совета Агроэкологического института и научно-практических конференциях: VI Международная научная конференция «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск 2009), VII Международная научная конференция «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск 2010), Международная научно-практическая конференция «Биологизация земледелия в Нечерноземной зоне России» (Брянск 2010), Международной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов (Орел 2011), Научные чтения, посвященные выдающимся ученым академику Н.И. Вавилову и селекционеру К.И. Савичеву (Брянск 2011), VIII Международная научная конференция «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск 2011) и международная научно-практическая конференция «Использование биотехнологических методов и регуляторов роста в садоводстве» (Москва 2011).
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, выводов и рекомендаций для практической деятельности. Работа содержит 21 таблицу и 26 рисунков. Список использованной литературы включает 182 наименования, в том числе 29 на иностранных языках.
Этапы клонального микроразмножения
Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа: 1. Выбор растения – донора, изолирование эксплантов и получение хо-рошо растущей стерильной культуры; 2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение мак-симального количества меристематических клонов; 3. Ускорение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений – реге-нерантов при пониженной температуре (+2C, +10C); 4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реали-зации или посадке в поле.
Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды (Сидоренко Т.Н. и др., 2009). На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры (Калинин Ф.Л. и др., 1980). Как правило, исходный ма-териал обрабатывают раствором сулемы 0,1% (Фролова, Л.В., 2003, Сково-родников, Д.Н., 2003), этанолом 70% (Фролова, Л.В., 2003, Мохаммед А.И., 1998), раствором перекиси водорода 16% (Мохаммед А.И., 1998), «Белизны» (Шорников, Д.Г., 2009.) или другими хлорсодержащими и кислородсодер-жащими моющими и отбеливающими средствами (Ковальчук И.Ю. и др., 2008) с экпозицией 2-6 мин в зависимости от состояния и сезона взятия экс-плантов (Фролова, Л.В., 2003) и последующей неоднократной промывкой стерильной дистиллированной водой (Чупеева Н.В. и др., 2008).
В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100-200мг/л и другие (Ковальчук И.Ю., 2008).
Также на данном этапе используют среду, содержащую минеральные соли, предложенные Мурасигой и Скугой (Фролова, Л.В., 2003, Мохаммед А.И., 1998), и различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины и цитокинины) (Нам И.Я. и др., 2000), такие как тидиазурон (Сковородников, Д.Н., 2003, Райков, И.А. и др., 2009, Соболева. А.Г. и др., 2006), CPPU (Райков, И.А. и др., 2009, Соболева. А.Г. и др., 2006), БАП (Рай-ков, И.А. и др., 2009, Соболев В.В. и др., 2007) и другие в различных сочета-ниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибиро-вание роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную сре-ду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно непосредствен-ным добавлением их в питательную среду. В качестве антиоксидантов ис-пользуют аскорбиновую кислоту (1мг/л), глютатион (4-5мг/л), дитиотриэтол (1-3мг/л), диэтилдитиокарбомат (2-5мг/л), поливинилпирролидон (5000-10000мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент – древесный активированный уголь в концентрации 0,5-1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в ре-зультате которого наблюдается рост меристематических тканей и формиро-вание первичных побегов. 2 этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образова-ние растений-мутантов. Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Му-расига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесен-ных в питательную среду цитокининов и ауксинов (Мохаммед А.И., 1998, Сковородников Д.Н. и др., 2004). Из цитокининов наиболее часто использу-ют БАП (Паскеев, Н.А., 2001, Мохаммед А.И., 1998, Сковородников, Д.Н., 2003 , Геринг Х., 1991, Pyott J.L. et al., 1981, Упадышев М.Т., 1997) в концен-трациях от 1 до 10 мг/л, TDZ (Сковородников, Д.Н., 2003, Нам И.Я. и др., 2001, Huetteman C.A. et al, 1993) в концентрациях от 0,05 до 1мг/л, а из аук-синов—ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л (Сковородников, Д.Н., 2003), Муратова С.А. и др., 2001). Также на данном этапе некоторые иссле-дователи используют смесь цитокининов: 6-БАП с кинетином (Панькова О.А. и др., 2007, Туровская и др., 1992, Панькова О.А. и др., 1999).
