Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Природа устойчивости растений к фитопатогенам и способы создания сортов, устойчивых к болезням 11
1.2. Клеточная селекция растений на устойчивость к фитопатогенам 16
1.2.1. Использование тканевых и клеточных культур в селекции
на устойчивость к фитопатогенам 25
1.2.2. Использование патогенов в клеточной селекции растений 28
1.3. Селекция огурца на устойчивость к фузариозу 37
Экспериментальная часть 46
ГЛАВА 2. Условия, исходный материал, схема и методики проведения опытов 46
2.1. Исходный материал 46
2.1.1. Растительный материал 46
2.1.2. Штаммы возбудителя фузариозного увядания огурца F. oxysporum 49
2.2. Схема исследований 49
2.3. Методы исследований 51
2.3.1. Методы выращивания растений 51
2.3.2. Методики лабораторных опытов 51
2.4. Условия выращивания эксплантов 59
2.5. Методы оценки огурца на устойчивость к фузариозу 59
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждения 63
3.1. Оптимизация факторов, влияющих на морфогенетическую способность эксплантов огурца 63
3.1.1. Стерилизация семян и сегментов растений огурца для введения в культуру in vitro 64
3.1.2. Обоснование выбора эксплантов 67
3.1.3. Изучение влияния фитогормонов на морфогенетическую активность тканей огурца 71
3.1.4. Получение растений - регенерантов огурца, укоренение и адаптация к почвенным условиям 75
3.2. Разработка селективных условий для создания in vitro тканевых культур, устойчивых к фильтрату культуральной жидкости гриба F. oxysporum и фузариевой кислоте 77
3.2.1. Изучение влияния концентрации фильтрата культуральной жидкости F. oxysporum на тканевые культуры огурца in vitro 77
3.2.2. Изучение влияния фузариевой кислоты на морфогенетическую активность тканей огурца при культивировании in vitro 81
3.3. Усовершенствование экспресс - оценки огурца на устойчивость кфузариозу 84
3.3.1. Усовершенствование экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанные на проращивании семян на фильтрате культуральной жидкости гриба F. oxysporum 85
3.3.2. Усовершенствование экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанные на культивировании проростков in vitro на селективных средах, содержащих фильтрат культуральной жидкости гриба F. oxysporum 89
3.3.3. Оценка огурца на устойчивость к фузариозу на искусственном инфекционном фоне 91
3.4. Коэффициенты корреляции признаков при сравнительной оценке методов на устойчивость к фузариозу 94
3.5. Биохимическая оценка растений огурца на основании колориметрического метода суммарного содержания фенольных соеди- 97
нений
3.6. Экономическая эффективность 99
Выводы 101
Предложения для использования в селекционной Практике 103
Список использованной литературы 104
Приложение 119
- Природа устойчивости растений к фитопатогенам и способы создания сортов, устойчивых к болезням
- Штаммы возбудителя фузариозного увядания огурца F. oxysporum
- Оптимизация факторов, влияющих на морфогенетическую способность эксплантов огурца
- Изучение влияния фузариевой кислоты на морфогенетическую активность тканей огурца при культивировании in vitro
Введение к работе
Решение большинства практических задач селекции во многом может определяться эффективностью вовлечения современных методов в селекционный процесс. Значительное место в решении этих задач занимает клеточная селекция, основанная на отборе клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору, и регенерации из них растений (Поляков А.В., 2003; Калашникова Е.А., 2003).
При использовании методов клеточной селекции в нашей стране и за рубежом достигнуты значительные результаты: созданы устойчивые линии люцерны (Мезенцева О.Н., 1992) и льна (Поляков А.В., 2000; Пролетова Н.В., Поляков А.В., 2003) к фузариозу; томатов (Нгуен Х.М., 1991) и моркови (Калашникова Е.А., Ипатова Н.В., 2004) к альтернариозу; картофеля - к фи-тофторозу и бактериальной гнили (Калашникова Е.А., 2000). Благодаря достижениям клеточной селекции стало возможным получение in vitro расте-ний-регенерантов с измененными признаками, среди которых селекционер может отобрать устойчивые к болезням формы и при этом сохранить положительные черты исходного образца (Бутенко Р.Г., 1999). Однако, несмотря
на определенные успехи, имеющиеся в селекции огурца, до настоящего времени не созданы сорта и гибриды, устойчивые к фузариозному увяданию. В связи с этим необходимо шире использовать в селекционном процессе методы in vitro.
