Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 7
1.1. Специфика культивирования in vitro редких садовых растений 7
1.1.1. Введение в культуру in vitro 7
1.1.2. Этап собственно микроразмноэ/сения 9
1.1.3. Укоренение микропобегов in vitro 17
1.1.4. Адаптация растений к нестерильным условиям 23
1.2. Регенерация из соматических тканей 25
1.3. Устойчивость редких садовых культур к неблагоприятным абиотическим факторам окружающей среды 30
1.3.1. Устойчивость к дефициту влаги и перегреву 30
1.3.2. Устойчивость к избытку солей в почве 33
1.3.3. Устойчивость к действию ионов тяжелых металлов 37
ГЛАВА 2. Цель, задачи, методика и объекты проведения исследований 39
2.1. Цель и задачи исследований 39
2.2. Объекты и методы исследований 40
Результаты исследований 47
ГЛАВА 3. Эксплантирование и стерилизация растительного материала редких садовых растений 47
3.1. Получение стерильного растительного материала жимолости 47
3.2. Влияние режима стерилизации и типа экспланта на эффективность введения в культуру лимонника китайского и сортов актинидии 49
3.3. Отработка режимов стерилизации эксплантов элеуте рококка колючего 53
ГЛАВА 4. Оптимизация этапа микроразмножения жимолости и актинидии 56
4.1. Влияние концентрации 6-БАП на пролиферацию микропобегов жимолости 56
4.2. Зависимость роста и развития микропобегов жимолости от концентрации ИМК в питательной среде 64
4.3. Влияние концентрации и типа витаминной смеси на интенсивность побегообразования жимолости 66
4.4. Оптимизация этапа микроразмножения актинидии 68
ГЛАВА 5. Разработка приемов культивирования in vitro лимонника и элеутерококка 82
5.1. Влияние гидролизата казеина и гормонального состава среды на пролиферацию лимонника 82
5.2. Влияние источников углеводного питания на побегооб-разовательную способность микрочеренков лимонника 90
5.3. Дополнительные добавки к среде размножения лимонника 93
5.4. Подбор минерального состава среды для культивирования элеутерококка 96
5.5. Влияние гибберелловой кислоты и нативных соединений на индукцию побегов элеутерококка in vitro 99
ГЛАВА 6. Регенерация побегов жимолости в культуре листовых дисков 104
ГЛАВА 7. Укоренение микропобегов in vitro и адаптация микрорастений к условиям IN VIVO 111
7.1. Оптимизация минерального состава среды укоренения 111
7.2. Влияние концентрации ауксина и способа обработки микрочеренков на укореняемость in vitro 113
7.3. Адаптация микрорастений к условиям открытого грунта 124
7.4. Некоторые биометрические показатели in vivo регене-рантов, полученных в культуре листовых дисков жимолости 129
ГЛАВА 8. Адаптивыни потенциал редких садовых культур 132
8.1. Жаро- и засухоустойчивость лимонника китайского, сортов жимолости и актинидии 132
8.2. Изучение солеустойчивости редких садовых культур... 140
8.3. Оценка толерантности актинидии и лимонника к воздействию ионов тяжелых металлов 145
8.4. Применение метода лазерного анализа микроструктуры (ЛАМ) растительной ткани для оценки устойчивости к абиотическим стресс-факторам растений актинидии 151
8.4.1. Устойчивость к экстремальным положительным температурам 153
8.4.2. Устойчивость к солям тяжелых металлов и хлориду натрия 157
ГЛАВА 9. Экономическая эффектиность получения посадочного материала жимолости с применением метода клонального микроразмножения 161
Выводы 163
Рекомендации для практического использования 164
Список используемой литературы 166
- Специфика культивирования in vitro редких садовых растений
- Получение стерильного растительного материала жимолости
- Влияние гидролизата казеина и гормонального состава среды на пролиферацию лимонника
- Оптимизация минерального состава среды укоренения
Введение к работе
Интенсификация отечественного садоводства ставит перед селекционерами важную задачу повышения продуктивности агроэкосистем за счет получения новых генотипов, сочетающих стабильную урожайность и высокий потенциал устойчивости к воздействию биотических и абиотических стрессоров. Одним из путей решения этого вопроса является включение в селекционный процесс родственных дикорастущих форм, а также активное привлечение в культуру и дальнейшая работа с малораспространенными растениями, такими как актинидия, жимолость, лимонник.