При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией (Фролова, Л.В., 2003). Вместе с тем, можно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем у некоторых видов (Ковальчук И.Ю., 2008, Ковалева И.С. и др., 2000, Соболев В.В. и др., 2007), образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой (1984) и Р.Г. Бутенко (1979), путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цито-кининов (Панькова О.А. и др., 2008), обеспечивающих стабильный коэффи-циент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.
3 и 4 этапы — укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими эта-пами, от которых зависит успех клонального микроразмножения (Пронина И.Н. и др., 2009). На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минераль-ных солей по рецепту Мурасига и Скуга (Сковородников, Д.Н., 2003) или за-меняют ее средой Уайта, в некоторых случаях используют среду Смирнова при укоренении древесных растений (Фролова, Л.В., 2003) уменьшают коли-чество сахара до 0,5—1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют -индолил-3-масляную кислоту (ИМК) (Паскеев, Н.А., 2001, Фролова, Л.В., 2003, Мохаммед, А. И., 1998, Сковородников, Д.Н., 2003, Соловьева И.И., 1989, Попов Ю.Г. и др., 1970, Щелкунова С. Е. и др., 1970), ИУК (Паскеев, Н.А., 2001, Сковородников, Д.Н., 2003) или НУК. Также некоторые ягодные культуры укореняются на средах без фитогормонов (Паскеев, Н.А., 2001).
Морфогенез в каллусных тканях
Из всех видов вторичной дифференцировки наибольший интерес пред-ставляет морфогенез, так как он позволяет получать целое растение из кал-лусной клетки. В основе дифференцировки и морфогенеза лежит последовательное включение различных генов, т.е. дифференцировка клеток определяется дифференциальной активностью генов. Изменение активности структурных генов может быть связано с их дерепрессией, репрессией или амплификацией (умножением). Большую роль в этом процессе играют фитогормоны.
Рассмотрению причин перехода неорганизованно растущих клеток к формированию структур посвящено большое количество работ (Бутенко, Р.Г., 1964, Бутенко, Р.Г., 1999, Моисеева, Н.А., 1991). Опубликован ряд руко-водств по регенерации растений из изолированных тканей (Высоцкий В.А. и др. 1998, Куреченко, Л.А., 1991, Моисеева Н.А., 1991, Муромцев Г.С. и др., 1990, Расторгуев С.Л., 1996, Хамукова Ф.Н., 1996, Кучеренко Л.А., 1997).
Во многих работах отмечается, что частота индукции морфогенеза ягодных культур из соматических тканей определяется генотипом растения, минеральным и гормональным составом сред, составом и количеством саха-ров в питательных средах, типом и местом взятия исходного экспланта, ори-ентацией его на среде, температурой и световым режимом культивирования эксплантов и другими факторами (Бутенко Р.Г., 1964, Бутенко Р.Г., 1999, Вы-соцкий В.А. и др., 1998, Куреченко Л.А., 1991, Моисеева Н.А., 1991, Муром-цеви Г.С. др., 1990, Расторгуев С.Л., 1996, Хамукова Ф.Н., 1996).
Существует несколько путей, по которым может идти развитие клетки после ее дедифференцировки. Первый путь — это вторичная регенерация це-лого растения, возможна дифференцировка на уровне клеток, тканей, орга-нов. Второй путь — это утрата клеткой способности к вторичной дифферен-цировке и регенерации растения, стойкая дедифференцировка, приобретение способности расти на среде без гормонов, т.е. превращение в опухолевую. Такими свойствами часто характеризуются клетки старых пересадочных культур. Третий путь — это нормальный цикл развития каллусной клетки, заканчивающийся ее старением и отмиранием. В этом случае клетка претер-певает вторичную дифференцировку и прекращает делиться (стационарная фаза роста). Однако такая дифференцировка не ведет к морфогенезу, а закре-пляет за ней свойства старой каллусной клетки. Для сельскохозяйственной биотехнологии наибольший интерес пред-ставляет регенерация в культуре тканей из отдельной клетки целого расте-ния. Иногда этот путь лежит через образование отдельных органов. В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникновение организованных структур из неорганизованной массы клеток.