Большая роль по увеличению урожайности огурца, улучшению качества и стабильности урожая отводится селекции. Снижение урожайности на 30
- 50 % является следствием широко распространенного и вредоносного за
болевания - фузариоз. Ее вызывает ряд патогенов, основными из них явля
ются грибы рода Fusarium: F. oxysporum, F. solani. Провоцируют болезнь
резкие перепады температуры воздуха, переувлажнение почвы, пониженная
температура. Источником инфекции являются компосты, рассадные смеси,
недостаточно продезинфицированные грунты, растительные остатки, а также
семена, где патоген находится в состоянии глубокого покоя. Причиной забо
левания являются в основном фитотоксичные выделения возбудителя забо
левания - несовершенного гриба F. oxysporum, вызывающие нарушения фи
зиологического гомеостаза растений. Реже наблюдается трахеомикозная за
купорка сосудов проводящей системы, приводящая к увяданию и гибели рас
тений из - за нарушений водного обмена. (Будынков Н.И. и др., 1999; На-
стенко Н.В. и др., 1994; Юрина О.В., 1986).
Традиционным методом селекции огурца на повышенную устойчивость к фузариозу является отбор устойчивых растений из гибридов и сортов в фазе первого настоящего листа на искусственном инфекционном фоне. Этот метод хорошо себя зарекомендовал, но он остается трудоемким и длительным.
Одним из путей решения этой проблемы является получение растений
- регенерантов, характеризующихся повышенной устойчивостью к фузари
озному увяданию. Их создание возможно с использованием методов биотех
нологии.
Исходя из вышеописанных проблем, целью исследований являлось усовершенствование методов in vitro применительно к культуре огурца для повышения эффективности селекционного процесса этой культуры и создания форм, характеризующихся повышенной устойчивостью к фузариозу.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- оптимизировать факторы, влияющие на морфогенетическую способность
эксплантов огурца;
разработать селективные условия для создания in vitro тканевых культур, устойчивых к фильтрату культуральной жидкости (ф.к.ж.) гриба Fusarium oxysporum и фузариевой кислоте (ф.к.);
усовершенствовать элементы методики экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанные на проращивании семян на ф.к.ж. гриба F. oxysporum и культивировании проростков in vitro на селективных средах, содержащих ф.к.ж. гриба F. oxysporum;
оценить полученные от гибридов и линий формы огурца на устойчивость к фузариозу на искусственном инфекционном фоне с использованием традиционных методов.
Объект исследований - методы культуры ткани и органов в селекции огурца и методы селекции на устойчивость к фузариозу.
Предмет исследований - каллус, почки, побеги, сегменты растений, растения - регенераты, семена огурца.
Научная новизна работы. Усовершенствована методика экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанная на культивировании семян и растений на ф.к.ж. и селективной среде, содержащей ф.к.ж. гриба F. oxysporum в концентрации 10 % в условиях in vitro, позволяющая в течение 12 и 14 суток оценить селекционный материал и выделить образцы с повышенной устойчивостью к фузариозу.
Усовершенствован метод клеточной селекции in vitro, основанный на ступенчатом культивировании эксплантов и трансплантов огурца на селек-
тивной среде, содержащей ф.к.ж. гриба F. oxysporum в концентрации 10 % и на среде без селективного фактора, позволяющий получать каллусные линии растения огурца с повышенной устойчивостью к фитопатогену.
Оптимизированы условия получения растений-регенерантов огурца. Подобран режимы стерилизации семян и сегментов растений для введения в культуру in vitro. Определено соотношение фитогормонов в питательной среде для культивирования эксплантов и трансплантов.
Практическая ценность работы состоит в том, что оптимизирован процесс получения растений - регенерантов огурца in vitro на основе верхушечных почек, гипокотильных сегментов и каллуса. Получены растения - регенераты, характеризующиеся повышенной устойчивостью к фузариозу. Разработаны и опубликованы методические рекомендации «Получение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию методами in vitro» (2006 г.).
Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.
Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены или представлены на III Международной конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова (Москва, 2003), Международной научно - практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» (Москва, 2004), Международной научно - практической конференции «Проблемы научного обеспечения овощеводства юга России» (Краснодар, 2004), III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2006).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
элементы технологии получения растении-регенерантов огурца в условиях in vitro;
система селективных условий для создания in vitro тканевых культур, устойчивых к ф.к.ж. гриба F. oxysporum и ф.к.;
усовершенствованный метод экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу.