Чтобы интродуценты успешно конкурировали и дополняли традиционные плодовые и ягодные культуры, необходима серьезная работа по дальнейшему улучшению потребительских качеств плодов и повышению урожайности, словом для достижения того, что делает культуру рентабельной и без чего невозможно ее широкое промышленное использование.
Для наиболее успешной реализации хозяйственно-ценных качеств, заложенных в генотипе, также необходимы исчерпывающие знания о физиологических особенностях растительного организма, в том числе и о величине адаптивного потенциала, что особенно актуально в условиях возрастающей техногенной нагрузки на окружающую среду. Отсутствие по этому вопросу исчерпывающих данных и надежных методов оценки устойчивости к ряду абиотических стрессоров применительно к нетрадиционным растениям ограничивает возможности исследователей и замедляет процесс селекции.
В связи возрастающими требованиями к качеству продукции растениеводства необходимо активно применять современные наукоемкие технологии, которые во много раз расширяют возможности ученых селекционеров и сокращают сроки улучшения сортов по некоторым показателям. Как отмечает В.И. Кашин (2001), на всех этапах от селекции до массового размножения, нужны высокие и более эффективные технологии с применением современного оборудования и химических средств, а С.Н. Хабаров (2001) в числе важнейших про блем питомниководства называет совершенствование микроклонального размножения различных видов и форм растений.
Это связано с тем, что отработанная технология клонального размножения является основой для других биотехнологических методов, открывающих перспективы оздоровления от вирусов и получения нового исходного материала для селекции с использованием соматической гибридизации или индукции сомаклональной изменчивости в культуре тканей. Это одна из наиболее развитых отраслей прикладной биотехнологии в последние годы все чаще применяется для размножения нетрадиционных садовых культур (Куликов, Высоцкий, Шипунова, 2005). Преимуществом культуры тканей in vitro является высокий коэффициент размножения и, как следствие, выход большого количества растений за короткое время, а также возможность тиражировать те формы растений, которые слабо размножаются в обычных условиях.
Особенно перспективной является разработка методов культивирования in vitro для трудно укореняемых форм, таких как лимонник китайский, или многолетних растений, у которых в качестве сырья используют корневища (элеутерококк, женьшень), тем самым нарушая один из механизмов естественного возобновления популяции. Но в связи с интенсивным увеличением сортимента нетрадиционных культур сдерживающим фактором широкого внедрения клонального микроразмножения в систему производства посадочного материала ягодных культур является проблема сортоспецифичности ростовых реакций в условиях in vitro, что требует, помимо разработки новых методов, дополнительной оптимизации условий культивирования применительно к конкретным сортам и формам.
В этой связи цель данной работы — совершенствование технологии размножения нетрадиционных садовых культур и изучение их устойчивости к основным дестабилизирующим воздействиям абиотического характера.
Специфика культивирования in vitro редких садовых растений
При введении растительного объекта в культуру in vitro необходима тщательная поверхностная обработка материала стерилизующим агентом. В настоящее время разработано большое количество разнообразных схем стерилизации, сочетающих в том числе и поэтапное воздействие разных асептиков. Конечной целью данной операции является получение максимального числа не-инфицированных и жизнеспособных эксплантов.
Чаще всего стерилизацию проводят в растворах веществ, содержащих активный хлор или ртуть. К хлорсодержащим препаратам относятся гипохлориты кальция и натрия, хлорамин и хлорная известь. Есть данные об успешном применении 10%-ого гипохлорита натрия для стерилизации эксплантов малины (Velchev, 2004). Из соединений ртути наиболее распространен хлорид ртути (сулема). В некоторых случаях экспланты дополнительно обрабатывают перекисью водорода либо погружают в спирт. Р.Г. Бутенко (1964) рекомендует перед обработкой стерилизующим раствором опускать экспланты на несколько секунд в спирт. Для стерилизации апексов и зеленых черенков жимолости А.А. Сорокин (2003) применял диоцид, а О.В. Матушкина (2003) проводила стерилизацию 30% раствором перекиси водорода. При этом диапазон экспозиций, позволяющих достигнуть необходимого уровня асептики, довольно широк: от пятиминутной обработки перекисью до двадцати минут при использовании диоцида. Получены положительные результаты при использовании ультрафиолетового лазера с длиной волны 308 нм для снижения уровня контаминации in vitro (Al-Juboory, Williams, Nayfeh, 1990).