В результате соматического эмбриогенеза в отличие от органогенеза сразу образуется зародыш, имеющий как меристему корня, так и меристему верхушечной почки, из которого в дальнейшем развивается целое растение. Способность отдельной соматической клетки полностью реализовы-вать свою программу развития и давать начало целому растительному орга-низму называют тотипотентностью растительной клетки. Любая раститель-ная клетка обладает одинаковыми потенциальными возможностями, так как содержит весь набор генов и, следовательно, клетки сохраняют свойствен-ную зиготе программу развития. Поэтому если мы получаем каллус из клеток лепестка цветка, или из клеток сердцевинной паренхимы стебля, или из кле-ток любой ткани, то в принципе каждая такая клетка может регенерировать целое растение. Однако свойство тотипотентности не всегда реализуется, так как потенциальные возможности клеток разных типов проявляются неодина-ково. В некоторых из них гены в сильной степени репрессированы, в связи с чем, проявление тотипотентности становится ограниченным. Идея о тотипотентности растительной клетки была выдвинута Г. Ха-берландтом еще в 1902 г., хотя и не получила тогда экспериментального под-тверждения. Согласно определению Хаберландта, любая клетка растения может дать начало новому организму, и если этого не наблюдается, то только потому, что растительный организм подавляет потенции клетки к развитию. Изоляция клеток от растений способствует проявлению этих потенций. Клеточную основу морфогенеза составляет цитодифференцировка. Ре-генерация растения начинается со вторичной дифференцировки клеток. При этом дедифференцированные клетки вновь приобретают структуру и функ-ции специализированных. Вторичная дифференцировка каллусных клеток не всегда заканчивает-ся морфогенезом и регенерацией растения (Артюхова А.В. и др., 2009). Ино-гда она приводит только к образованию тканей (гистодифференцировка). Та-ким путем каллусная клетка может превращаться во флоэмные или ксилем-ные элементы. Другим примером вторичной дифференцировки может слу-жить превращение дедифференцированной активно пролиферирующей клет-ки в старую неделящуюся каллусную клетку (стационарная фаза роста). Выделяют два типа культивируемых растительных клеток: нормальные и опухолевые.
Опухолевые клетки морфологически мало отличаются от каллусных. Физиологическим различием является гормононезависимость опухолевых клеток. Благодаря этому свойству опухолевые клетки делятся и растут на пи-тательных средах без добавок фитогормонов. Эти клетки также лишены спо-собности дать начало нормально организованным структурам (корни, побе-ги) в процессе органогенеза. Иногда они образуют тератомы (уродливые ор-ганоподобные структуры), дальнейшее развитие которых невозможно.
Нормальные клетки в культуре могут существовать в двух видах: в ви-де суспензии в жидкой питательной среде и на поверхности твердой пита-тельной среды в виде каллуса. Поверхностное культивирование осуществля-ют на полужидкой агаризованной среде, среде с добавлением других жели-рующих полимеров, на дисках из полиуретана, на мостиках из фильтроваль-ной бумаги, полупогруженных в жидкую питательную среду. Можно также использовать комочки ваты, пропитанные питательной средой, которые сверху покрываются кусочком фильтровальной бумаги.
Техника изолирования эксплантов, субкультивирования, укоренения in vitro и адаптации растений ex vitro
Метод клонального микроразмножения растений включает несколько этапов культивирования растительной ткани: 1) введения в культуру in vitro; 2) этап собственно размножения; 3) этап укоренения; 4) этап адаптации растений к нестерильным условиям (Муромцев, 1990). Стерилизация посуды проводилась автоклавированием при 120 оС в те-чение 25-30 минут. Питательные среды стерилизовали путем их автоклавирования в тече-ние 25 минут при повышенном давлении - 1,3 атм. избыточного давления (121 оС). Таблица 1. Состав питательной среды для клонального микроразмножения малины Название компонентов Количество (мг/л) MS Препарат «Компливит» KNO3 1900 NH4NO3 1650 MgSO4 7Н2О 370 MgHP04 3Н20 - 105,45 KH2PO4 170 CaCl2 2Н2О 440 CaHPO4 2H2O - 182,95 Na2 ЭДТА 111,9 FeSO4 7Н2О 83,4 11,36 H3ВО3 6,2 MnSO4 4Н2О 22,3 MnSO4 H2O - 5,68 ZnSO4 7Н2О 8,6 4,55 KJ 0,83 Na2МоО4 2Н2О 0,25 CuSO4 5Н2О 0,025 1,70 СоСl2 6Н2О 0,025 CoSO4 7H2O - 0,23 C18H32CaN2O10 - 11,36 Инозит (витамин В8) 100 Сахароза 30000 Витамин А - 2,58 Витамин Е - 22,73 Витамин В2 - 2,89 Витамин В12 - 0,03 Никатинамид - 17,05 Никотиновая кислота 0,5 Тиоктовая кислота C8H14O2S2 4,55 Пиридоксин (В6) 0,5 11,36 Фолиевая кислота (B9) - 0,23 Рутозид - 56,82 Тиамин (В1) 0,1 2,27 Аскорбиновая кислота 1,0 113,64 Вспомогательные вещества: метилцеллюлоза водорастворимая, тальк, крахмал карто-фельный, лимонная кислота, повидон низкомолекулярный (поливинилпирролидон низкомолеку-лярный), кальция октадеканоат (кальция стеарат), сахароза (сахар), мука пшеничная, магия гидро-ксикарбонат (магний углекислый основной водный), желатин, титана диоксид, воск пчелиный.