Публикации результатов исследований. По результатам исследований по теме диссертации опубликовано 8 работ. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы, содержащего 155 наименований, в том числе 37 иностранных авторов и приложений.
Диссертационная работа изложена на 133 страницах, иллюстрирована 22 таблицами, 20 рисунками.
Природа устойчивости растений к фитопатогенам и способы создания сортов, устойчивых к болезням
Для всех сельскохозяйственных культур полезность нового сорта зависит, прежде всего, от его урожайности и качества продукции; поэтому, как правило, более высокие урожайность и качество - это две важнейшие цели селекции. Устойчивость к болезням является важной дополнительной целью, потому что следствием высокой восприимчивости, обычно, бывает снижение урожаев и качества продукции. Устойчивость - это любой исследуемый признак растения - хозяина, ослабляющий влияние паразита. Паразит - это организм или вирус, обитающий на другом живом организме или внутри него и получающий за счет этого некоторые преимущества без какой - либо компенсации хозяину. Большинство растений иммунно (полностью устойчиво) к большинству паразитов. Растение восприимчиво к патогенному организму, который может поражать его, но существуют разные степени восприимчивости. Устойчивость может сопровождаться такими прилагательными, как высокая, средняя или низкая, потому, что может иметься вся шкала переходов от крайней устойчивости к крайней восприимчивости. Растения, зараженное в такой же степени, как и другие, но менее пострадавшее (в отношении урожая или качества продукции) в результате этого, называют выносливым (толерантным) (Рассел Г.Э., 1982; Robinson R.A., 1976).
Установлено несколько типов устойчивости, и их классифицировали различным образом. Например, механизм наследования был использован для различения трех основных типов устойчивости: моногенной, олигогенной и полигенной, в которых устойчивость контролируется соответственно одним, немногими или многими генами (Рассел Г.Э., 1982).
Ван дер Планк (1963) полагал, что два основных типа устойчивости можно обозначить эпидемиологическими терминами: горизонтальная устойчивость, эффективная против всех генетических вариантов конкретного па разита, и вертикальная устойчивость, эффективная только против некоторых вариантов. Джонсон и Лоу (1975) предложил термин долговременная устойчивость как более подходящий для описания длительной устойчивости. Дол-говременность не означает, что устойчивость эффективна против всех вариантов паразита, а выражает только то, что устойчивость обеспечивает защиту в течение многих лет и остается эффективной. Термин переходящая устойчивость применяется к устойчивости, эффективно защищающей от паразита в течение короткого периода. Термин "полевая устойчивость" применяется к устойчивости, обеспечивающей эффективную защиту от паразита в естественных условиях. Однако эту устойчивость трудно установить в лабораторных или тепличных опытах. Полевая устойчивость часто контролируется по-лигенно и часто бывает долговременной, однако эти показатели не являются главными критериями полевой устойчивости (Рассел Г.Э., 1982; Johnson R., Law C.N., 1975; Van Der Plank J.E., 1963).
Каждый компонент устойчивости к какой - либо болезни может состоять из ряда, возможно, независимых субкомпонентов. Сверхчувствительность, описанная Стакхемом (1954) как быстрое отмирание зараженных клеток, ограничивающее распространение облигатных возбудителей, считается связанной с рядом различных механизмов, включая антибиоз (который может быть связан с образованием ингибиторных соединений растением - хозяином в ответ на заражение), наличие механических препятствий (таких, как клеточные стенки, которые не могут быть легко разрушены ферментами возбудителя), либо отсутствие или недостаточность питательных веществ или других незаменимых соединений (Рассел Г.Э., 1982; Ellingboe Е.Н., 1972; StakmanE.C, 1954).
Селекция на устойчивость к болезням не имеет коренных отличий от селекции на любые другие признаки, следовательно, методы селекции, разработанные для других признаков, могут быть использованы и для селекции на устойчивость к болезням. Наиболее подходящие методы для селекции на устойчивость в значительной степени зависят от того, опыляется ли он чужой пыльцой или самоопыляется, а также от имеющихся источников устойчивости. У перекрестноопыляющихся культур наиболее обычный метод селекции на устойчивость - это массовый отбор, при котором отдельные растения отбирают на устойчивость из гетерогенной популяции растений; этим отобранные растения позволяют затем переопыляться, чтобы получить семена для следующего поколения. Цель заключается в получении большей доли устойчивых растений в каждом следующем поколении; при повторении отбора в каждом поколении (т.е. путем периодического отбора) должно достигаться непрерывное улучшение устойчивости (Рассел Г.Э., 1982; Allard R.W., 1960).