Вообще, выбор стерилизатора и длительности экспозиции определяется, прежде всего, типом экспланта. В зависимости от происхождения, возраста и, соответственно, степени лигнификации растительной ткани применяют более или менее жесткую схему стерилизации. Наглядно это показано в работе В.А. Внучковой (1979). Применяя один и тот же стерилизующий агент - раствор хлорной извести для обработки семян и зеленых частей растений, она отмечает, что более жесткий режим стерилизации зрелых семян позволяет получить полностью обеззараженный материал. Лигнифицированные оболочки, кроющие чешуи почек, мощный восковой налет на поверхности побегов и листьев обеспечивают защиту от токсического действия стерилизатора и дают возможность реализовывать комбинированные схемы стерилизации. Эффективная экспозиция может составлять десятки минут (Давоян,1979; Кучеренко, 1991; Оледзка, Юзефович, Фурманова, 1991).
В литературе имеется немало данных и об эффективном применении для стерилизации растворов бытовых дезинфицирующих средств, как правило, это хлорсодержащие препараты (Бутенко, 1964; Бохорова, Петров, Георгиева,1991; Пронина, 2003; Ткаченко,2006; Nehra, Stushnoff, Kartha, 1989; Quinn, Simon, Janick, 1989; Lee, Wetstein, 1990).
Выбор экспланта обусловлен конкретными задачами, поставленными перед исследователем. В том случае, когда необходимо быстро размножить генетически однородный материал, используют пазушные или апикальные почки, а часто и целые узлы с сегментом междоузлия (Самусь, Семенас, Коноплева, 2002; Сорокин, Иванова, 2002; Сорокин, 2003; Стахеева, Митрашенкова, Горбунов, 2003; Высоцкий, 2006).
С целью получения оздоровленного материала обычно используют культуру изолированных меристем. В этом случае размеры экспланта составляют десятые доли миллиметра, что, безусловно, значительно усложняет работу с культурой, но является эффективным приемом оздоровления сельскохозяйственных растений от большинства патогенных микроорганизмов. Такие работы проводили на сортах винограда, земляники, малины, вишни, груши, подвоях яблони и других породах плодовых, ягодных и декоративных культур (Попов, Равкин, 1979; Рыбалко, 1991; Коршун, Муратова, Иванов, Тугарев, 1996; Вер-зилин, Иванов, Трунов, 1998; Дорошенко, 1998; Орлова, Юшев, 2000; Ломов-ская, 2003; Кухарчик, Семенас, Колбанова, Кастрицкая, 2003; и др.).
Культура изолированных меристем в сочетании с термо- и хемотерапией позволяет оздоравливать растительный материал, но требует более детальной оптимизации состава сред и условий культивирования (Упадышев, 1996; Про ворченко, Подорожный, Гавриш, 2001).
Календарные сроки эксплантирования растительного объекта напрямую влияют на приживаемость культуры в целом, так как связаны с прохождением определенных фенофаз. Здесь независимо от генотипа работает одно правило — чем моложе используемая часть растения, тем больше процент стерильных экс-плантов и лучше адаптация к условиям in vitro. В связи с этим, для получения эксплантов чаще используют зеленые растущие побеги текущего года. Непригодность одревесневших черенков для введения в культуру показана многими авторами (Кухарчик, Семенас, Колбанова. Кастрицкая, 2003). Так, при введении в культуру сортов и форм киви используют апикальные меристемы или комплексные экспланты, вычлененные ранней весной или в период активного роста побегов (Harada, 1975; Standardi, Catalano, 1984; Monette, 1986; Shen, Wan, Luo, 1990)
O.B. Матушкина (2003), а также A.A. Сорокин и M.H. Иванова (2002), работая с жимолостью, отбирали материал для введения в культуру во второй половине мая или в течение активного роста побегов. При необходимости можно получить экспланты и в более ранние сроки — как только растения выйдут из состояния глубокого покоя, но все-таки оптимальным является весенне-летний период.