Для размножения применяли оптимизированную для ремонтантных образцов малины среду, содержащую цитокинин 6-БАП в концентрации 1 и 2 мг/л. Препарат «Компливит» (ОАО «Фармстандарт – УфаВИТА») в измель-ченном состоянии вводили в питательную среду в количестве 2г/л (табл. 1).
Черенкование растений проводилось в асептических условиях на сте-рильной фильтровальной бумаге в чашке Петри путем отделения пазушных и адвентивных побегов, а также разделением побегов на несколько частей, со-держащих 2 - 3 междоузлия.
Учитывали количество дополнительно образовавшихся побегов без учета черенкования, их высоту и количество образовавшихся листьев. Для укоренения использовали побеги размером 1,5-2,0 см с 3-6 листоч-ками.
В качестве индукторов ризогенеза применяли ИУК или ИМК. Ауксины вводились непосредственно в питательную среду в концентрации 0,5-1,2мг/л.
Подготовка растительного материала для введения в культуру in viro: нарезку черенков малины осуществляли за несколько дней до изолирова-ния эксплантов. Заготовленный материал хранили в полиэтиленовых пакетах для предотвращения его подсыхания в бытовом холодильнике при темпера-туре 4С.
Перед изолированием черенки нарезались на сегменты с одной почкой длиной 2-4 см. Для удобства работы черенок расщепляли вдоль по центру, что предотвращало его проворачивание на предметном столике бинокуляра.
Стерилизация материала: нарезанные черенки стерилизовали в 0.1% растворе мертиолята (орто-этилртутьтиосалицилат натрия, C9H9HgNaO2S — органическое соединение ртути ароматического ряда), 20% раствора перики-си водорода, 70% раствора этанола и 0,3% SDS (додецилсульфат натрия) в качестве поверхностно-активного вещества в течение 3 минут на шейкере, с последующей пятикратной промывкой в стерильной дистиллированной воде.
После стерилизации черенки обсушивали на стерильных кружках фильтровальной бумаги в ламинарном шкафу.
Изолирование эксплантов: Изолирование проводили в условиях лами-нарного шкафа ЛШ-2. Для вычленения эксплантов использовали бинокуляр-ный микроскоп МБС-9. В качестве источников эксплантов использовали фрагменты почек (3-5 мм) без нескольких кроющих чешуй, которые отсека-лись от черенка с помощью глазного скальпеля. Культивирование эксплантов осуществляли на питательной среде Мура-сиге-Скуга (1962) (табл.) в пробирках Флоринского с добавлением в качестве источника цитокинина 0,2 мг/л CPPU: N-(2-хлор-4-пиридил)-N-фенилмочевина: C12H10ClN3O (Мв - 247.7) (Рис. 9) или тидиазурона: 1-фенил-3-(1,2,3-тидиазол-5-ил) мочевина в концентрации 0,1 мг/л (Рис. 10). Рис. 9 Структурная формула CPPU Рис. 10 Структурная формула тидиазурона Растворы фитогормонов готовили на этиловом спирте, поэтому допол-нительной стерилизации не требовалось. Пробирки, для сохранения стерильности и уменьшения испарения воды из питательной среды, закрывали пищевой пленкой в два слоя. Через 1-2 месяца культивирования учитывали следующие показатели: - частота контаминации – доля культуральных сосудов с микробиологи-ческим зарастанием, %; - частота приживаемости эксплантов – доля погибших эксплантов без учета инфицированных, %; - высота регенерантов – высота почек или стеблей образовавшихся в те-чение учетного периода, мм; - количество образовавшихся регенерантов на эксплант, шт. – число по-чек и стеблей, образовавшихся в течение учетного периода. Микрочеренкование и субкультивирование растений: В условиях ламинарного шкафа готовые к черенкованию растения сте-рильным крючком вынимали из пробирки и помещали на кружок фильтро-вальной бумаги. С помощью скальпеля и пинцета пучок побегов разделялся на отдельные черенки, которые на несколько миллиметров погружались в свежую питательную среду МС, содержащую цитокинин 6-БАП – 6-бензиламинопурин (Рис. 11) в концентрации 1 и 2 мг/л. Штативы с пробир-ками помещали на стеллажи оборудованные лампами дневного света. По-вторные субкультивирования проводили по мере образования новых побегов (в среднем через 6 недель). Рис. 11. Структурна формула 6-БАП На этапе размножения