При селекции линий отобранные растения самоопыляются или перекрестно опыляются и полученные потомства или линии испытываются на устойчивость. Только наиболее устойчивые линии оставляют для последующей селекции, а затем взаимно они переопыляются в ходе сложного скрещивания. Другой метод сводится к отбору устойчивых растений из гетерозиготной популяции и перекрестному опылению их самих или инбредных линий, произведенных от этих растений во всевозможных комбинациях в поликроссе. Потомство от поликросса может быть смешано, и в этом случае устойчивые растения в последующем отбирают из смешанной популяции или же потомство от индивидуальных линий может испытываться отдельно. Устойчивые линии можно использовать для получения гибридов или синтетических сортов. Гибридизация связана с искусственным скрещиванием растений двух чистолинейных сортов с целью объединения желательных признаков обоих родителей.
Штаммы возбудителя фузариозного увядания огурца F. oxysporum
Норд Fi - Включен в Госреестр по Волго - Вятскому, Средневолжско-му, Уральскому и Западно - Сибирскому регионам для весенних пленочных теплиц. В плодоношение вступает на 45 - 49 - е сутки после полных всходов. Пчелоопыляемый, используется в свежем виде и для консервирования. Вкус хороший. Товарная урожайность 13-18 кг/м . Поражается мучнистой и ложной мучнистой росой. Ценность гибрида: плоды укороченные (10 - 12 см), пригодны для консервирования, высоких товарных и хороших вкусовых качеств (Бирюкова Н.К., 2001; Литвинов С.С., 2002).
Тополек Fj - Включен в Госреестр по Северо - Западному и Центральному регионам для выращивания в зимних теплицах в осенне - зимнем обороте и в весенних пленочных обогреваемых и необогреваемых теплицах. Пчелоопыляемый, засолочный, урожайный (12 - 17 кг/м ). В плодоношение вступает в зимних теплицах на 43 - е сутки после появления полных всходов, в весенних теплицах - на 49 - 50 - е сутки. Слабо поражается мучнистой и ложной мучнистой росой, средне поражается серой и белой гнилями, аскохи-тозом. Ценность гибрида: хорошая товарность (95 - 97 %), красивый внешний вид плода, хороший вкус в свежем и соленом виде (Бирюкова Н.К., 2001; Литвинов С.С., 2002).
Кристалл Fi - Включен в Госреестр по Центральному региону для весеннее - летней культуры. Пчелоопыляемый, высокоурожайный (15 - 27 кг/м2), среднеранний, в плодоношение вступает на 49 - 50 - е сутки после полных всходов, женского типа цветения, ветвление слабое. Ценность гибрида: отличные вкусовые качества зеленцов, толерантен к корневым гнилям. Хорошо переносит колебания внешних температур. Характеризуется высокой пластичностью (Бирюкова Н.К., 2001).
Дуняша Fi - Включен в Госреестр по Российской Федерации для выращивания в весеннее - летнем обороте (пленочные укрытия). Партенокар пический, урожайный, среднеранний, в плодоношение вступает на 49 - 50 - е сутки после полных всходов, преимущественно женского типа цветения. Ценность гибрида: отличные вкусовые качества зеленцов, толерантен к корневым гнилям. Хорошо переносит колебания внешних температур. Характеризуется высокой пластичностью (Бирюкова Н.К., 2001).
Рябинушка Fi - Включен в Госреестр по Российской Федерации для выращивания в весеннее - летнем обороте (пленочные укрытия). Партено-карпический, урожайный, среднеранний, в плодоношение вступает на 46 - 47 - е сутки после полных всходов, преимущественно женского типа цветения. Ценность гибрида: отличные вкусовые качества зеленцов, универсального использования. Плод долго не желтеет Толерантен к корневым гнилям. (Бирюкова Н.К., 2001). F. oxysporum
Чистая культура гриба F. oxysporum получена из лаборатории пасленовых культур ГНУ ВНИИО РАСХН от ведущего научного сотрудника, кандидата с. - х. наук Н.С. Горшковой. В качестве селективного фактора для оценки селекционного материала огурца в лабораторных условиях использовали фильтрат культуральной жидкости.