Получение стерильного растительного материала жимолости
Успешное введение в культуру зависит от ряда факторов и является одним из важных этапов клонального размножения. Получение стерильного растительного материала представляет собой сложную задачу, успешное решение которой зависит от правильного выбора стерилизующего агента и его концентрации, экспозиции стерилизации, типа и размера исходного экспланта, а также сроков введения в культуру.
Чаще всего в качестве экспланта рекомендуют использовать апикальные и латеральные почки неодревесневших, активно растущих побегов. Молодые побеги, необходимые для вычленения эксплантов, получали отращиванием в помещении черенков, вышедших из состояния глубокого покоя в феврале-марте, а также непосредственно с вегетирующих растений в открытом грунте в весенне-летний период. Исходный размер комплексных эксплантов составлял 1,5-2 см, но после стерилизации срезы освежали, так что фактический размер узла с сегментами междоузлий был не более 1-1,3 см.
Использование на этапе введения в культуру in vitro полуодревесневших или одревесневших частей неэффективно и вызывает дополнительные трудности с получением асептического материала (табл. 2).
В качестве стерилизатора был выбран коммерческий препарат гипохло-рита натрия «Белизна» из-за своей дешевизны и меньшей токсичности. Кроме того, отпала проблема специальной утилизации отходов стерилизующего раствора.
Для стерилизации сегментов побега жимолости с пазушной почкой использовали разбавленный в три раза раствор «Белизны». В.А. Минаев (2005) успешно применял средство «Белизна» в той же концентрации для стерилизации почек подвоев яблони. Одревесневшие черенки обрабатывали более концентрированным раствором с добавкой в качестве детергента Тритон X 100.
При использовании сегментов зеленых побегов выход стерильных эксплантов составил 63-85 %. В случае применения в качестве эксплантов полуодревесневших побегов выход стерильного материала был значительно ниже (10,7-31,2%).
Тип исходного экспланта, равно как и сроки его вычленения, значительно влиял на дальнейшую жизнеспособность растительного материала (табл. 3). Жизнеспособность полуодревесневших побегов in vitro близка к нулю. Кроме того, нами отмечено постепенное прогрессирующее заражение эксплантов, что приводило к полной их гибели спустя некоторое время.
Таким образом, наиболее эффективным приемом является введение жимолости в культуру in vitro узлом неодревесневшего активно растущего побега.
Молодые побеги актинидии и лимонника лишены густого опушения, поэтому для стерилизации использовали раствор «Белизны», разбавленный стерильной водой в объемном соотношении 1:1, но без добавления поверхностно-активных веществ. В зависимости от экспозиции изменялся выход стерильных жизнеспособных эксплантов (табл. 4).
Увеличение экспозиции до 5 минут повышало процент стерильных жизнеспособных эксплантов у всех сортов с 26,2 до 88 %. Низкий выход стерильных жизнеспособных эксплантов при малых экспозициях обусловлен низким качеством стерилизации, что ведет к угнетению растительного материала патогенными микроорганизмами.
При введении в культуру новых растительных объектов необходимо учитывать особенности их морфологии (величина почек, наличие кроющих чешуи, опушения побегов), чтобы подобрать оптимальный режим стерилизации. На этапе введения в культуру лимонника китайского в качестве эксплантов решено было использовать не почки, а сегменты (1,5 см) зеленых, активно растущих побегов с пазушной почкой.
Влияние гидролизата казеина и гормонального состава среды на пролиферацию лимонника
Несмотря на большую ценность лимонника как лекарственной культуры, до настоящего времени не отработан метод клонального микроразмножения, позволяющий длительно культивировать микропобеги in vitro и получать растения через культуру изолированных органов и тканей. Обладая низкой укоре-няемостью in vivo, это реликтовое растение требует детального изучения условий культивирования, т.к. редкие попытки исследователей культивировать лимонник in vitro не дали желаемого результата. Авторы, работавшие с этой культурой, отмечают длительную фазу покоя эксплантов (до нескольких месяцев) и полное отсутствие роста даже после нескольких субкультивирований.