учитывали следующие показатели: - коэффициент размножения – среднее количество образовавшихся по-бегов на одном растении; - высоту растений, см; - количество листьев, шт. Этап элонгации: для получения крупных микрочеренков, пригодных к укоренению, на последнем субкультивировании использовали питательную среду, не содержащую регуляторы роста растений, но обогащенную вита-минно-минеральным комплексом «Компливит» в концентрации 2 г/л. Этап укоренения: Питательные среды для укоренения пробирочных растений готовили на основе, разбавленной в 2 раза, минеральной части сре-ды МС с полным содержанием витаминов и снижением концентрации саха-розы до 15г/л (а гормоны?) (В.А. Высоцкий , 1984).
Особенности введения в культуру in vitro
Оптимальным сроком введения в культуру in vitro большинства ягодных растений, в том числе и малины, является период активного роста побегов – конец мая, начало июня (Озеровский А.В. и др., 2006, Чупеева Н.В.и др., 2008). Эффективность начального этапа культивирования в эти сроки выяв-лена и на ремонтантных формах малины (Нам, 1998). Однако при введении в культуру генотипов малины in vitro в весенне-летний период возникает ряд трудностей. Во-первых – это ограниченное число подходящих почек, кото-рые можно использовать для изолирования от побегов. Так, при введении в культуру 28 новых генотипов в весенне-летний период, в среднем на каждый приходилось лишь 13 эксплантов (Вовк В.В., 2000). При таком ограниченном количестве материала есть вероятность потери некоторых генотипов из-за контаминации культуры и/или неприживаемости эксплантов. Во-вторых, у ремонтантной малины наблюдается ранняя дифференцировка почек по цве-точному типу, что снижает эффективность применения стандартных методов культивирования. В-третьих, есть вероятность появления сортосмеси при за-готовке побегов возобновления при загущенных посадках гибридов. На Кокинском опорном пункте ВСТИСП селекция ремонтантной мали-ны ведется в направлении создания сортов, реализующих основную часть своей продуктивности осенью на однолетних побегах, что позволяет ежегод-но после заморозков срезать всю надземную часть куста. В связи с этим по-сле проведения селекционной оценки сеянцев (конец августа – начало сен-тября) для введения в культуру in vitro можно использовать почти все нерас-пустившиеся почки на побегах замещения. Однако большинство почек у ма-лины в это время дифференцированы по цветочному типу и при их культи-вировании на стандартных средах (0,2-0,5 мг/л 6-БАП) отмечается гибель большей части материала. Увеличение приживаемости эксплантов и регене-рации растений при введении в культуру в осенний период удалось достичь, используя в качестве источника цитокинина производные дифенилмочевины – тидиазурон и СPPU, которые в низких концентрациях (0,1-0,2 мг/л) оказа-лись более эффективными, чем фитогормоны пуринового ряда. Введение растений малины в культуру in vitro осенью дает возможность начать размножение нужных форм сразу после проведения селекционной оценки и тем самым сократить период их размножения. При этом даже в за-гущенных посадках сеянцев малины интересующий селекционера генотип легко обнаружить при его плодоношении и использовать для изолирования экспланты от нераспустившихся почек с побегов замещения. Кроме этого, при изолировании крупных почек сформировавшихся на однолетних побегах быстрее происходит регенерация растений, чем в весенний период, а плотные ороговевшие чешуи почек надежно защищают ткани от повреждения анти-септиками при стерилизации.
Установлено, что производные дифенилмочевины в определенной сте-пени стимулируют развитие цветочных структур в условиях in vitro. Так, в зависимости от фазы дифференцировки почек, нередко отмечается появление одного или нескольких бутонов, и, как исключительное явление, их распус-кание (Рис. 16). Однако дальнейшего своего развития эти цветочные образо-вания не получают и со временем усыхают, тогда как регенерировавшие по-беги сохраняют активный рост (Рис. 17).