Эксперименты по усовершенствованию элементов метода клеточной селекции и метода экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу предусматривали изучение следующих этапов: 1. Подбор образцов огурца; 2. Получение ф.к.ж. штамма возбудителя; 3. Уточнение режимов стерилизации семян и сегментов растений огурца для получения стерильных эксплантов; 4. Подбор питательных сред для получения морфогенной каллусной ткани; 5. Получение каллусов огурца и культивирование их на питательных средах, содержащих токсины патогена; 6. Получение почек и побегов; 7. Укоренение побегов; 8. Получение регенерантов; 9. Проведение и усовершенствование экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу; 10. Получение потомства, из отобранных образцов на селективных средах и в инфекционном питомнике; 11. Сравнение методов экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу.
Оптимизация факторов, влияющих на морфогенетическую способность эксплантов огурца
Цель этого этапа - получение стерильных проростков и эксплантов для исследования морфогенетической активности образцов огурца. Стерилизация необходима для удаления с поверхности семян и сегментов вегетирующих растений инфекции, которая может развиться при дальнейшем культивировании эксплантов in vitro и вызвать поражение и гибель растительного материала.
Наши исследования показали, что использование в качестве стерилизующего вещества гипохлорита натрия в концентрации 1% при экспозиции 30 мин привело в дальнейшем к полной потере всхожести анализируемых семян. Причем во время стерилизации наблюдалось изменение обычной окраски семян огурца от светло - желтой до темно - коричневой, т.е. своеобразный некроз. В связи с этим экспозицию воздействия стерилизующего вещества на семена огурца снизили до 15 и 20 минут.
Проведенные исследования позволили подобрать режим стерилизации и получить стерильные проростки. Так, наибольшее число стерильных про ростков (86,7 %) было получено при стерилизации семян 1% раствором гипохлорита натрия в экспозиции 15 мин. При стерилизации семян огурца 1% раствором гипохлорита натрия в экспозиции 20 мин. стерильных проростков было получено в 2 раза меньше (44,2 %). В результате проведенных исследований не выявлено существенных различий между изучаемыми образцами огурца (табл. 4, приложение 1 и рис. 5).
При стерилизации 12 образцов семян огурца 1% раствором гипохлорита натрия в течение 15 мин. существенных различий между образцами по числу полученных стерильных проростков выявлено не было. Колличество полученных стерильных проростков варьировало от 85,0 % до 97,5 % (приложение 2).
Исследование по изучению режимов стерилизации сегментов вегети-рующих растений огурца 1% раствором гипохлорита натрия в течение 10, 15, 20 и 25 минут показали, что количество полученных стерильных эксплантов существенно различалось в различных вариантах. Так, наибольший выход стерильных эксплантов (70,0 %) наблюдался после 10 - минутного воздействия стерилизующим веществом. При 15 - минутной экспозиции получено 30% морфогенных стерильных эксплантов. В результате 20 и 25 - минутного воздействия стерилизующего вещества получены практически одинаковое количество морфогенных эксплантов (16,6 % и 13,3 %). Большей частью сегменты вегетирующих растений теряли свою морфогенную активность (табл. 5, рис. 6 и 7).
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что оптимальным режимом стерилизации для получения стерильных проростков и эксплантов огурца является выдерживание семян и сегментов растений в 1 % растворе гипохлорита натрия в течение 15 или 10 мин соответственно.
Выбор экспланта играет существенную роль для проведения клеточной селекции. В работах по клеточной селекции огурца чаще всего в качестве экспланта использовали сегменты гипокотиля из ткани которых, образовывался первичный каллус, характеризующийся наибольшей морфогенной активностью (Маркова Н.В., 1991).
В наших исследования с целью изучения морфогенетической активности огурца в качестве эксплантов использовали апикальные почки, семядоли и гипокотильные сегменты.
Проведенные исследования показали, что при культивировании апикальных почек на питательных средах MS-0 и MS-0,1 выявлены существенные различия по геммо - и ризогенезу. Наибольшее число геммогенных эксплантов (75%) получено на питательной среде MS-0,1, ризогенных (33,3%) -на среде MS-0. Культивирование апикальных почек на исследуемых средах приводило к индуцированию каллусогенеза (табл.6 и рис. 9).
При культивировании семядолей на питательной среде MS - 0, морфо-генные экспланты не образовывались, однако на питательной среде MSm -0,1 морфогенез отмечен у 16,6 % эксплантов (табл.6 и рис. 9).
При культивировании гипокотильных сегментов на этих средах наибольшее число каллусогенных эксплантов (47%) образовывалось на среде MS-0,1, на которой геммогенные экспланты не образовывались (табл.6 и рис. 8).