Анализируя скудную информацию по культуре лимонника in vitro, было решено отказаться от использования среды Мурасиге и Скуга и взять за основу пропись элементов минерального питания по Кворину и Лепорье в модификации А. Стандарди (1984), которая успешно применялась для культивирования киви и актинидии коломикта.
В ходе предварительных опытов нами была впервые установлена важная роль гидролизата казеина в инициации побегообразования и поддержания обменных процессов эксплантов лимонника. Уже на этапе введения этот компонент питательной среды в концентрации 100 мг/л способствовал дружному пробуждению почек микрочеренков, активизировал развитие первичных эксплантов, а так же существенно усиливал побегообразовательную способность на этапе микроразмножения (рис.22).
Как показали результаты исследований, диапазон оптимальных концентраций гидролизата казеина находится в пределах 250-500 мг/л. Концентрация гидролизата 750 мг/л замедляла рост побегов, кроме того, варианты с высоким содержанием гидролизата казеина отличались повышенной инфицированно-стью эксплантов.
На среде, содержащей 250 мг/л гидролизата, уже в первые 12 суток культивирования средний коэффициент размножения превышал 1, в то же время в контроле и других вариантах он был не более 0,3-0,6. На этой же концентрации (250 мг/л) был достигнут максимум коэффициента размножения - 2,7 побе-га/эксплант через 60 суток культивирования.
Дальнейшие наблюдения показали, что в присутствии 250 мг/л гидролизата микрочеренки лимонника отличаются боле высоким коэффициентом размножения и имеют нормально развитые, яркоокрашенные побеги. В контроле наблюдали частичную гибель эксплантов, а сформированные побеги характеризовались значительно меньшими размерами (рис.23).
Полученные данные согласуются с результатами некоторых авторов, указывающих на положительное влияние широкого диапазона концентраций (от 2 до 200 мг/л) гидролизата казеина на процессы органогенеза in vitro и накопление хлорофилла у таких культур как Malva sihestris L. и Cajanus cajan (Kintzios et al., 2002; Vaithiyalingan, Nadarajan, 2004).
Для успешного клонирования новой культуры необходима оптимизация гормонального состава среды, в частности определение наиболее эффективного цитокинина. На этапе собственно микроразмножения лимонника мы испытыва Наиболее эффективным регулятором роста на данном этапе является 6-БАП. Коэффициент размножения на среде с 6-бензиламинопурином достигал 2,8 побегов/эксплант, что почти вдвое выше этого же показателя при использовании зеатина. Прочие регуляторы роста из группы цитокининов: 2-ІР и кинетин оказались малопригодными для культивирования микропобегов лимонника, поскольку даже через 68 суток среднее число новых побегов было меньше 1, а варианте, содержащем 2 мг/л кинетина, происходило отмирание сформированных побегов, чем и объясняется снижение коэффициента размножения при дальнейшем культивировании.
Для культивируемых микропобегов лимонника был характерен медленный рост в течение всего пассажа. Как известный усилитель роста побегов ш vitro мы испытывали гибберелловую кислоту в концентрации 0,5 мг/л.
Для некоторых культур также показано применение гиббереллина в концентрации 1-2 мг/л для увеличения коэффициента размножения (Минаев, 2005).
Чтобы изучить влияние этого регулятора роста на пролиферацию побегов мы комбинировали его с теми же концентрациями цитокининов, что и в предыдущем опыте (рис.25).
Как видно на рис. 25, комбинирование гибберелловой кислоты с разными цитокининами оказывает неравнозначное воздействие на способность эксплан-тов формировать побеги и является неэффективным приемом на этапе микроразмножения. Во всех вариантах опыта даже через 72 дня культивирования коэффициент размножения был равен или чуть больше единицы.