Регенерация побегов из пазушных почек происходит по периферии их основания из запасных меристем (Рис. 18). В среднем образуется около 2 по-бегов на эксплант. Рис. 18. Регенерация побегов из первичного экспланта сорта Оранжевое чудо
Нами установлено, что при использовании в качестве эксплантов цве-точных зачатков, можно добиться из них адвентивной регенерации побегов (Вовк, 2000). Однако, в связи с возможным появлением сомаклональных ва-риантов при таком типе регенерации (Высоцкий, 1995), его необходимо при-менять лишь в исключительных случаях.
На успешное введение в культуру in vitro и последующее микроразмно-жение большое влияние оказывают гормональный состав питательных сред, выбор типа и размера исходных эксплантов, генотип использованного расте-ния (Папихин и др., 2009), а также сроки их выделения. По некоторым дан-ным, оптимальными сроками введения меристем ремонтантной малины счи-тается весенний период (Чупеева Н.В. и др., 2008).
Этап введения в культуру in vitro предоставленных в лабораторию для размножения образцов ремонтантной малины выделенных в 2008 году был проведён достаточно успешно (табл. 2). Существенных различий по прижи-ваемости эксплантов, источником которых служили пазушные почки мали-ны, обнаружено не было. Стопроцентная приживаемость эксплантов большинства генотипов по-зволяет сделать вывод, что состав питательной среды и условия культивиро-вания для роста и развития растений малины in vitro подобраны оптимально. При ограниченном количестве исходного материла, это условие может сыг-рать решающую роль на этапе введения в культуру ценных гибридов мали-ны.
Количество инфицированных эксплантов, которое выражалось числом пробирочных культур инфицированных сапрофитной микрофлорой, можно оценить как низкое, за исключением генотипа 1-12-10, у которого этот пока-затель составил 36,7%. Показатель инфицированности варьирует в зависимо-сти от размера сформировавшихся почек, их поврежденности и загрязненно-сти почвой. Для борьбы с сапрофитной микрофлорой так же в питательную среду вводят антибиотики. По данным Белошапкиной (2001) применение докси-циклина (аналог тетрациклина) в концентрации 40 мг/л освобождало культу-ру от инфекции. При введении в культуру in vitro трех сортов ремонтантной малины до-ля инфицированных эксплантов также была не значительной – от 3,8% до 27,3%. Показатель инфицированности варьировал от 3,8% (Рубиновое оже-релье) до 27,3% (Оранжевое чудо). Показатель приживаемости эксплантов находился в интервале от 54,9% (Рубиновое ожерелье) до 84,5% (Оранжевое чудо) (табл.3). Таблица 3. Введение в культуру in vitro ремонтантной малины № п.п. Сорт Изолированно эксплантов, шт. Инфицировано эксплантов, % Приживае-мостьэксплантов, % Количество побегов на эксплант, шт. 1 Рубиновое ожерелье 53 3,8 54,9 2,86±0,30 2 Оранжевое чудо 77 27,3 84,5 2,36±0,42 3 Геракл 49 16,3 65,9 1,87±0, Количество побегов на эксплант по сортам варьировало незначительно от 1,87 до 2,86. Большое значение при введении в культуру in vitro уделяется природе образовавшихся побегов. Предпочтение должно отдаваться побегам, образо-вавшимся из меристем. Использование побегов адвентивной природы повы-шает возможности мутационных изменений.
Для повышения выхода свободной от инфекции культуры некоторые ис-следователи рекомендуют промывать растительный материал перед вычле-нением эксплантов горячей водой при температуре 48±0,5С в течение 15-30 минут (Алексеенко, 1998). Многие исследователи, для получения стерильной культуры при неудачной стерилизации исходного материала, советуют до-бавлять в питательную среду антибиотики, например, препарат «Гризео-фульвин» в концентрации 2,5мг/л (Ковальчук И.Ю., 2008, Чупеева Н.В. и др., 2008) или использовать несколько дезинфицирующих средств при введении, таких как «ACE», «Vanish», «Няня» и другие (Ковальчук И.Ю., 2008). Мы поставили перед собой задачу в 2009 ввести в культуру in vitro мак-симально большое количество первичных эксплантов, для сокращения пе-риода культивирования пробирочных растений.