Изучение влияния фузариевой кислоты на морфогенетическую активность тканей огурца при культивировании in vitro
Фузариевая кислота - метаболит многих штаммов гриба Fusarium oxysporum, возбудителя фузариозного увядания огурца, была включена в исследования в качестве стрессового фактора.
В процессе культивирования гипокотильных сегментов на питательных средах контрольного варианта и, содержащих стрессовый фактор, происходило формирование зеленой каллусной ткани, рыхлого типа, способной к морфогенезу, морфогенетический потенциал которого зависел от концентрации стрессового фактора в питательной среде. Такие каллусы при переносе на среду с фузариевой кислотой, имели ярко выраженную пролифера-тивную способность и меристематические очаги. мг/л. Снижение морфогенетической активности каллусных клеток происходило при увеличении концентрации ф.к. в среде до 7,5 -10,0 мг/л.
Снижение морфогенетической активности каллусных клеток происходило при увеличении концентрации фузариевой кислоты в среде с 5,0 до 10,0 мг/л. При переносе морфогенных клеток на неселективную среду наблюдали формирование меристематических очагов и побегов (табл. 13).
Через 20 суток морфогенный каллус, сформированный на основе гипо-котильных сегментов огурца, переносили на свежую среду без токсина и культивировали в течение 14 суток. Было отмечено, что каллусная ткань, сформированная на селективной среде, чаще всего была неоднородной и состояла из рыхлых, с повышенной оводненностью и плотных структурированных тканей со слабо выраженными меристематическими очагами.
В ходе эксперимента было выявлено, что у эксплантов, культивируемых на питательной среде, содержащей ф.к. в концентрации 10 мг/л наблюдали ингибирование морфогенетической активности, что позволило проводить отбор устойчивых клеток и получать на их основе побеги и регенеранты (табл. 14).
Третий пассаж каллуса проводили на селективной среде, содержащей ф.к. в концентрации 10,0 мг/л, при этом было отмечено отличие в росте и развитии каллусов, сформированных первоначально на селективной и неселективной средах. Так, у каллуса, сформированного на селективной среде, при переносе вновь на среду с токсином наблюдали индукцию пролиферации каллусной ткани (табл. 7). В результате исследований было установлено, что при наличии в среде 10,0 мг/л ф.к., наблюдалось снижение морфогенеза (табл. 15).
Целью данного этапа являлось проведение отборочных испытаний растений - регенерантов огурца, полученных методом клеточной селекции.
Традиционным методом селекции огурца на повышенную устойчивость к фузариозу является отбор устойчивых растений из гибридов и сортов, в фазе первого настоящего листа на искусственном инфекционном фоне при 5 - ти бальной шкале оценки. Этот метод хорошо себя зарекомендовал, но он остается трудоемким и длительным. С целью ускорения селекционного процесса этой культуры на устойчивость к фузариозу нами были усовершенствованы методы экспресс - оценки на устойчивость проростков и растений огурца.
Существует метод предварительной оценки огурца на устойчивость к корневым гнилям в лабораторных условиях, основанный на проращивании семян на фильтровальной бумаге, смоченной токсином Т - 2 гриба F. oxysporum. Однако этот метод не всегда доступен в связи с трудностями производства этого токсина. Поэтому нами была изучена возможность использования в качестве селективного фактора ф.к.ж. гриба F. oxysporum при оценке устойчивости огурца к фузариозу.
В результате проведенных исследований выявлено, что при проращивании семян всех образцов на ф.к.ж. в концентрациях 50%» и 100%, рост корней был полностью ингибирован. При проращивании семян на 10%-ном ав-токлавированном ф.к.ж., наблюдалось существенное ингибирование прорастания. При этом обнаружены различия в прорастании семян разных образцов. У восприимчивой линии Л - 113 длина корней была соответственно на 40% и 48% меньше по сравнению с более устойчивыми гибридами Fj Восход и Натали
Аналогичные результаты получены и на неавтоклавированном ф.к.ж. При использовании 5 % ф.к.ж. существенных различий по степени поражения между образцами не было обнаружено. Однако выявлены различия по числу здоровых и больных проростков при использовании автоклавирован-ного и неавтоклавированного ф.к.ж. Проростки, полученные на автоклавиро-ванном ф.к.ж., были здоровыми, а на неавтоклавированном - больными. В связи с этим в дальнейших исследованиях в целях избежания дополнительной инфекции, мы использовали автоклавированный ф.к.ж. (табл. 16, приложение 7 и рис. 14).