Анализируя полученные результаты и сравнивая их с данными, представленными на рисунке 25, мы пришли к заключению, что совместное использование гиббереллина с 6-БАП или зеатином в разной степени снижает количество новых побегов, в тоже время в комбинации с 2-iP и кинетином коэффициент размножения увеличивался до единицы, что указывает на возможный синергизм действия гибберелловой кислоты с кинетином и 2-изопентиладенином
Оптимизация минерального состава среды укоренения
Наиболее активно процесс укоренения проходил на среде Кворина Лепорье с фазой этиоляции. В первые одиннадцать суток культивирования было получено 14 % укоренных растений, в то время когда на других средах процент укоренения не превышал 4%.
Приблизительно через месяц различия в вариантах опыта сглаживаются, но при дальнейшем культивировании процесс корнеобразования на средах без затемнения замедляется и останавливается совсем. Только побеги, прошедшие этиоляцию, характеризуются стабильным увеличением процента укоренившихся растений.
Для укоренения микропобегов жимолости лучше подходит среда Кво-рина-Лепорье с половинной концентрацией макроэлементов. Помещение экс-плантов в условия полной темноты на 5-6 суток ускоряет ризогенез и способствует лучшему развитию корневой системы.
Несмотря на стимулирующий эффект, этиоляция продолжительностью в одиннадцать суток оказывает отрицательное воздействие на общее состояние растений. Длительный период без света вызывает некрозы листьев и усыхание побегов, особенно если они больше 3-4 см.
Различные концентрации гормонов, индуцирующих ризогенез in vitro, оказывают неравнозначное влияние на степень укореняемости и уровень развития корневой системы растения.
Изучали влияние различных концентраций индолилмасляной кислоты на укоренение микропобегов жимолости и актинидии. В качестве минеральной основы использовали среду Кворина-Лепорье. В контрольном варианте опыта побеги помещали на среду укоренения, не содержащую гормонов.
Чтобы избежать искажения результатов опыта действием других фито-гормонов из состава среды исключили 6-бензиламинопурин и гибберелловую кислоту. В имеющейся литературе большинство исследователей рекомендует включать в состав среды укоренения наряду с ауксинами и вещества, обладающие цитокининовой активностью. Но, поскольку перед укоренением побеги длительно культивировали на средах размножения, содержащих достаточное количество цитокининов, отсутствие 6-БАП не должно отрицательно сказаться на состоянии растений (табл. 15). - контрольный вариант
Увеличение концентрации ИМК в среде стимулирует ризогенез и линейный рост корней. Концентрация ИМК 1мг/л увеличивает среднее число корней в 2 раза по сравнению с контролем, а длину корней — в 3,5 раза. Хорошие результаты укоренения дает ИМК в концентрации 0,5 мг/л. По средним показателям количества корней на побег и их длины данная концентрация менее эффективна, но по числу укорененных растений концентрации 0,5 мг/л и 1 мг/л практически одинаковы (рис. 50).
Уже через двенадцать дней культивирования на среде, содержащей 0,5 мг/л ИМК, укоренилось 89 % побегов, а на среде, дополненной 1 мг/л ИМК -92,3 %. В этот же срок укоренение в контроле не превышало 53 %.
Как показывают результаты исследований, жимолость неплохо укореняется и на безгормональной среде, но при этом образуются тонкие нитевидные корни. Применение ИМК в концентрации менее 0,5 мг/л не эффективно, так как 5 в этом случае количество и длина корней незначительно превосходит контроль. Внесение в среду укоренения ИМК в концентрации 0,5-1 мг/л стимулирует рост мощных длинных корней с густой мочкой. — -ИМК-0 ИМК-0,25 ИМК-0,5 ИМК- Отсутствие в среде укоренения 6-БАП и гибберелловой кислоты не снижает процент укоренения. Во всех вариантах побеги имели нормальные зеленые листья без видимых повреждений и некрозов.
Несмотря на то, что в литературе есть данные об ингибировании процессов укоренения по мере роста концентрации ауксина, установленное для некоторых культур повышение концентрации ИМК в среде ризогенеза усиливало корнеобразование жимолости Гжелка (рис. 51).
Оптимальное содержание ауксина составляет 0,5-1 мг/л, длина корней и их количество на эксплант возрастают вместе с концентрацией индолилмасляной кислоты. Низкие концентрации не оказывали должного воздействия на формирование корней жимолости - основные параметры корневой системы в
